張尹萌，馬強(qiáng)，金學(xué)平，祝宏*（.武漢工程大學(xué)化工與制藥學(xué)院 新型反應(yīng)器與綠色化學(xué)工藝湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，武漢 430205；2.武漢軟件工程職業(yè)學(xué)院，武漢 430205；3.武漢市藥物增溶工程技術(shù)研究中心，武漢 430205）

1969年，磷霉素從鏈霉菌中分離得到，在臨床上應(yīng)用廣泛，其作用機(jī)制是通過(guò)干擾細(xì)菌細(xì)胞壁的合成，從而達(dá)到抑菌效果，對(duì)多數(shù)革蘭氏陽(yáng)性菌和革蘭氏陰性菌至今仍保持著較高的抗菌活性[1-2]。但磷霉素中的環(huán)氧基團(tuán)在強(qiáng)酸、高溫等條件下容易開環(huán)，結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定，通常以鹽的形式存在，從而獲得較高的穩(wěn)定性[3]，如磷霉素鈣及磷霉素鈉。因此，本課題組選用天然的D-氨基葡萄糖，利用拼合原理與磷霉素拼合在一起得到了磷霉素氨基葡萄糖鹽（FA），并在先前研究中對(duì)其進(jìn)行了結(jié)構(gòu)鑒定和初步活性測(cè)試[4]。

目前，市面上常用的磷霉素鈣和磷霉素鈉分別以口服和注射方式給藥，會(huì)不可避免地出現(xiàn)首過(guò)效應(yīng)和不良反應(yīng)，而在治療呼吸道感染時(shí)若直接選用安全性高的抗菌藥物經(jīng)肺給藥則能更好避免以上問(wèn)題[5]。β-環(huán)糊精（β-cyclodextrins，β-CD）是一種對(duì)人體無(wú)害，性質(zhì)穩(wěn)定且常用的藥用輔料。其內(nèi)部的疏水性結(jié)構(gòu)使其具有使包合的各種各樣的化合物進(jìn)入空腔內(nèi)的能力，通過(guò)主客體相互作用與藥物形成包合物，用以增加藥物溶解度和穩(wěn)定性，控制藥物的釋放[6-7]。為更好地解決FA中的環(huán)氧鍵在高溫下易發(fā)生開環(huán)反應(yīng)和引濕性強(qiáng)等問(wèn)題，本研究采用冷凍干燥法制備FA-β-CD包合物，并對(duì)所制備的包合物進(jìn)行表征，探究最佳包合工藝，同時(shí)對(duì)其進(jìn)行抗菌活性及穩(wěn)定性考察，為后續(xù)磷霉素類藥物肺部給藥制劑研究做準(zhǔn)備。

1 材料

1.1 儀器

MS105DU電子分析天平[梅特勒-托利多國(guó)際貿(mào)易（上海）有限公司]；DZG-303A 超純水機(jī)（上海富詩(shī)特儀器設(shè)備有限公司）；DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器（上海越眾儀器股份有限公司）；PHS-25 pH計(jì)（上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司）；ZLGJ-10冷凍干燥機(jī)（河北盈盛儀器有限公司）；WQF-510A傅里葉紅外光譜儀（安捷倫科技股份有限公司）；BrukerAXS D8 Advance X射線光電子能譜儀（德國(guó)布魯克公司）；SDH-150型恒溫恒濕箱（上海佐誠(chéng)實(shí)驗(yàn)儀器有限公司）。

1.2 試藥

FA（實(shí)驗(yàn)室自制）；β-CD、鹽酸、氫氧化鈉（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，分析純）；磷霉素鈣（武漢五景藥業(yè)有限公司，批號(hào)：20180715，純度≥98%）；其余試劑均為分析純，水為實(shí)驗(yàn)室自制純化水。

2 方法與結(jié)果

2.1 藥物含量的測(cè)定

現(xiàn)行的藥物質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)采用微生物檢定法測(cè)定磷霉素含量，操作復(fù)雜，結(jié)果易受操作者主觀影響[8]。磷霉素在大于220 nm處無(wú)紫外吸收，無(wú)法利用紫外分光光度計(jì)直接測(cè)定FA含量；HPLC-ELSD法能同時(shí)測(cè)定磷霉素及相關(guān)雜質(zhì)含量，但耐用性差，結(jié)果難以重現(xiàn)。因此，本研究參考《中國(guó)藥典》方法，通過(guò)電位滴定測(cè)定樣品溶液中磷酸基團(tuán)的含量進(jìn)而換算出藥物中磷霉素的含量[9]。

2.1.1 電位滴定測(cè)定FA含量 取一定量的FA，用0.1 mol·L-1的鹽酸溶解，加入攪拌磁子進(jìn)行電磁攪拌，用標(biāo)定過(guò)的0.1 mol·L-1氫氧化鈉溶液緩慢滴定，記錄待測(cè)液pH和電位的變化，直至出現(xiàn)第二次突躍，pH約為11.5時(shí)可停止滴定。另取空燒杯，加入10 mL 0.1 mol·L-1的鹽酸進(jìn)行空白對(duì)照滴定實(shí)驗(yàn)。通過(guò)二階微商計(jì)算突躍時(shí)消耗0.1 mol·L-1氫氧化鈉溶液體積，并根據(jù)以下公式計(jì)算FA含藥量。

W＝（V-V1）×C×M×10-3/2m×100%

式中，V為滴定FA時(shí)消耗氫氧化鈉溶液的體積（mL），V1為空白試驗(yàn)中消耗氫氧化鈉溶液的體積（mL），C為氫氧化鈉標(biāo)定后的濃度（mol·L-1），m為稱取FA的量（g），M為磷霉素的相對(duì)分子質(zhì)量138.06 g·mol-1。

2.1.2 包合物包合率和收率測(cè)定 取包合物0.1 g，按“2.1.1”項(xiàng)下方法進(jìn)行電位滴定計(jì)算包合率，另采用稱重法計(jì)算收率，計(jì)算公式如下所示。

收率（%）＝（所得的包合物的質(zhì)量）/（FA和β-CD總質(zhì)量）×100%

包合率（%）＝（包合物中的含藥量）/（FA中的含藥量）×100%

2.2 FA-β-CD包合物的制備

經(jīng)過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)，選用β-CD作為FA的包合材料，采用冷凍干燥法制備包合物。取β-CD 1 g，溶解于適量純化水中，在30℃下恒溫?cái)嚢? h，配制成β-CD飽和溶液。待溶液澄清后加入1 g FA，繼續(xù)在該溫度下攪拌包合1 h，待冷卻至室溫后，放入冰箱預(yù)凍24 h，再進(jìn)行冷凍干燥除水，得FA-β-CD包合物。另外，按照質(zhì)量比1∶1，分別稱取適量的β-CD和FA，置于研缽中研磨混勻，制備FA和β-CD物理混合物。

2.3 包合物制備的工藝優(yōu)化

2.3.1 質(zhì)量比對(duì)包合率和收率的影響 一般來(lái)說(shuō)，在包合物制備過(guò)程中，主客體分子比例越高，β-CD所提供的分子腔數(shù)量也就越多，藥物分子也更容易進(jìn)入空腔被包合[10]。根據(jù)“2.2”項(xiàng)下方法制備，保持水浴溫度為30℃、包合時(shí)間為1 h不變，考察m（β-CD）∶m（FA）＝0.75∶1、1∶1、1.25∶1、1.5∶1、1.75∶1對(duì)FA的包合率和收率的影響。結(jié)果如圖1所示，以冷凍干燥法制備FA-β-CD包合物時(shí)，包合率隨著主客體質(zhì)量比的增加呈現(xiàn)先升后降的趨勢(shì)。當(dāng)主客體質(zhì)量比為0.75∶1時(shí)，主分子β-CD提供的空腔不足以讓客分子FA充分進(jìn)入；當(dāng)m（β-CD）∶m（FA）為1.25∶1時(shí)，包合率最高，達(dá)到89.44%；此后繼續(xù)增加β-CD的用量也無(wú)法提高FA的包合率。由圖1還可得知，F(xiàn)A-β-CD包合物的收率受主客比影響不大，但隨著主客比的增大，β-CD用量增加，在影響包合率的同時(shí)，成本也增加。因此，m（β-CD）∶m（FA）＝1.25∶1為最佳質(zhì)量比。

圖1 m（β-CD）∶m（FA）對(duì)包合率和收率的影響Fig 1 Influence of m（β-CD）∶m（FA）on the inclusion rate and yield

2.3.2 包合時(shí)間對(duì)包合率和收率的影響 在m（β-CD）∶m（FA）為1.25∶1，包合溫度為30℃的條件下，考察包合時(shí)間1、2、3、4、5 h時(shí)對(duì)FA的包合率和收率的影響。結(jié)果如圖2所示。隨著包合時(shí)間的延長(zhǎng)，F(xiàn)A的包合率和收率均呈現(xiàn)先升后降的趨勢(shì)，當(dāng)包合時(shí)間為2 h時(shí)，β-CD對(duì)FA的包合率和收率達(dá)到最高，分別為92.30%和89.34%；繼續(xù)增加包合時(shí)間，包合率和收率不增反降，這可能是因?yàn)楫?dāng)包合時(shí)間達(dá)到2 h，F(xiàn)A進(jìn)入β-CD空腔的速度與從空腔中脫離的速度達(dá)到平衡，因此，繼續(xù)增加包合時(shí)間，包合率也無(wú)法上升。而且，隨著包合時(shí)間的延長(zhǎng)，研究的時(shí)間成本增加，最后選擇2 h為最佳包合時(shí)間。

圖2 包合時(shí)間對(duì)包合率和收率的影響Fig 2 Influence of inclusion time on the inclusion rate and yield

2.3.3 包合溫度對(duì)包合率和收率的影響 溫度也影響著包合效果，在m（β-CD）∶m（FA）為1.25∶1，包合時(shí)間為2 h時(shí)，考察包合溫度在20、25、30、35、40℃時(shí)對(duì)FA的包合率及收率的影響。由圖3可知，隨著包合溫度升高，F(xiàn)A的包合率逐漸降低，當(dāng)包合溫度為20℃時(shí)包合率最大，為90.35%。

圖3 包合溫度對(duì)包合率和收率的影響Fig 3 Influence of inclusion temperature on the inclusion rate and yield

因此，F(xiàn)A-β-CD包合物的最佳制備工藝為m（β-CD）∶m（FA）＝1.25∶1，包合時(shí)間為2 h，包合溫度為20℃。

2.4 包合物的鑒定

FA經(jīng)過(guò)β-CD包合后，需要對(duì)得到的包合物進(jìn)行鑒定，常用的鑒定方法有以下幾種：電鏡法、紅外光譜法（IR）、X射線衍射法（XRD）以及薄層色譜法（TLC）等[11]。本實(shí)驗(yàn)運(yùn)用IR和XRD兩種方法對(duì)FA-β-CD包合物進(jìn)行鑒定。

2.4.1 IR 本研究使用傅里葉變換紅外光譜儀，采用溴化鉀壓片制樣，分別測(cè)定β-CD、FA、FAβ-CD包合物及FA和β-CD的1∶1物理混合物的紅外光譜。結(jié)果見(jiàn)圖4，F(xiàn)A的紅外光譜在3300 cm-1左右出現(xiàn)分子間氫鍵O-H伸縮振動(dòng)，屬于氨基葡萄糖分子上的羥基締合形成的寬吸收峰，在與磷霉素反應(yīng)生成FA后，在1600 cm-1到1750 cm-1處出現(xiàn)多個(gè)N-H的特征吸收峰。FA-β-CD包合物的紅外圖譜與β-CD的紅外圖譜相似，在1600～1750 cm-1是一個(gè)寬峰，這是與FA及兩者的物理混合物是明顯能區(qū)別開的，初步說(shuō)明FA成功包合進(jìn)入β-CD的空腔內(nèi)。

圖4 樣品的 IR 圖譜Fig 4 Infrared spectroscopy pattern of the samples

2.4.2 粉末XRD 分別將FA、β-CD、FA和β-CD的1∶1物理混合物以及FA-β-CD包合物這4種樣品進(jìn)行粉末XRD分析，掃描速度為2θ，角度為5°到50°。從圖5掃描結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)A的粉末衍射圖有清晰且尖銳的晶體衍射峰，說(shuō)明其具有明顯的晶體結(jié)構(gòu)。而β-CD幾乎沒(méi)有峰，說(shuō)明其為無(wú)定型粉末。兩者的物理混合物中幾乎所有的特征峰都存在，而FA-β-CD包合物的晶體衍射峰明顯減弱，表明粉末失去晶體結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變?yōu)闊o(wú)定型狀態(tài)，證明FA-β-CD包合物包合成功。

圖5 樣品的粉末 XRD 圖譜Fig 5 X-ray powder diffraction pattern of the samples

2.5 抑菌活性實(shí)驗(yàn)

2.5.1 主要試劑配制 分別稱取適量磷霉素鈣、FA、FA-β-CD包合物，加純化水溶解配成實(shí)際含磷霉素1 mg·mL-1的溶液；另配制相同濃度不含藥的β-CD溶液。

2.5.2 菌懸液的制備 用接種環(huán)分別從耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA）、銅綠假單胞菌（Pae）、鮑曼不動(dòng)桿菌（Ab）中挑取菌落，接種于200 mL液體培養(yǎng)基中，將培養(yǎng)基置于恒溫振蕩器中，在37℃、120 r·min-1的條件下培養(yǎng)18～20 h，備用。

2.5.3 微量肉湯稀釋法測(cè)定MIC取各溶液和液體培養(yǎng)基各100 μL混勻，依次倍比稀釋置于96孔板中，在每個(gè)孔加入80 μL液體培養(yǎng)基及20μL菌懸液，使待測(cè)液質(zhì)量濃度梯度依次為500、250、125、62.5、31.3、15.6、7.8、3.9 μg·mL-1；在其后一孔加入共180 μL液體培養(yǎng)基和20 μL菌液，最后一孔加入200 μL液體培養(yǎng)基作為對(duì)照，在37℃恒溫箱培養(yǎng)24 h，測(cè)量藥品對(duì)3種細(xì)菌（MRSA、Pae、Ab）的MIC值。平行重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次，結(jié)果如表1所示，β-CD完全沒(méi)有抗菌活性，對(duì)測(cè)試結(jié)果不會(huì)產(chǎn)生干擾。相比于MRSA和Pae，Ab具有更強(qiáng)的耐藥性。各樣品對(duì)MRSA、Ab的作用效果表現(xiàn)一致，對(duì)Pae的抗菌活性表現(xiàn)為FA-β-CD包合物弱于FA，F(xiàn)A弱于磷霉素鈣，推測(cè)β-CD包合FA后可能對(duì)藥物釋放有所影響，另外可能需要進(jìn)一步優(yōu)化FA的拼合工藝使其藥效發(fā)揮更加穩(wěn)定。但從整體上來(lái)看，F(xiàn)A及其包合物的抗菌活性與磷霉素鈣相比并無(wú)太大差異，對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌和革蘭氏陰性菌都能展示出較好的抑菌效果。

表1 抗菌活性測(cè)試結(jié)果(MIC，μg·mL-1)Tab 1 Antibacterial activity test (MIC，μg·mL-1)

2.6 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

FA容易吸潮，不易儲(chǔ)存，以表2中所列指標(biāo)考察樣品穩(wěn)定性。分別將FA和FA-β-CD包合物用生理鹽水配制成磷霉素濃度相同的溶液，再與FA和FA-β-CD包合物固體樣品一起放置于40℃恒溫恒濕箱中，做遮光處理。于第5日檢查溶液的顏色、氣味、pH值變化以及固體樣品的增重情況。結(jié)果如表2所示，在40℃避光的條件下，F(xiàn)A增重明顯，其溶液的顏色、氣味以及pH變化也較大；而FA-β-CD的重量及其溶液的顏色和氣味變化均較小。因此，經(jīng)過(guò)β-CD包合后的FA更加穩(wěn)定，尤其是其強(qiáng)引濕性得到了很好的改善。另外，按“2.5.3”項(xiàng)下方法，利用Pae對(duì)FA-β-CD包合物溶液進(jìn)行活性測(cè)試，在8 h內(nèi)其抗菌效果未減弱，這對(duì)于現(xiàn)配現(xiàn)用的溶液來(lái)說(shuō)，可滿足穩(wěn)定性要求。

表2 FA及FA-β-CD包合物的穩(wěn)定性Tab 2 Stability of FA and FA-β-CD inclusion complex

3 討論

3.1 FA-β-CD包合物制備工藝優(yōu)化

本實(shí)驗(yàn)以β-CD作為載體，采用冷凍干燥法制備了FA-β-CD包合物。包合物的形成需要一定的時(shí)間，主客體質(zhì)量比和包合溫度會(huì)影響最終包合效果。在包合過(guò)程中，F(xiàn)A借助外力逐漸進(jìn)入到β-CD空腔中，兩者分子間相互作用，β-CD的量不足時(shí)會(huì)導(dǎo)致FA包合不全，過(guò)多時(shí)又會(huì)因其濃度過(guò)高反而阻礙FA進(jìn)入空腔。只有在合適溫度下，主客比適量，包合達(dá)平衡時(shí)才能取得最佳包合效果。因此，本研究以包合率和收率為指標(biāo)，通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)篩選出了最佳的制備工藝，即m（β-CD）∶m（FA）為1.25∶1，包合時(shí)間為2 h，包合溫度為20℃。

3.2 FA-β-CD包合物的鑒定

藥物的分子結(jié)構(gòu)決定著其紅外區(qū)的吸收特征，采用β-CD對(duì)FA包合后，可根據(jù)FA紅外吸收峰的位移以及吸收峰的減弱或消失來(lái)判斷包合效果[12]。另外，X-射線衍射性質(zhì)也會(huì)隨著結(jié)晶性藥物被包合后的結(jié)晶度的改變而發(fā)生一些變化，結(jié)晶度高的藥物通常會(huì)有較強(qiáng)的衍射特征峰，而經(jīng)過(guò)β-CD包合后，樣品結(jié)晶程度會(huì)下降或者消失，在X-射線衍射圖譜上則表現(xiàn)為原有的特征吸收峰消失或減弱。因此，本文通過(guò)紅外光譜分析和X-射線衍射對(duì)樣品進(jìn)行表征，證實(shí)了FA-β-CD包合物的形成。

3.3 FA-β-CD包合物的抗菌活性和穩(wěn)定性

經(jīng)抗菌活性測(cè)試發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)A及FA-β-CD包合物對(duì)Pae的抗菌效果弱于對(duì)照品磷霉素鈣。可能是β-CD包合FA后會(huì)對(duì)藥物釋放產(chǎn)生影響，另外，也需要進(jìn)一步優(yōu)化FA的拼合工藝使其藥效發(fā)揮更加穩(wěn)定。但從整體結(jié)果來(lái)看，F(xiàn)A及FA-β-CD包合物均能有效對(duì)抗革蘭氏陽(yáng)性菌和革蘭氏陰性菌。而且，經(jīng)過(guò)穩(wěn)定性觀察發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)A-β-CD包合物幾乎不吸潮。因此，本次研究證明了β-CD是合適FA的包封材料，采用冷凍干燥法制備FA-β-CD包合物時(shí)不會(huì)明顯影響FA的抗菌活性，且能明顯改善FA的強(qiáng)引濕性，有利于藥品的儲(chǔ)存和應(yīng)用。這也為后續(xù)進(jìn)一步的制劑研究提供了一定參考。