高長(zhǎng)久，盧芳，柳長(zhǎng)鳳，于棟華，丁崧，劉樹民*（. 黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)研究生院，哈爾濱 50040；.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)藥研究院，哈爾濱 50040）

格雷夫斯病（Graves disease，GD）是一種發(fā)生于甲狀腺的自身免疫性疾病，以促甲狀腺激素（TSH）受體刺激抗體（TRAb）的發(fā)現(xiàn)為特征，主要表現(xiàn)為彌漫性甲狀腺腫、甲狀腺毒癥和眼病。在所有甲狀腺功能亢進(jìn)（以下簡(jiǎn)稱甲亢）患者中，有80%左右的病例被診斷出患有GD。當(dāng)前，治療GD主要有放射性碘、抗甲狀腺藥物和甲狀腺切除術(shù)三種方式[1-2]，但這些方式存在復(fù)發(fā)率高、易伴發(fā)甲狀腺功能減退等問題[3]。

MicroRNA（miRNA）是內(nèi)源性、單鏈的非編碼微小RNA，長(zhǎng)度一般為19～25個(gè)核苷酸。miRNA可以通過抑制mRNA翻譯或促進(jìn)靶RNA降解來下調(diào)編碼蛋白基因的表達(dá)[4]，廣泛參與炎性介質(zhì)的釋放、免疫反應(yīng)的調(diào)控、血管的形成等諸多重要生物學(xué)事件[5]。近年來，越來越多的研究表明miRNA在GD的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用[6-8]。

GD屬于中醫(yī)“癭病”范疇，初期多為氣機(jī)郁滯，繼而津凝痰聚，痰氣搏結(jié)頸前；進(jìn)而肝氣郁結(jié)，日久化火，火熱內(nèi)盛，耗氣傷陰，導(dǎo)致氣陰兩虛之候[9]?；谏鲜稣J(rèn)識(shí)，劉樹民教授通過多年臨床經(jīng)驗(yàn)總結(jié)并創(chuàng)建了補(bǔ)氣滋陰、清肝降火、化痰散結(jié)之驗(yàn)方——芪玄抑甲寧，廣泛應(yīng)用于臨床，并取得了良好的療效。前期藥效學(xué)研究已證實(shí)芪玄抑甲寧對(duì)GD有顯著改善作用，本研究旨在通過miRNA測(cè)序技術(shù)，從表觀遺傳學(xué)角度探索其在GD模型小鼠甲狀腺組織中的作用靶點(diǎn)及改善GD甲亢的作用機(jī)制。

1 材料

1.1 試藥

芪玄抑甲寧組方五味中藥黃芪-玄參-牡蠣-浙貝母-夏枯草配伍比例為3∶2∶2∶2∶1（黑龍江修生堂藥業(yè)有限公司，批號(hào)分別為20190401、20190401、20200601、20191101、20190701），經(jīng)黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院中藥資源與開發(fā)教研室王振月教授鑒定為正品飲片，符合2020年版《中國藥典》飲片性狀規(guī)定，按照最優(yōu)工藝進(jìn)行提取[10]，制備成凍干粉；甲巰咪唑片（Merck KGaA，批號(hào)：C10002097）。

Ad-TSHR289重組腺病毒（賽業(yè)生物科技有限公司，滴度3.13×1011PFU·mL-1）；小鼠三碘甲腺原氨酸（T3）、甲狀腺素（T4）、促甲狀腺激素（TSH）ELISA試劑盒（江蘇晶美生物科技有限公司，批號(hào)分別為202112、202112、202201）；VAHTSTM Small RNA Library Prep Kit for Illumina、VAHTSTM DNA Clean Beads試劑盒（南京諾唯贊生物科技股份有限公司，批號(hào)分別為NR801-02、N411-03）；TransScriptⅡ All-in-One First-Strand cDNA Synthesis SuperMix for Qpcr/One-Step gDNA Removal、TransStart Top Green qPCR SuperMix試劑盒（北京全式金生物技術(shù)股份有限公司，批號(hào)分別為AH341、AQ131）。

1.2 儀器

Eclipse E100正置光學(xué)顯微鏡（日本Nikon公司）；M200pro型酶標(biāo)儀、Nanodrop 2000超微量紫外分光光度計(jì)（美國Thermo公司）；NovaSeq 6000測(cè)序儀（美國Illumina公司）；LabChip GX大分子分析儀（美國PerkinElmer公司）；CFX96 qRT-PCR儀（美國Bio-Rad公司）。

1.3 動(dòng)物

6周齡SPF級(jí)雌性BALB/c小鼠，體質(zhì)量18～22 g [北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，許可證號(hào)SCXK（京）2021-0006]。小鼠在溫度20～24℃、濕度40%～50%條件下適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，自由進(jìn)食飲水。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)在黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)藥研究院完成，動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK（黑）2018-007。本研究經(jīng)黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利與倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（批準(zhǔn)文號(hào)：2021030605）。

2 方法

2.1 動(dòng)物模型的制備與分組給藥

促甲狀腺激素受體（TSHR）是具有7個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)的G蛋白偶聯(lián)受體，包括A（細(xì)胞表面）、B（跨膜）兩個(gè)亞單位，A亞單位主要參與促甲狀腺激素（TSH）受體特異性刺激性自身抗體（TRAb）結(jié)合。通過構(gòu)建TSHR-A亞單位的腺病毒（Ad-TSHR289）可成功誘導(dǎo)GD動(dòng)物模型。在眾多造模方法中，雌性BALB/c小鼠通過Ad-TSHR289重組腺病毒免疫誘導(dǎo)所建立的GD模型，與人GD的發(fā)生機(jī)制類似，成模率最高（可達(dá)86%），且具有高度可重復(fù)性，此動(dòng)物模型現(xiàn)被廣泛應(yīng)用[11]。前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，芪玄抑甲寧各劑量組對(duì)GD模型小鼠的外觀行為、甲狀腺組織病理形態(tài)具有改善作用，并對(duì)血清中T4、TRAb有回調(diào)作用，且高劑量組最顯著[12]，故本研究以前期實(shí)驗(yàn)的高劑量組作為給藥組。

取雌性BALB/c小鼠50只，隨機(jī)分為對(duì)照組（10只）、造模組（40只）。造模組應(yīng)用經(jīng)PBS稀釋的重組腺病毒（Ad-TSHR289）于小鼠脛前肌內(nèi)注射免疫造模，每次免疫劑量為1.878×109PFU/60 μL，對(duì)照組給予等劑量的PBS，于第1、4、7周共免疫3次。第10周將檢測(cè)造模成功的小鼠分為模型組、甲巰咪唑組、芪玄抑甲寧組，每組8只。芪玄抑甲寧組灌胃芪玄抑甲寧50 g生藥/（kg·d）（質(zhì)量濃度2.5 g 生藥·mL-1，20 mL·kg-1），甲巰咪唑組灌胃甲巰咪唑片3.75 mg/（kg·d），對(duì)照組、模型組灌胃給予20 mL/（kg·d）的飲用水，連續(xù)4周。

2.2 芪玄抑甲寧對(duì)GD小鼠甲狀腺功能的影響

給藥前和給藥4周后，將各組小鼠腹腔注射0.3%戊巴比妥鈉（40 mg·kg-1）麻醉，于小鼠頜下靜脈叢采靜脈血，離心取上清，ELISA法檢測(cè)小鼠血清中T3、T4和TSH水平，具體操作按試劑盒說明書進(jìn)行，并經(jīng)酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm波長(zhǎng)時(shí)的光密度值，比較各組間的差異并分析。

2.3 芪玄抑甲寧對(duì)GD小鼠甲狀腺組織病理形態(tài)的影響

給藥結(jié)束后，頸椎脫位法處死小鼠，取甲狀腺組織，用4%多聚甲醛固定，經(jīng)石蠟包埋切片，脫蠟至水，蘇木素和伊紅染色，脫水，中性樹膠封片后，在正置光學(xué)顯微鏡下觀察和拍照。

2.4 各組小鼠甲狀腺組織差異表達(dá)miRNA的分析

2.4.1 甲狀腺組織RNA的提取與檢測(cè) 從對(duì)照組、模型組和芪玄抑甲寧組每組隨機(jī)選取6只小鼠的甲狀腺組織，使用TRIzol法提取組織樣本的總RNA，使用生物大分子分析儀LabChip GX對(duì)RNA的完整性進(jìn)行檢測(cè)，使用超微量紫外分光光度計(jì)Nanodrop2000對(duì)RNA進(jìn)行濃度檢測(cè)。

2.4.2 文庫構(gòu)建與高通量測(cè)序 使用VAHTSTM Small RNA Library Prep Kit for Illumina構(gòu)建單端測(cè)序文庫，通過VAHTSTM DNA Clean Beads純化產(chǎn)物合成cDNA文庫，生成的文庫通過Qsep400方法進(jìn)行質(zhì)檢，在NovaSeq 6000平臺(tái)上進(jìn)行測(cè)序。

2.4.3 基因鑒定與表達(dá)分析 將每個(gè)具有miRNA序列的樣品讀長(zhǎng)與已有miRNA數(shù)據(jù)庫和新miRNA的預(yù)測(cè)結(jié)果進(jìn)行比較，對(duì)各樣本中miRNA進(jìn)行表達(dá)量分析，并使用TPM算法對(duì)表達(dá)量進(jìn)行歸一化。以差異倍數(shù)（Fold Change，F(xiàn)C）＞1.5 或＜0.67，P＜0.05作為篩選標(biāo)準(zhǔn)，使用edgeR軟件進(jìn)行差異表達(dá)分析，獲得兩組樣本之間的差異表達(dá)miRNA。

2.5 差異表達(dá)miRNA的qRT-PCR驗(yàn)證

選擇miR-128-3p、miR-144-3p、miR-363-3p、miR-215-5p、miR-30a-5p這5個(gè)差異表達(dá)miRNA進(jìn)行qRT-PCR驗(yàn)證。取各組小鼠甲狀腺組織miRNA，使用TransScript Ⅱ All-in-One First-Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR（One-Step gDNA Removal）反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄成cDNA。根據(jù)TransStart Top Green qPCR SuperMix試劑盒說明書進(jìn)行qRT-PCR分析。結(jié)果以差異倍數(shù)（FC）進(jìn)行表示并繪制柱狀圖。引物序列見表1。

表1 miRNA引物序列Tab 1 miRNA primer sequences

2.6 差異表達(dá)miRNA靶基因的預(yù)測(cè)與網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

將差異表達(dá)的miRNA通過miRDB（http：//mirdb.org）、TargetScan（https：//www.targetscan.org）、Starbase（https：//starbase.sysu.edu.cn）3個(gè)數(shù)據(jù)庫預(yù)測(cè)靶基因并取交集，獲得差異表達(dá)miRNA的靶基因。運(yùn)用Cytoscape 3.8.2軟件構(gòu)建“差異表達(dá)miRNA-靶基因”網(wǎng)絡(luò)圖。

2.7 miRNA靶基因的GO功能富集分析和KEGG通路富集分析

通過Metascape數(shù)據(jù)庫（https：//metascape.org）對(duì)差異表達(dá)miRNA的靶基因進(jìn)行富集分析，包括基因本體（GO）功能富集分析和京都基因與基因組百科全書（KEGG）通路富集分析。

2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

甲功三項(xiàng)（TSH、T3、T4）結(jié)果采用IBM SPSS Statistics 24軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，數(shù)據(jù)以（x±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，組內(nèi)治療前后比較采用配對(duì)樣本t檢驗(yàn)；差異表達(dá)miRNA的qRT-PCR和miRNA測(cè)序結(jié)果數(shù)據(jù)比較分析采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，應(yīng)用GraphPad Prism 7軟件進(jìn)行分組柱狀圖的繪制。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 芪玄抑甲寧對(duì)GD小鼠甲狀腺功能的影響

給藥前與對(duì)照組比較，模型組小鼠T3、T4顯著升高（P＜0.01），TSH顯著降低（P＜0.01）。給藥4周后，與模型組比較，芪玄抑甲寧組小鼠T3、T4降低（P＜0.05，P＜0.01），TSH升高（P＜0.05）；與給藥前比較，芪玄抑甲寧組T3、T4降低（P＜0.05，P＜0.01），TSH升高（P＜0.01）（見表2）。

表2 芪玄抑甲寧對(duì)GD小鼠甲狀腺功能的影響(x±s，n＝8)Tab 2 Effect of Qixuan Yijianing on the thyroid function in GD mice ( ±s，n＝8)

表2 芪玄抑甲寧對(duì)GD小鼠甲狀腺功能的影響(x±s，n＝8)Tab 2 Effect of Qixuan Yijianing on the thyroid function in GD mice ( ±s，n＝8)

注：與同組給藥前比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與同時(shí)間對(duì)照組比較，##P＜0.01；與同時(shí)間模型組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01.Note：Compared with the same group before the administration，*P＜0.05，**P＜0.01；compared with the control group at the same time，##P＜0.01；compared with the model group at the same time，△P＜0.05，△△P＜0.01.

組別甲功三項(xiàng)給藥前給藥后對(duì)照組TSH/（mU·L-1）12.93±1.2412.62±1.25 T3/（ng·mL-1）2.79±0.312.81±0.20 T4/（ng·mL-1）61.64±5.4660.21±5.67模型組TSH/（mU·L-1）10.58±0.75##10.99±0.78##T3/（ng·mL-1）3.91±0.39##4.06±0.38##T4/（ng·mL-1）87.04±9.38##85.42±10.29##甲巰咪唑組TSH/（mU·L-1）10.59±0.95##12.57±1.00** △△T3/（ng·mL-1）4.03±0.38##3.05±0.37**△△T4/（ng·mL-1）90.34±7.63##64.70±5.20**△△芪玄抑甲寧組TSH/（mU·L-1）10.79±0.95##12.38±1.13**△T3/（ng·mL-1）4.06±0.17##3.63±0.39*△T4/（ng·mL-1）91.20±5.01##67.14±5.08**△△

3.2 芪玄抑甲寧對(duì)GD小鼠甲狀腺組織病理形態(tài)的影響

對(duì)照組甲狀腺組織中的濾泡大小形狀相對(duì)比較均一，濾泡細(xì)胞排列較為疏松，甲狀腺上皮細(xì)胞呈橢圓狀、無增生，濾泡中膠質(zhì)含量較豐富。模型組甲狀腺組織中的濾泡細(xì)胞大小不一，增生肥大，呈立方狀或高柱狀，部分濾泡腔中膠質(zhì)缺失，存在空泡情況等病理特征。與模型組相比，芪玄抑甲寧組甲狀腺組織病理形態(tài)有一定的恢復(fù)，與對(duì)照組較為接近（見圖1）。

圖1 芪玄抑甲寧對(duì)GD小鼠甲狀腺組織病理形態(tài)的影響（HE染色，×400）Fig 1 Effect of Qixuan Yijianing on the pathological morphology of thyroid in GD mice（HE staining，×400）

3.3 三組小鼠甲狀腺組織差異表達(dá)miRNA

與對(duì)照組比較，模型組共篩選出171個(gè)差異表達(dá)的miRNA，其中99個(gè)miRNA下調(diào)、72個(gè)miRNA上調(diào)，差異最大的miRNA為miR-18b-5p；與模型組比較，芪玄抑甲寧組共篩選出127個(gè)差異表達(dá)的miRNA，其中61個(gè)miRNA下調(diào)、66個(gè)miRNA上調(diào)，差異最大的miRNA為miR-1197-3p。其中miR-128-3p、miR-144-3p和miR-363-3p在模型組表達(dá)下調(diào)，而在芪玄抑甲寧組表達(dá)上調(diào)（見圖2和表3）。

圖2 甲狀腺組織差異表達(dá)miRNA的火山圖Fig 2 Volcano plot of differentially expressed miRNAs in the thyroid tissue

表3 各組小鼠甲狀腺組織差異表達(dá)的miRNATab 3 Differentially expressed miRNAs in the thyroid tissue of mice in each group

3.4 差異表達(dá)miRNA的qRT-PCR驗(yàn)證

三組小鼠甲狀腺組織miR-128-3p、miR-144-3p、miR-363-3p、miR-215-5p和miR-30a-5p mRNA相對(duì)表達(dá)量與miRNA測(cè)序結(jié)果基本一致（見圖3）。

圖3 差異表達(dá)miRNA的qRT-PCR驗(yàn)證Fig 3 qRT-PCR validation of differentially expressed miRNAs

3.5 差異表達(dá)miRNA與靶基因網(wǎng)絡(luò)圖

構(gòu)建了模型組與對(duì)照組、芪玄抑甲寧組與模型組“差異表達(dá)miRNA與靶基因”的網(wǎng)絡(luò)圖（見圖4），以確定miRNA-mRNA間的功能性相互作用，為探討芪玄抑甲寧改善GD甲亢的作用機(jī)制提供依據(jù)。

圖4 差異表達(dá)miRNA-靶基因網(wǎng)絡(luò)圖Fig 4 Differentially expressed miRNA-target genes network diagram

3.6 差異表達(dá)miRNA靶基因的功能分析

GO功能分析包括生物過程（biological process，BP）、細(xì)胞組分（cellular component，CC）和分子功能（molecular function，MF）3個(gè)部分。模型組與對(duì)照組比較，差異表達(dá)miRNA的靶基因主要富集在管形態(tài)發(fā)生、激酶活性的調(diào)節(jié)、蛋白質(zhì)絲氨酸/蘇氨酸激酶活性的調(diào)節(jié)、脈管系統(tǒng)發(fā)育、染色質(zhì)、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)復(fù)合物、mRNA結(jié)合、染色質(zhì)結(jié)合、DNA轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合等條目。芪玄抑甲寧組與模型組相比，差異表達(dá)miRNA的靶基因主要富集在對(duì)生長(zhǎng)因子的反應(yīng)、細(xì)胞對(duì)生長(zhǎng)因子刺激的反應(yīng)、染色質(zhì)、神經(jīng)元細(xì)胞體、軸突、突觸后膜的內(nèi)在成分、轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、染色質(zhì)結(jié)合、DNA轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合等條目（見圖5）。

圖5 差異表達(dá)miRNA靶基因的GO功能富集分析（前10）Fig 5 GO functional enrichment analysis of differentially expressed miRNA target genes（top 10）

KEGG富集分析結(jié)果顯示，模型組與對(duì)照組比較，差異表達(dá)miRNA的靶基因主要富集在絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）、人叉頭框蛋白O（FoxO）、磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B（PI3K/Akt）、神經(jīng)營養(yǎng)因子、T細(xì)胞受體、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）等信號(hào)通路。芪玄抑甲寧組與模型組比較，差異表達(dá)miRNA的靶基因主要富集在FoxO、MAPK、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β（TGF-β）、Notch、生長(zhǎng)激素的合成、分泌和作用、T細(xì)胞受體等信號(hào)通路（見圖6）。

圖6 差異表達(dá)miRNA靶基因的KEGG通路富集分析（前30）Fig 6 KEGG pathway enrichment analysis of differentially expressed miRNA target genes（top 30）

4 討論

GD由于TRAb過度刺激甲狀腺細(xì)胞而導(dǎo)致甲亢，出現(xiàn)心悸、出汗、進(jìn)食和便次增多及體重減輕等癥狀[13]。本課題組前期研究結(jié)果表明，芪玄抑甲寧各劑量組能顯著降低尾靜脈注射小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌免疫甲亢大鼠模型血清中T3、T4的水平并提高TSH的水平，可明顯改善甲亢大鼠的外觀行為、體質(zhì)量、甲狀腺組織病理樣變化，可顯著降低血清中白細(xì)胞介素-17（IL-17）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）和TGF-β的水平，回調(diào)甲亢大鼠甲狀腺組織中IL-17、IL-17R的mRNA和蛋白表達(dá)水平[14-15]；對(duì)脛前肌內(nèi)注射重組腺病毒（Ad-TSHR289）免疫的GD小鼠模型的外觀行為、甲狀腺組織病理形態(tài)具有改善作用，并對(duì)血清中對(duì)T4、TRAb有回調(diào)作用[12]。GD患者的甲狀腺組織中有miRNA異常表達(dá)的現(xiàn)象，本研究利用miRNA高通量測(cè)序技術(shù)，從表觀遺傳學(xué)角度探討GD的可能發(fā)病機(jī)制及芪玄抑甲寧治療GD的作用機(jī)制。

miRNA測(cè)序結(jié)果發(fā)現(xiàn)，模型組與對(duì)照組比較，171個(gè)miRNA存在差異表達(dá)情況，其中99個(gè)表達(dá)下調(diào)、72個(gè)表達(dá)上調(diào)，并且miR-363-3p、miR-128-3p和miR-144-3p表達(dá)在miRNA測(cè)序和qRT-PCR驗(yàn)證中均下調(diào)。T輔助細(xì)胞17（Th17）介導(dǎo)的炎癥與多種自身免疫性疾病相關(guān)，miR-363-3p可以結(jié)合到活化T細(xì)胞核因子5（Nfat5）和維A酸相關(guān)孤核受體a（Rora）的3’-UTR上；使體外小鼠原代CD4+淋巴細(xì)胞中miR-363-3p下調(diào)，能提高Rora、IL-17a和IL-17f的表達(dá)，并增加Th17的分化和IL-17的分泌[16]。miR-128-3p的表達(dá)下調(diào)，其靶基因Wnt1誘導(dǎo)信號(hào)通路蛋白1（WISP1）上調(diào)，可激活PI3K/Akt信號(hào)通路，抑制軟骨細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、軟骨細(xì)胞基質(zhì)降解和促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生[17]；GD甲狀腺新血管生的增加，可使甲狀腺體積增大，甲狀腺激素合成和釋放增多，miR-128-3p的表達(dá)下調(diào)，其靶基因VEGFC上調(diào)，從而促進(jìn)血管生成[18]。GD患者血漿中循環(huán)miR-144-3p的表達(dá)顯著降低，可作為GD的潛在生物標(biāo)志物，但其在GD中的作用機(jī)制尚不明確[7]；有研究表明miR-144-3p在多種腫瘤組織中下調(diào)，與血管生成密切相關(guān)[19]。本研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)芪玄抑甲寧干預(yù)后，GD模型小鼠miR-363-3p、miR-128-3p和miR-144-3p表達(dá)水平均顯著上調(diào)，提示其可能為芪玄抑甲寧改善GD甲亢癥狀的作用靶點(diǎn)。

GO富集分析結(jié)果顯示，與GD甲亢相關(guān)條目主要集中在對(duì)生長(zhǎng)因子的反應(yīng)、細(xì)胞對(duì)生長(zhǎng)因子刺激的反應(yīng)、染色質(zhì)、神經(jīng)元細(xì)胞體、細(xì)胞質(zhì)核周區(qū)、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)復(fù)合物、轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、染色質(zhì)結(jié)合、DNA轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、RNA聚合酶Ⅱ結(jié)合等方面，提示由于GD引起甲狀腺激素合成和釋放的增加，使染色質(zhì)、細(xì)胞質(zhì)和神經(jīng)元細(xì)胞等成分變化，影響機(jī)體DNA、轉(zhuǎn)錄因子、RNA聚合酶Ⅱ結(jié)合等轉(zhuǎn)錄過程，導(dǎo)致機(jī)體生長(zhǎng)發(fā)育和神經(jīng)系統(tǒng)異常。KEGG通路分析顯示，模型組差異表達(dá)miRNA的靶基因主要富集于MAPK、FoxO、PI3K/Akt、T細(xì)胞受體、TGF-β、VEGF、甲狀腺激素信號(hào)通路等。甲狀腺是高度血管化的內(nèi)分泌器官，在GD的發(fā)病過程中血管過度生成，使甲狀腺血流增加，導(dǎo)致甲狀腺體積增大、甲狀腺激素水平增高[20]。VEGFA是血管生成的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，它通過與包括血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體2（VEGFR2）在內(nèi)的受體結(jié)合發(fā)揮作用，并且VEGF和VEGFR2多態(tài)性與GD難治性相關(guān)，VEGFA在GD伴格雷夫斯眼?。℅O）患者的甲狀腺和眼眶脂肪組織中顯著上調(diào)，并能觀察到血管過度生成[21]，較高的VEGFA水平可能會(huì)增加GD患者甲狀腺血管生成并導(dǎo)致甲狀腺腫大[22]。FOXO1主要與調(diào)節(jié)VEGFA表達(dá)并促進(jìn)血管生成有關(guān)[23]。綜合芪玄抑甲寧組差異表達(dá)miRNA靶基因的KEGG通路富集分析結(jié)果[24]，推測(cè)芪玄抑甲寧可能通過調(diào)節(jié)差異miRNA的表達(dá)，調(diào)控上述相關(guān)信號(hào)通路，從而發(fā)揮減輕GD甲亢和眼病癥狀的作用。

綜上所述，本研究通過對(duì)對(duì)照組、模型組和芪玄抑甲寧組小鼠甲狀腺組織進(jìn)行miRNA測(cè)序，構(gòu)建“模型組與對(duì)照組”“芪玄抑甲寧組與模型組”差異miRNA的表達(dá)譜，應(yīng)用生物信息學(xué)技術(shù)預(yù)測(cè)差異miRNA的靶基因并進(jìn)行靶基因的富集分析，篩選出與芪玄抑甲寧干預(yù)GD甲亢密切相關(guān)的miRNA靶點(diǎn)及調(diào)控通路?；诒狙芯?，將選取相關(guān)miRNA、靶基因和信號(hào)通路進(jìn)行細(xì)胞和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，以期從表觀遺傳學(xué)角度闡明芪玄抑甲寧治療GD甲亢的作用機(jī)制。