彭秘，張增珠，李剛，蘇丹，熊國營，劉匡一*（. 中國人民解放軍聯(lián)勤保障部隊第908醫(yī)院，南昌 0000；. 江西中醫(yī)藥大學抑郁癥中醫(yī)證候動物模型江西省中醫(yī)藥管理局重點研究室，南昌 0000；. 南昌市第一醫(yī)院，南昌 0000）

女性更年期綜合征（絕經(jīng)前后諸證）中醫(yī)辨證屬肝腎陰虛證，癥見烘熱汗出、頭暈、耳鳴、腰膝酸軟或足跟痛、少寐多夢、急躁易怒等，關黃母顆粒在臨床上常應用于婦女更年期后抑郁癥類疾病的治療，其主要成分包括熟地黃、龜甲膠、鹽關黃柏、鹽知母以及白芍。目前臨床對抑郁治療的藥物多為化學類精神藥品，普遍存在副作用大，成癮性隱患等問題。近年來，愈來愈多的藥學科研人員將目光轉移至傳統(tǒng)中藥上來，以五味子、白芍、關黃柏等藥材為主要代表。相對于關黃柏等單味藥材，已有文獻表明知母與關黃柏配伍聯(lián)用可顯著提高其小檗堿等生物堿的含量[1]，而關黃母顆粒作為臨床療效確切的中藥復方制劑，其具體聯(lián)合用藥抗抑郁作用機制尚不清晰，藥物主要化學成分能否跨過血腦屏障直接調(diào)控神經(jīng)系統(tǒng)成為傳統(tǒng)中藥治療抑郁疾病的重要環(huán)節(jié)之一[2-3]，因此，對其主要化學成分的分析及腦組織移行成分的研究顯得極為重要。

本實驗利用超高效液相色譜-質譜聯(lián)用技術（UPLC-QTOF/MS）中的IDA采集技術[4-7]，結合數(shù)據(jù)庫及文獻資料，解析藥物中可能存在的主要化學成分，并鑒定大鼠灌胃給藥后藥物的入腦成分，為進一步明晰該藥物抗抑郁作用物質基礎提供實驗依據(jù)[8]，也為下一步的藥物質量控制研究奠定基礎。

1 材料

1.1 儀器

ExionLC AD超高效液相色譜系統(tǒng)、SCIEX X500R 四極桿飛行時間質譜儀（美國SCIEX）；高速離心機（上海安亭科學儀器廠）；渦旋混合器（海門市其林貝爾儀器制造有限公司）；分析天平（梅特勒-托利多儀器有限公司）；恒溫氮氣吹干儀（青島?？苾x器有限公司）。

1.2 試藥

紅景天苷（批號：B1619137，純度≥97.5%，上海阿拉丁生化科技股份有限公司），槲皮苷（批號：111538-200301，純度≥94.5%，中國食品藥品檢定研究院），益母草苷（批號：YA220607，純度≥98%，合肥博美生物科技有限責任公司）。甲醇、乙腈（色譜級，Thermo Fisher公司），甲酸（質譜級，美國Sigma公司）。蒸餾水采用屈臣氏蒸餾水。關黃母顆粒（批號：04210503，通化萬通藥業(yè)股份有限公司，每袋裝9 g，相當于飲片4.8 g）。

2 方法

2.1 藥液樣品的制備

取1袋藥品（相當于飲片4.8 g），移至100 mL燒杯中，加入80%乙腈水溶液50 mL，超聲30 min，取適量超聲提取液，16 000 r·min-1離心10 min，取上清液進樣分析。

灌胃藥液：取1袋藥品，用25 mL蒸餾水溶解完全，現(xiàn)配現(xiàn)用。

2.2 對照品溶液的制備

取紅景天苷、槲皮苷及益母草苷對照品溶液適量，乙腈溶解稀釋，混合配制成為終質量濃度為1 mg·mL-1的對照品溶液，4℃冷藏保存。

2.3 動物實驗

SPF級雄性SD大鼠4只，體質量（180±20）g [江西中醫(yī)藥大學實驗動物中心，動物生產(chǎn)許可證號SCXK（贛）2018-003]。正常喂養(yǎng)1周后開始實驗，給藥前禁食12 h，自由飲水，空白組灌胃2.5 mL蒸餾水，實驗組灌胃2.5 mL灌胃藥液，3只大鼠分別于灌胃后1、2、4 h剝離大鼠腦組織，生理鹽水沖洗，洗凈后加入2倍于組織重量的生理鹽水溶液于勻漿機上處理，勻漿后樣本4000 r·min-1離心5 min，取上清液至-20℃保存。

2.4 血漿及組織樣品前處理

取各時間點大鼠腦勻漿后上清組織液200 μL，600 μL乙腈沉淀蛋白，渦旋震蕩2 min，16 000 r·min-1離心10 min，取上清液，室溫下氮氣恒流吹干，200 μL乙腈復溶，進樣分析。

2.5 色譜條件

采用Acquity UPLC HSS T3 色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.8 μm，Waters公司）；流動相：正離子模式下0.1% 甲酸水（A）-乙腈（B），負離子模式下水（A）-乙腈（B），梯度洗脫（0～1 min，5%B；1～10 min，5%～15%B；10～35 min，15%～65%B；35～38 min，65%～95%B；38～41 min，95%B；41～41.1 min，95%～5%B，41.1～45 min，5%B）；流速：0.3 mL·min-1；柱溫：40℃；進樣體積：2 μL。

2.6 質譜條件

ESI正負離子掃描，噴霧電壓+5500 V/-4500 V。Gas 1/Gas 2 55 psi；Cur Gas 35 psi；一級TOF MS掃描范圍100～1500 Da，DP 65 V。IDA掃描模式下對碎片進行數(shù)據(jù)采集，CE ±35 V，MS/MS掃描范圍50～1500 Da。采樣全程DBS（動態(tài)背景扣除）模式下運行。

2.7 數(shù)據(jù)處理

使用SCIEX OS 2.0對數(shù)據(jù)進行處理，在Mass Error＜5×10-6內(nèi)，鑒定藥物中主要化學成分。

3 結果

3.1 藥液化合物分析結果

藥液的總離子流圖見圖1。通過Sciex OS 2.0數(shù)據(jù)處理軟件，結合數(shù)據(jù)庫、對照品、部分文獻[9-16]以及天然產(chǎn)物裂解規(guī)律，共鑒定出159個化學成分，包括萜類27個，生物堿22個，黃酮類20個，醇苷類11個，皂苷類13個，有機酸類12個，氨基酸類12個，木脂素類3個，其他類39個。具體結果見表1。

表1 正、負離子模式下樣品的主要化學成分Tab 1 Main chemical compositions in samples in the positive and negative ion modes

續(xù)表1

續(xù)表1

續(xù)表1

圖1 正（A）、負（B）離子模式下樣品的總離子流圖Fig 1 Chromatogram of samples in positive（A）and negative（B）ion modes

3.2 醇苷類化合物結構解析鑒定

樣品中存在較多醇苷類化合物，以地黃苷為例，負離子模式下，保留時間23.07 min存在加和離子m/z651.2291 [M-H]-的信號強度，對應的IDA MS/MS碎片離子中存在m/z475.1821以及m/z193.0506和m/z175.0401特征峰，結合天然產(chǎn)物質譜裂解規(guī)律，推測m/z475.1821以及m/z193.0506可能為苷鍵斷裂后產(chǎn)生的[M-C10H8O3-H]-及[M-C21H30O11-H]-的碎片離子，m/z175.0401為m/z193.0506脫去一分子水所得。

3.3 萜類化合物結構解析鑒定

在整個色譜結構解析過程中鑒定出大量的萜類化合物，實驗通過m/z165.0557以及m/z121.0298特征碎片離子的方式來尋找化合物，結果主要以芍藥苷、牡丹皮苷D、牡丹皮苷B、芍藥苷亞硫酸酯、氧化芍藥苷為主。以芍藥苷為例，保留時間14.64 min存在加和離子m/z479.1564 [M-H]-的信號強度，同時產(chǎn)生m/z449.1449 [M-CH2O-H]-的碎片離子，并再次碎裂分解為m/z327.1078的一分子苯甲酸結構及脫去一分子苯甲酸的m/z327.1078的碎片離子[9]。

3.4 生物堿類化合物結構解析鑒定

共鑒定出22種含生物堿類結構的化合物。從峰面積響應強度上來看，含量較多的為黃柏堿、木蘭花堿、藥根堿、小檗堿以及巴馬汀。該類化合物大多都含有m/z308.1275以及m/z294.1120特征碎片離子。以藥根堿為例，tR20.23 min出現(xiàn)m/z338.1379以[M]+的一級信號，二級質譜圖中m/z323.1145為[M-CH3]+所致碎片離子，m/z322.1068則為m/z323.1145結構中含氮的閉合環(huán)上發(fā)生電子重排反應再次失去H分子產(chǎn)生雙鍵所得，m/z308.0915[M-CH3-CH3]+則可能是m/z338.1379母離子失去兩分子甲基后的電子重排的雙鍵產(chǎn)物[14]，m/z294.1120則是m/z322.1068裂解失去CO所得。具體二級質譜圖及裂解方式見圖2。

圖2 藥根堿二級質譜圖及可能存在的裂解途徑Fig 2 MS spectrogram of jatrorrhizine and possible cracking pathways

3.5 黃酮類化合物結構解析鑒定

通過文獻檢索、數(shù)據(jù)庫以及天然產(chǎn)物裂解規(guī)律，結合數(shù)據(jù)處理軟件中Formula Finder確證方式，正離子掃描模式下共鑒定出以[M+H]+加和方式存在的槲皮素、芒果苷、新芒果苷以及牡荊苷等20種黃酮類化合物。在天然產(chǎn)物裂解規(guī)律中，黃酮類物質一般帶有糖基類基團，失去糖基后結構易再次發(fā)生RDA裂解反應。以tR17.51 min金絲桃苷為例，二級碎片離子包括失去一分子葡萄糖基的m/z303.0499以及經(jīng)RDA等裂解反應終得的m/z85.0284碎片離子。其中m/z303.0499、m/z85.0284的碎片離子是蘆丁、金絲桃苷的共有特征碎片離子，m/z301.0363是漢黃芩苷黃酮化合物的特有碎片離子[16]。

整合裂解規(guī)律，黃酮類化合物在整體二級質譜裂解過程中C環(huán)1位和4位上的CO鍵易脫去，產(chǎn)生新的碎片離子。以tR13.73 min槲皮素為例，m/z303.0499是槲皮素的[M+H]+一級信號，失去一分子水得二級碎片信息中m/z285.0411，再次發(fā)生縮合反應失去一分子CO得到m/z257.0452碎片離子[16]。

3.6 皂苷類化合物鑒定

共鑒定出13種皂苷類成分，主要以知母皂苷A2、知母皂苷AⅢ及知母皂苷BⅡ為主。以tR26.88 min知母皂苷BⅡ為例，m/z919.4895的[M-H]-離子為其一級加和方式，m/z757.4353為[M-C6H10O5-H]-碎片離子，m/z595.3787為[M-C12H20O10-H]-碎片離子，具體二級質譜圖及可能裂解途徑見圖3。

圖3 知母皂苷B Ⅱ二級質譜圖及可能存在的裂解途徑Fig 3 MS spectrogram of timosaponin and possible cracking pathways

3.7 腦組織樣本分析結果

根據(jù)以上鑒定結果，對大鼠灌胃給藥后1、2、4 h腦組織樣本進行UPLC-QTOF/MS鑒定分析，通過色譜圖和碎片離子信息共推測出15種入腦成分，并結合Sciex QTOF中的Swath非數(shù)據(jù)依賴型采集技術，選擇目標化合物中MS/MS響應強度大的二級碎片離子形成MRMHR（High Resolution）通道進行定量研究。結果顯示，組織樣品中含量較高的部分主要為關黃柏中生物堿類成分，以小檗堿、巴馬汀、小檗紅堿為代表，其次是芍藥苷類化合物，例如芍藥苷、芍藥內(nèi)酯苷等。在其中4 h腦組織樣本中檢測出京尼平苷酸類熟地黃化合物，含量較小。生物樣品移行成分峰面積分布見圖4。

圖4 不同大鼠1 h、2 h及4 h腦組織移行成分峰面積Fig 4 Peak area content of migrating components in different brain tissues at 1 h，2 h and 4 h

4 討論

本實驗基于UPLC-QTOF/MS分析方法對關黃母顆粒中主要化學成分進行了分析研究，推測出可能存在的159種主要化學成分。其中共鑒定出關黃柏類化合物39種，熟地黃類36種，鹽知母類化合物26種以及白芍類化合物35種，其中以鹽關黃柏中生物堿及白芍中萜類成分最多，并通過動物實驗成功鑒定出15種入腦成分。

在色譜柱選擇方面，本實驗著重比較了C18與T3兩種色譜柱的分離情況，顆粒中主要成分為水溶性，C18色譜柱得到的色譜圖大部分色譜峰聚集在保留時間前三分之一段，造成了IDA二級掃描模式下部分化合物二級碎片的缺失，因此，通過最終實踐比較，選擇了T3色譜柱進行分離實驗。

從鑒定結果表1中可見，鑒定出大量的氨基酸類、腺苷類及嘌呤類物質，其在種類及含量上遠超于知母、關黃柏、白芍及熟地黃等單味藥材，考慮是顆粒劑中含有龜甲膠成分所致。通過腦組織樣品化合物成分鑒定，發(fā)現(xiàn)以小檗堿、巴馬汀、藥根堿、小檗紅堿、芍藥苷、芍藥內(nèi)酯苷等化合物入腦含量較多。有文獻表明，關黃柏類生物堿化合物能通過調(diào)節(jié)花生四烯酸、甘油磷脂等代謝通路達到消炎鎮(zhèn)痛的效果，同時巴馬汀成分具有抑制單胺氧化酶A，調(diào)節(jié)腦去甲腎上腺素、血清素、多巴胺水平的能力[13]。而白芍中大量的萜類成分，則具有神經(jīng)系統(tǒng)調(diào)節(jié)的功效，芍藥苷、芍藥內(nèi)酯苷等易透過血腦屏障的特點可能是關黃母顆粒劑中治療抑郁樣情緒障礙的有效成分[8]。與之相同的是，知母皂苷BⅡ作為樣品鑒定中成分最多的皂苷類物質，在針對女性更年期抗抑郁方面也有一定的藥理作用[17]。而熟地黃中黃酮類化合物則可以顯著提高血清雌激素濃度、脾細胞雌激素受體含量水平[18]。

綜上所述，本實驗通過運用UPLC-QTOF/MS技術對關黃母顆粒主要化學成分及大鼠入腦成分進行了分離和鑒定，后續(xù)將對入腦成分在大鼠各腦組織（海馬、下丘腦、大腦皮層、腦垂體、腦干等）中的分布進行研究，進一步分析15種入腦成分在各區(qū)域靶器官的含量，為明晰該制劑改善更年期綜合征及抗抑郁等作用的物質基礎提供參考。