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        基于UPLC-QTOF/MS的關(guān)黃母顆粒主要化學(xué)成分及腦組織移行成分研究

        2023-04-01 05:28:48彭秘張?jiān)鲋?/span>李剛蘇丹熊國(guó)營(yíng)劉匡一中國(guó)人民解放軍聯(lián)勤保障部隊(duì)第908醫(yī)院南昌0000江西中醫(yī)藥大學(xué)抑郁癥中醫(yī)證候動(dòng)物模型江西省中醫(yī)藥管理局重點(diǎn)研究室南昌0000南昌市第一醫(yī)院南昌0000
        中南藥學(xué) 2023年2期
        關(guān)鍵詞:知母黃柏芍藥

        彭秘,張?jiān)鲋?,李剛,蘇丹,熊國(guó)營(yíng),劉匡一*(. 中國(guó)人民解放軍聯(lián)勤保障部隊(duì)第908醫(yī)院,南昌 0000;. 江西中醫(yī)藥大學(xué)抑郁癥中醫(yī)證候動(dòng)物模型江西省中醫(yī)藥管理局重點(diǎn)研究室,南昌 0000;. 南昌市第一醫(yī)院,南昌 0000)

        女性更年期綜合征(絕經(jīng)前后諸證)中醫(yī)辨證屬肝腎陰虛證,癥見烘熱汗出、頭暈、耳鳴、腰膝酸軟或足跟痛、少寐多夢(mèng)、急躁易怒等,關(guān)黃母顆粒在臨床上常應(yīng)用于婦女更年期后抑郁癥類疾病的治療,其主要成分包括熟地黃、龜甲膠、鹽關(guān)黃柏、鹽知母以及白芍。目前臨床對(duì)抑郁治療的藥物多為化學(xué)類精神藥品,普遍存在副作用大,成癮性隱患等問題。近年來,愈來愈多的藥學(xué)科研人員將目光轉(zhuǎn)移至傳統(tǒng)中藥上來,以五味子、白芍、關(guān)黃柏等藥材為主要代表。相對(duì)于關(guān)黃柏等單味藥材,已有文獻(xiàn)表明知母與關(guān)黃柏配伍聯(lián)用可顯著提高其小檗堿等生物堿的含量[1],而關(guān)黃母顆粒作為臨床療效確切的中藥復(fù)方制劑,其具體聯(lián)合用藥抗抑郁作用機(jī)制尚不清晰,藥物主要化學(xué)成分能否跨過血腦屏障直接調(diào)控神經(jīng)系統(tǒng)成為傳統(tǒng)中藥治療抑郁疾病的重要環(huán)節(jié)之一[2-3],因此,對(duì)其主要化學(xué)成分的分析及腦組織移行成分的研究顯得極為重要。

        本實(shí)驗(yàn)利用超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(UPLC-QTOF/MS)中的IDA采集技術(shù)[4-7],結(jié)合數(shù)據(jù)庫及文獻(xiàn)資料,解析藥物中可能存在的主要化學(xué)成分,并鑒定大鼠灌胃給藥后藥物的入腦成分,為進(jìn)一步明晰該藥物抗抑郁作用物質(zhì)基礎(chǔ)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)[8],也為下一步的藥物質(zhì)量控制研究奠定基礎(chǔ)。

        1 材料

        1.1 儀器

        ExionLC AD超高效液相色譜系統(tǒng)、SCIEX X500R 四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜儀(美國(guó)SCIEX);高速離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠);渦旋混合器(海門市其林貝爾儀器制造有限公司);分析天平(梅特勒-托利多儀器有限公司);恒溫氮?dú)獯蹈蓛x(青島??苾x器有限公司)。

        1.2 試藥

        紅景天苷(批號(hào):B1619137,純度≥97.5%,上海阿拉丁生化科技股份有限公司),槲皮苷(批號(hào):111538-200301,純度≥94.5%,中國(guó)食品藥品檢定研究院),益母草苷(批號(hào):YA220607,純度≥98%,合肥博美生物科技有限責(zé)任公司)。甲醇、乙腈(色譜級(jí),Thermo Fisher公司),甲酸(質(zhì)譜級(jí),美國(guó)Sigma公司)。蒸餾水采用屈臣氏蒸餾水。關(guān)黃母顆粒(批號(hào):04210503,通化萬通藥業(yè)股份有限公司,每袋裝9 g,相當(dāng)于飲片4.8 g)。

        2 方法

        2.1 藥液樣品的制備

        取1袋藥品(相當(dāng)于飲片4.8 g),移至100 mL燒杯中,加入80%乙腈水溶液50 mL,超聲30 min,取適量超聲提取液,16 000 r·min-1離心10 min,取上清液進(jìn)樣分析。

        灌胃藥液:取1袋藥品,用25 mL蒸餾水溶解完全,現(xiàn)配現(xiàn)用。

        2.2 對(duì)照品溶液的制備

        取紅景天苷、槲皮苷及益母草苷對(duì)照品溶液適量,乙腈溶解稀釋,混合配制成為終質(zhì)量濃度為1 mg·mL-1的對(duì)照品溶液,4℃冷藏保存。

        2.3 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

        SPF級(jí)雄性SD大鼠4只,體質(zhì)量(180±20)g [江西中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心,動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK(贛)2018-003]。正常喂養(yǎng)1周后開始實(shí)驗(yàn),給藥前禁食12 h,自由飲水,空白組灌胃2.5 mL蒸餾水,實(shí)驗(yàn)組灌胃2.5 mL灌胃藥液,3只大鼠分別于灌胃后1、2、4 h剝離大鼠腦組織,生理鹽水沖洗,洗凈后加入2倍于組織重量的生理鹽水溶液于勻漿機(jī)上處理,勻漿后樣本4000 r·min-1離心5 min,取上清液至-20℃保存。

        2.4 血漿及組織樣品前處理

        取各時(shí)間點(diǎn)大鼠腦勻漿后上清組織液200 μL,600 μL乙腈沉淀蛋白,渦旋震蕩2 min,16 000 r·min-1離心10 min,取上清液,室溫下氮?dú)夂懔鞔蹈桑?00 μL乙腈復(fù)溶,進(jìn)樣分析。

        2.5 色譜條件

        采用Acquity UPLC HSS T3 色譜柱(100 mm×2.1 mm,1.8 μm,Waters公司);流動(dòng)相:正離子模式下0.1% 甲酸水(A)-乙腈(B),負(fù)離子模式下水(A)-乙腈(B),梯度洗脫(0~1 min,5%B;1~10 min,5%~15%B;10~35 min,15%~65%B;35~38 min,65%~95%B;38~41 min,95%B;41~41.1 min,95%~5%B,41.1~45 min,5%B);流速:0.3 mL·min-1;柱溫:40℃;進(jìn)樣體積:2 μL。

        2.6 質(zhì)譜條件

        ESI正負(fù)離子掃描,噴霧電壓+5500 V/-4500 V。Gas 1/Gas 2 55 psi;Cur Gas 35 psi;一級(jí)TOF MS掃描范圍100~1500 Da,DP 65 V。IDA掃描模式下對(duì)碎片進(jìn)行數(shù)據(jù)采集,CE ±35 V,MS/MS掃描范圍50~1500 Da。采樣全程DBS(動(dòng)態(tài)背景扣除)模式下運(yùn)行。

        2.7 數(shù)據(jù)處理

        使用SCIEX OS 2.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理,在Mass Error<5×10-6內(nèi),鑒定藥物中主要化學(xué)成分。

        3 結(jié)果

        3.1 藥液化合物分析結(jié)果

        藥液的總離子流圖見圖1。通過Sciex OS 2.0數(shù)據(jù)處理軟件,結(jié)合數(shù)據(jù)庫、對(duì)照品、部分文獻(xiàn)[9-16]以及天然產(chǎn)物裂解規(guī)律,共鑒定出159個(gè)化學(xué)成分,包括萜類27個(gè),生物堿22個(gè),黃酮類20個(gè),醇苷類11個(gè),皂苷類13個(gè),有機(jī)酸類12個(gè),氨基酸類12個(gè),木脂素類3個(gè),其他類39個(gè)。具體結(jié)果見表1。

        表1 正、負(fù)離子模式下樣品的主要化學(xué)成分Tab 1 Main chemical compositions in samples in the positive and negative ion modes

        續(xù)表1

        續(xù)表1

        續(xù)表1

        圖1 正(A)、負(fù)(B)離子模式下樣品的總離子流圖Fig 1 Chromatogram of samples in positive(A)and negative(B)ion modes

        3.2 醇苷類化合物結(jié)構(gòu)解析鑒定

        樣品中存在較多醇苷類化合物,以地黃苷為例,負(fù)離子模式下,保留時(shí)間23.07 min存在加和離子m/z651.2291 [M-H]-的信號(hào)強(qiáng)度,對(duì)應(yīng)的IDA MS/MS碎片離子中存在m/z475.1821以及m/z193.0506和m/z175.0401特征峰,結(jié)合天然產(chǎn)物質(zhì)譜裂解規(guī)律,推測(cè)m/z475.1821以及m/z193.0506可能為苷鍵斷裂后產(chǎn)生的[M-C10H8O3-H]-及[M-C21H30O11-H]-的碎片離子,m/z175.0401為m/z193.0506脫去一分子水所得。

        3.3 萜類化合物結(jié)構(gòu)解析鑒定

        在整個(gè)色譜結(jié)構(gòu)解析過程中鑒定出大量的萜類化合物,實(shí)驗(yàn)通過m/z165.0557以及m/z121.0298特征碎片離子的方式來尋找化合物,結(jié)果主要以芍藥苷、牡丹皮苷D、牡丹皮苷B、芍藥苷亞硫酸酯、氧化芍藥苷為主。以芍藥苷為例,保留時(shí)間14.64 min存在加和離子m/z479.1564 [M-H]-的信號(hào)強(qiáng)度,同時(shí)產(chǎn)生m/z449.1449 [M-CH2O-H]-的碎片離子,并再次碎裂分解為m/z327.1078的一分子苯甲酸結(jié)構(gòu)及脫去一分子苯甲酸的m/z327.1078的碎片離子[9]。

        3.4 生物堿類化合物結(jié)構(gòu)解析鑒定

        共鑒定出22種含生物堿類結(jié)構(gòu)的化合物。從峰面積響應(yīng)強(qiáng)度上來看,含量較多的為黃柏堿、木蘭花堿、藥根堿、小檗堿以及巴馬汀。該類化合物大多都含有m/z308.1275以及m/z294.1120特征碎片離子。以藥根堿為例,tR20.23 min出現(xiàn)m/z338.1379以[M]+的一級(jí)信號(hào),二級(jí)質(zhì)譜圖中m/z323.1145為[M-CH3]+所致碎片離子,m/z322.1068則為m/z323.1145結(jié)構(gòu)中含氮的閉合環(huán)上發(fā)生電子重排反應(yīng)再次失去H分子產(chǎn)生雙鍵所得,m/z308.0915[M-CH3-CH3]+則可能是m/z338.1379母離子失去兩分子甲基后的電子重排的雙鍵產(chǎn)物[14],m/z294.1120則是m/z322.1068裂解失去CO所得。具體二級(jí)質(zhì)譜圖及裂解方式見圖2。

        圖2 藥根堿二級(jí)質(zhì)譜圖及可能存在的裂解途徑Fig 2 MS spectrogram of jatrorrhizine and possible cracking pathways

        3.5 黃酮類化合物結(jié)構(gòu)解析鑒定

        通過文獻(xiàn)檢索、數(shù)據(jù)庫以及天然產(chǎn)物裂解規(guī)律,結(jié)合數(shù)據(jù)處理軟件中Formula Finder確證方式,正離子掃描模式下共鑒定出以[M+H]+加和方式存在的槲皮素、芒果苷、新芒果苷以及牡荊苷等20種黃酮類化合物。在天然產(chǎn)物裂解規(guī)律中,黃酮類物質(zhì)一般帶有糖基類基團(tuán),失去糖基后結(jié)構(gòu)易再次發(fā)生RDA裂解反應(yīng)。以tR17.51 min金絲桃苷為例,二級(jí)碎片離子包括失去一分子葡萄糖基的m/z303.0499以及經(jīng)RDA等裂解反應(yīng)終得的m/z85.0284碎片離子。其中m/z303.0499、m/z85.0284的碎片離子是蘆丁、金絲桃苷的共有特征碎片離子,m/z301.0363是漢黃芩苷黃酮化合物的特有碎片離子[16]。

        整合裂解規(guī)律,黃酮類化合物在整體二級(jí)質(zhì)譜裂解過程中C環(huán)1位和4位上的CO鍵易脫去,產(chǎn)生新的碎片離子。以tR13.73 min槲皮素為例,m/z303.0499是槲皮素的[M+H]+一級(jí)信號(hào),失去一分子水得二級(jí)碎片信息中m/z285.0411,再次發(fā)生縮合反應(yīng)失去一分子CO得到m/z257.0452碎片離子[16]。

        3.6 皂苷類化合物鑒定

        共鑒定出13種皂苷類成分,主要以知母皂苷A2、知母皂苷AⅢ及知母皂苷BⅡ?yàn)橹?。以tR26.88 min知母皂苷BⅡ?yàn)槔琺/z919.4895的[M-H]-離子為其一級(jí)加和方式,m/z757.4353為[M-C6H10O5-H]-碎片離子,m/z595.3787為[M-C12H20O10-H]-碎片離子,具體二級(jí)質(zhì)譜圖及可能裂解途徑見圖3。

        圖3 知母皂苷B Ⅱ二級(jí)質(zhì)譜圖及可能存在的裂解途徑Fig 3 MS spectrogram of timosaponin and possible cracking pathways

        3.7 腦組織樣本分析結(jié)果

        根據(jù)以上鑒定結(jié)果,對(duì)大鼠灌胃給藥后1、2、4 h腦組織樣本進(jìn)行UPLC-QTOF/MS鑒定分析,通過色譜圖和碎片離子信息共推測(cè)出15種入腦成分,并結(jié)合Sciex QTOF中的Swath非數(shù)據(jù)依賴型采集技術(shù),選擇目標(biāo)化合物中MS/MS響應(yīng)強(qiáng)度大的二級(jí)碎片離子形成MRMHR(High Resolution)通道進(jìn)行定量研究。結(jié)果顯示,組織樣品中含量較高的部分主要為關(guān)黃柏中生物堿類成分,以小檗堿、巴馬汀、小檗紅堿為代表,其次是芍藥苷類化合物,例如芍藥苷、芍藥內(nèi)酯苷等。在其中4 h腦組織樣本中檢測(cè)出京尼平苷酸類熟地黃化合物,含量較小。生物樣品移行成分峰面積分布見圖4。

        圖4 不同大鼠1 h、2 h及4 h腦組織移行成分峰面積Fig 4 Peak area content of migrating components in different brain tissues at 1 h,2 h and 4 h

        4 討論

        本實(shí)驗(yàn)基于UPLC-QTOF/MS分析方法對(duì)關(guān)黃母顆粒中主要化學(xué)成分進(jìn)行了分析研究,推測(cè)出可能存在的159種主要化學(xué)成分。其中共鑒定出關(guān)黃柏類化合物39種,熟地黃類36種,鹽知母類化合物26種以及白芍類化合物35種,其中以鹽關(guān)黃柏中生物堿及白芍中萜類成分最多,并通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)成功鑒定出15種入腦成分。

        在色譜柱選擇方面,本實(shí)驗(yàn)著重比較了C18與T3兩種色譜柱的分離情況,顆粒中主要成分為水溶性,C18色譜柱得到的色譜圖大部分色譜峰聚集在保留時(shí)間前三分之一段,造成了IDA二級(jí)掃描模式下部分化合物二級(jí)碎片的缺失,因此,通過最終實(shí)踐比較,選擇了T3色譜柱進(jìn)行分離實(shí)驗(yàn)。

        從鑒定結(jié)果表1中可見,鑒定出大量的氨基酸類、腺苷類及嘌呤類物質(zhì),其在種類及含量上遠(yuǎn)超于知母、關(guān)黃柏、白芍及熟地黃等單味藥材,考慮是顆粒劑中含有龜甲膠成分所致。通過腦組織樣品化合物成分鑒定,發(fā)現(xiàn)以小檗堿、巴馬汀、藥根堿、小檗紅堿、芍藥苷、芍藥內(nèi)酯苷等化合物入腦含量較多。有文獻(xiàn)表明,關(guān)黃柏類生物堿化合物能通過調(diào)節(jié)花生四烯酸、甘油磷脂等代謝通路達(dá)到消炎鎮(zhèn)痛的效果,同時(shí)巴馬汀成分具有抑制單胺氧化酶A,調(diào)節(jié)腦去甲腎上腺素、血清素、多巴胺水平的能力[13]。而白芍中大量的萜類成分,則具有神經(jīng)系統(tǒng)調(diào)節(jié)的功效,芍藥苷、芍藥內(nèi)酯苷等易透過血腦屏障的特點(diǎn)可能是關(guān)黃母顆粒劑中治療抑郁樣情緒障礙的有效成分[8]。與之相同的是,知母皂苷BⅡ作為樣品鑒定中成分最多的皂苷類物質(zhì),在針對(duì)女性更年期抗抑郁方面也有一定的藥理作用[17]。而熟地黃中黃酮類化合物則可以顯著提高血清雌激素濃度、脾細(xì)胞雌激素受體含量水平[18]。

        綜上所述,本實(shí)驗(yàn)通過運(yùn)用UPLC-QTOF/MS技術(shù)對(duì)關(guān)黃母顆粒主要化學(xué)成分及大鼠入腦成分進(jìn)行了分離和鑒定,后續(xù)將對(duì)入腦成分在大鼠各腦組織(海馬、下丘腦、大腦皮層、腦垂體、腦干等)中的分布進(jìn)行研究,進(jìn)一步分析15種入腦成分在各區(qū)域靶器官的含量,為明晰該制劑改善更年期綜合征及抗抑郁等作用的物質(zhì)基礎(chǔ)提供參考。

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