張忠立，石文康，左月明，吳華強（江西中醫(yī)藥大學藥學院，南昌 330004）

《中華本草》收載了龍膽科雙蝴蝶屬植物肺形草、青魚膽草、黃金線、臺灣肺形草、小筋骨藤5 種中草藥[1]，其中肺形草來源于龍膽科植物雙蝴蝶[Tripterospermum chinense（Migo）H. Smith]的幼嫩全草，主要分布于江西、福建、湖北等地，味甘、性寒，歸肺、腎經(jīng)，具有清肺止咳、涼血止血、利尿解毒等功效[2]。國內(nèi)外研究主要集中在玉山雙蝴蝶、日本雙蝴蝶、雙蝴蝶和臺灣雙蝴蝶等幾種植物，目前已從雙蝴蝶屬植物中分離得到100多個化合物，主要含有環(huán)烯醚萜類和黃酮類（呫噸酮）等成分[2-4]，現(xiàn)代藥理學研究證明其具有抗炎、抗氧化、抗高血壓、抗禽流感病毒、抑菌等作用[4-6]。本課題組前期依據(jù)“肺脾兩虛，痰瘀內(nèi)阻”的中醫(yī)病機，建立肺脾兩虛型慢性阻塞性肺疾病（chronic obstructive pulmonary disease，COPD）病理模型，利用此模型研究發(fā)現(xiàn)肺形草提取物具有治療COPD的生物活性，故本實驗以不同產(chǎn)地的肺形草為研究對象，采用超高效液相-四極桿-飛行時間串聯(lián)質譜法（UPLC-Q-TOF-MS）測定不同產(chǎn)地樣本，運用多種統(tǒng)計方法分析不同產(chǎn)地肺形草所含化學成分的差異性，以提供較全面的肺形草技術資料，促進肺形草資源的合理利用和開發(fā)。

1 材料

1.1 儀器

Nexera X2 LC-30A 型超高效液相色譜儀（日本島津公司），Triple TOF 5600+型高分辨質譜（美國AB SCIEX公司，配備Analyst 1.6數(shù)據(jù)處理軟件），BT255十萬分之一電子分析天平（北京賽多利斯科學儀器有限公司），KQ3200B型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司），GZX-9070ME數(shù)顯鼓風干燥箱（上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠）。

1.2 試藥

不同產(chǎn)地的肺形草藥材樣品F1～F8（見表1）均采自于7～8月份，經(jīng)江西中醫(yī)藥大學中藥鑒定教研室左月明教授鑒定為龍膽科雙蝴蝶屬植物Tripterospermum chinense（Migo）H.Smith.的干燥全草。水為屈臣氏蒸餾水，甲酸、乙腈為色譜純（德國Merck公司），其他試劑均為分析純（國藥集團化學試劑有限公司）。

表1 不同產(chǎn)地肺形草藥材樣品信息Tab 1 Sample sources of the herba of Tripterospermum chinense in different areas

2 方法與結果

2.1 液相檢測條件

Welchrom HPLC C18色譜柱（2.1 mm×150 mm，3 μm），流動相乙腈（A）-0.1%甲酸水溶液（B）梯度洗脫，洗脫條件：0～2 min，5%A；2～20 min，5%～12%A；20～35 min，12%～40%A；35～38 min，40%A；38～48 min，40%～80%A；48～50 min，80%A。流速為0.3 mL·min-1，進樣室溫度為 15℃，柱溫為35℃，進樣量為2 μL。

2.2 質譜條件

電噴霧離子源（ESI），負離子模式檢測，掃描范圍m/z100～1250，噴霧電壓5.5 kV，離子源500℃，去簇電壓100 V，碰撞能量35 eV，數(shù)據(jù)采集時間50 min。

2.3 供試品溶液的制備

精密稱取干燥肺形草粉末（過三號篩）1.0 g，加入70%甲醇，質量體積比為1∶25，回流提取3次，每次2 h，放冷，用70%甲醇補足失重，搖勻，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液即可。

2.4 化學成分鑒定

利用UPLC-Q-TOF-MS系統(tǒng)，按照保留時間的先后順序采集肺形草中化學成分的相關質譜數(shù)據(jù)，對樣品溶液分析得不同產(chǎn)地藥材基峰離子色譜圖，見圖1。通過在中國知網(wǎng)（CNKI）、SciFinder、Mass bank等數(shù)據(jù)庫查找收集肺形草中含有的化學成分（包括化學名稱、CAS號、分子式和分子量），在軟件PeakView 1.2.0.3中導入化合物的名稱和分子式，保留篩選出的化學式和保留時間等必要的信息，再導入查找到化學式的mol式，與二級碎片和化學結構進行對比匹配，結合化學式裂解的基本規(guī)律和匹配度≥90%辨別成分；或者結合保留時間和文獻中的質譜信息綜合鑒定成分[7-31]，共鑒定出肺形草化學成分51個（見表2），主要為環(huán)烯醚萜和黃酮類成分。

圖1 不同產(chǎn)地肺形草基峰色譜圖（BPI）Fig 1 Chromatogram of the base peaks of Tripterospermum chinense in different areas

表2 肺形草負離子模式色譜峰質譜指認Tab 2 Identification of chemical constituents from the herba of Tripterospermum chinense by negative ion mode

續(xù)表2

2.4.1 環(huán)烯醚萜類成分鑒定 峰3在負離子峰模式下m/z355.1035，分子式為C16H20O9，在丟失中性碎片-C6H10O5-CO2得到m/z149.0178，再繼續(xù)丟失-C2H4O2得到m/z89.0351，與參考文獻[9]比對得知，此化合物為龍膽苦苷。峰8在負離子峰模式下m/z375.1296，分子式為C16H24O10，丟失-C6H10O5得到碎片離子m/z213.0769，再失去一分子-CO2得到碎片離子m/z169.0873，丟失一分子-H2O得到碎片m/z151.0766，見圖2。根據(jù)二級碎片離子結合參考文獻[9]推測出此化合物為馬錢苷酸。

圖2 馬錢苷酸的裂解方式Fig 2 Proposed fragmentation pathways of loganic acid

2.4.2 呫噸酮類成分鑒定 峰18在負離子峰模式下m/z421.0769，分子式為C19H18O11，繼而丟失中性碎片-H2O，-C3H6O3，-C4H8O4，-C6H10O5，生成m/z403.0129，331.0470，301.0364和259.0259碎片離子，碎片離子m/z331.0470丟失-CO-H2O得到離子m/z285.0411，碎片離子m/z301.0364丟失-CH2O得到碎片離子m/z271.0254，見圖3。與參考文獻[21]比對得知，此化合物為芒果苷。峰35在負離子峰模式下m/z273.0406，分子式為C14H10O6，丟失一分子-CH3得到碎片離子m/z258.0171，或者丟失一分子-CO2得到碎片離子m/z229.0229。與參考文獻[9]對比得知，此化合物為雛菊葉龍膽酮。峰38在負離子峰模式下m/z259.0249，分子式為C13H8O6，一個羥基鍵斷裂，得到m/z243.0581，在雙苯基-γ-吡喃酮的母核上發(fā)生雜環(huán)的碳氧化學鍵斷裂，得到碎片離子m/z199.0852。結合文獻[9]推測出此化合物為去甲基雛菊葉龍膽酮。

圖3 芒果苷的裂解方式Fig 3 Proposed fragmentation pathways of mangiferin

2.4.3 黃酮類成分鑒定 峰22在負離子峰模式下m/z461.1103，分子式為C22H22O11，母離子發(fā)生RDA反應，丟失-C4H8O4生成了m/z341.0368的碎片，隨后又丟失-CO及CH3得到碎片m/z313.0258和m/z298.0402。通過參考文獻[18]比對，得出此化合物為日當藥黃素。

峰23在負離子峰模式下m/z447.0924，分子式為C21H20O11，丟失碎片-C6H10O5，-C4H8O4，-C3H6O3，生成m/z285.0681，327.0522和357.0621碎片離子，m/z357.0621離子碎片再丟失一分子水得m/z339.0582，m/z327.0522離子碎片再丟失一分子水得m/z309.0692，見圖4。通過參考文獻[22]比對，得出此化合物為異葒草苷。

圖4 異葒草苷的裂解方式Fig 4 Proposed fragmentation pathways of isoorientin

2.4.4 生物堿類成分鑒定 峰20在負離子峰模式下m/z174.0563，分子式為C10H9NO2，丟失一分子-HCHO得到碎片離子m/z144.0621，再丟失一分子-CO得碎片離子m/z116.0662，見圖5。通過參考文獻[9]比對，得出此化合物為龍膽堿。

圖5 龍膽堿的裂解方式Fig 5 Proposed fragmentation pathways of gentianine

2.4.5 三萜類成分鑒定 峰49在負離子峰模式下m/z455.3534，分子式為C30H48O3，丟失一分子-HCOOH得到碎片離子m/z409.0132，再丟失一個-H2O和RDA裂解后得到碎片離子m/z350.0721，或者原分子丟失一個-H2O得到碎片離子m/z437.0692，或者原分子發(fā)生RDA裂解后得到碎片離子m/z207.2688，再丟失一分子-H2O得到碎片離子m/z189.0126，見圖6。通過與參考文獻[31]進行對比，得出此化合物為熊果酸。

圖6 熊果酸的裂解方式Fig 6 Proposed fragmentation pathways of ursolic acid

2.4.6 蒽醌類成分鑒定 峰46在負離子峰模式下m/z269.0455，分子式為C15H10O5，丟失一分子-CO得到碎片離子m/z241.0515，進一步丟失一個-O得到碎片離子m/z225.0565，而后丟失一分子-CO得到m/z197.0606；或者m/z241.0515碎片丟失一分子-CO得到m/z213.0562，再丟失一分子CO得到m/z185.0585，繼續(xù)丟失一分子CH2得到m/z171.0458，見圖7。通過與參考文獻[13]比對，得出此化合物為大黃素。

圖7 大黃素的裂解方式Fig 7 Proposed fragmentation pathways of emodin

2.4.7 有機酸類成分鑒定 峰21在負離子峰模式下m/z179.0348，分子式為C9H8O4，丟失一分子-CO2得到m/z135.0459。通過與參考文獻[19]比對，得出此化合物為咖啡酸。

2.5 主成分分析

將不同產(chǎn)地的肺形草化學成分存在差異，主成分分析（PCA）和正交偏最小二乘法-判別分析（OPLS-DA）將不同產(chǎn)地的肺形草MS數(shù)據(jù)導入MarkView 1.2.1并設置參數(shù)，去除同位素離子峰，歸一化處理后得到數(shù)據(jù)。將得到的數(shù)據(jù)導入SIMCA 14.1進行PCA和OPLS-DA分析。數(shù)據(jù)在軟件中經(jīng)過處理可以得到PCA圖。結果發(fā)現(xiàn)不同產(chǎn)地的樣本被明顯分為三類，說明樣本之間的化學成分有明顯的差異，F(xiàn)3樣本為一組，F(xiàn)2和F6樣本為一組，F(xiàn)1、F4、F5、F7和F8樣本為一組，每組組內(nèi)樣本之間離散較小，表示組內(nèi)均一性良好。PCA雖然可以將樣本進行分類，但是組內(nèi)差異并不明顯，所以在PCA的基礎上進行OPLS-DA分析，結果發(fā)現(xiàn)組間差距依舊明顯，組內(nèi)也存在差異（見圖8）。聚類分析結果顯示：如果將樣本分為兩類，F(xiàn)2、F3、F6為一類，F(xiàn)1、F4、F5、F7、F8為一類；如果將樣本分為4類，則F3為一類，F(xiàn)2、F6為一類，F(xiàn)5、F8為一類，F(xiàn)1、F4、F7為一類，見圖9。

圖8 不同產(chǎn)地肺形草的PCA 得分（A）和 OPLS-DA 得分（B）Fig 8 PCA scores（A）and OPLS-DA scores（B）of Tripterospermum chinense in different areas

圖9 不同產(chǎn)地肺形草的聚類分析Fig 9 Cluster analysis of Tripterospermum chinense in different areas

2.6 差異性成分的篩選與分析

將不同產(chǎn)地肺形草數(shù)據(jù)導入MarkView 1.2.1中設置參數(shù)，去掉同位素離子峰后再進行t檢驗，導出數(shù)據(jù)保留Use一列中的Ture數(shù)據(jù)；結合OPLS-DA中VIP＞1的值與t檢驗中P＜0.05的值取交集，對照所有的數(shù)據(jù)共得到11個差異性指標成分，將每個產(chǎn)地的峰面積進行對比，結果見表3。

表3 不同產(chǎn)地肺形草存在差異的化合物信息Tab 3 Compound information of differences of Tripterospermum chinense in different areas

不同產(chǎn)地的肺形草藥材中，化學成分種類差別不大，均以黃酮和環(huán)烯醚萜類成分為其主要成分類型，而有11個差異性成分的相對含量不同，馬錢苷酸、8-表-金銀花苷、莫諾苷和芒果苷在肺形草藥材中相對含量較高。1，3，8-三羥基呫噸酮和3，6，8-三羥基-1-甲基呫噸酮在F6樣本中含量較高，大黃素和莫諾苷在F8樣本中含量較高，芒果苷在F5樣本中含量較高，馬錢苷酸、8-表-金銀花苷、當藥黃素、熊果酸、山楂酸和千層紙素A-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷在F3樣本中含量較高。

3 討論

本實驗采用UPLC-Q-TOF-MS對不同產(chǎn)地肺形草的化學成分進行辨識，前期正、負離子模式比較發(fā)現(xiàn)，黃酮類和環(huán)烯醚萜類成分在負離子模式下所顯示的成分信息更多。同時，我們對色譜條件進行優(yōu)化，對提取方法、提取時間以及流動相等進行了考察，最終確定以70%甲醇為提取溶劑，回流提取2 h，流動相采用乙腈-0.1%甲酸水進行負離子模式下梯度洗脫測試，共鑒別出51個化合物，其中以黃酮、呫噸酮和環(huán)烯醚萜類成分為主，最終篩選出大黃素、芒果苷、莫諾苷等11個差異性成分，這些差異性成分相對含量的不同直接反映不同產(chǎn)地肺形草藥材質量的差異性，產(chǎn)于江西、浙江、福建的肺形草藥材成分相近，產(chǎn)于四川和云南的肺形草藥材成分相近，而產(chǎn)于湖北的肺形草單獨為一組。由于目前化學成分數(shù)據(jù)庫尚不完善和相關領域研究報道較少，導致部分成分沒有最終鑒定，有待后續(xù)進一步深入研究。

國內(nèi)外對雙蝴蝶屬植物的化學成分和藥理活性的研究顯示，雙蝴蝶屬植物中的化學成分多屬于環(huán)烯醚萜類和呫噸酮類成分，大多具有非常廣泛的藥理活性，其中馬錢苷酸和8-表-金銀花苷具有抗炎作用[4]，莫諾苷具有保護神經(jīng)元延緩衰老、保肝作用[32]，芒果苷具有抗炎、抗心力衰竭作用[33]，當藥黃素具有抗炎、抗氧化和抗抑郁作用[34]，研究表明肺形草具有抗炎、抗氧化、抗高血壓、抗病毒、抑菌等作用。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)肺形草提取物具有治療COPD的生物活性，但其藥效物質基礎不清晰，有待進一步深入探討。此外，肺形草不同產(chǎn)地藥材中環(huán)烯醚萜類和呫噸酮類差異性成分相對含量的不同，導致藥材質量的不穩(wěn)定，需要以此類差異性成分為定量指標建立和完善肺形草藥材的質量標準，故通過本文研究，可為后續(xù)藥材質量標準的制定提供科學依據(jù)和理論支撐，以促進其資源的合理利用和深度開發(fā)。