劉晨光，張義華，曾煉，羅輝宇，丁旭東

1 錦州醫(yī)科大學(xué)湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬襄陽(yáng)市第一人民醫(yī)院研究生聯(lián)合培養(yǎng)基地麻醉科，湖北 襄陽(yáng) 441000；2 湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬襄陽(yáng)市第一人民醫(yī)院麻醉科；3 湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬襄陽(yáng)市第一人民醫(yī)院康復(fù)科

骨關(guān)節(jié)炎是由多種原因引起的慢性退行性疾?。?］，其帶來(lái)的疼痛和運(yùn)動(dòng)障礙影響患者正常生活，最終可導(dǎo)致功能喪失。骨關(guān)節(jié)炎目前無(wú)法根治，治療目的主要是減輕疼痛、恢復(fù)基本的關(guān)節(jié)活動(dòng)、避免功能喪失［2］。關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射局麻藥物被廣泛用于骨關(guān)節(jié)炎及關(guān)節(jié)手術(shù)后鎮(zhèn)痛，有助于功能恢復(fù)。羅哌卡因作用時(shí)間長(zhǎng)、毒性小，是臨床常用的酰胺類局麻藥物［3］。有研究發(fā)現(xiàn)，局部麻醉藥物的毒性作用在軟骨細(xì)胞中也有表現(xiàn)［4］。羅哌卡因會(huì)影響細(xì)胞鉀通道和鈣通道，影響線粒體功能，導(dǎo)致細(xì)胞損傷。理論上，適度自噬在線粒體功能受損時(shí)起到保護(hù)作用，但當(dāng)自噬超過(guò)細(xì)胞的最大適應(yīng)能力時(shí)，則會(huì)引發(fā)線粒體功能障礙，最終導(dǎo)致軟骨細(xì)胞死亡。自噬還可通過(guò)降解鐵蛋白、減少鐵儲(chǔ)存、導(dǎo)致鐵“超載”從而促進(jìn)鐵死亡，進(jìn)一步導(dǎo)致細(xì)胞死亡。研究認(rèn)為，羅哌卡因能夠促進(jìn)神經(jīng)元細(xì)胞發(fā)生自噬，但關(guān)于羅哌卡因?qū)浌羌?xì)胞自噬和鐵死亡的影響報(bào)道較少。2022 年3 月—7 月，本研究觀察了羅哌卡因?qū)θ塑浌羌?xì)胞C28/I2 的損傷誘導(dǎo)作用，并基于自噬和鐵死亡探索相關(guān)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞與主要材料 C28/I2 細(xì)胞株購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞資源中心。高糖DMEM 培養(yǎng)基和胎牛血清購(gòu)自Gibco 公司，羅哌卡因購(gòu)自辰欣藥業(yè)公司，CCK-8 試劑盒購(gòu)自Biosharp 公司，活性氧試劑盒和JC-1 試劑盒購(gòu)自凱基生物公司，SDS-PAGE試劑盒購(gòu)自沈陽(yáng)萬(wàn)類生物科技有限公司。一抗：GAPDH 購(gòu)自Absin 公司，LC3、p62 購(gòu)自三鷹公司、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶4（GPX4）、重組人鐵蛋白重鏈1（FTH1）購(gòu)自Cellsignal 公司；HRP 標(biāo)記的熒光二抗IgG購(gòu)自杭州碧云天生物公司。酶標(biāo)儀購(gòu)自Molecular Devices公司，倒置顯微鏡購(gòu)自O(shè)lympus公司。

1.2 細(xì)胞分組及處理 將C28/I2 細(xì)胞置于含10%胎牛血清、1%雙抗的高糖培養(yǎng)基中，于37 ℃、5% CO2、95%濕度條件下培養(yǎng)。適當(dāng)換液保持細(xì)胞良好狀態(tài)，待細(xì)胞融合達(dá)60% ～ 80%時(shí)，用胰酶消化細(xì)胞，進(jìn)行傳代。將細(xì)胞隨機(jī)分對(duì)照組、實(shí)驗(yàn)1 組、實(shí)驗(yàn)2 組、實(shí)驗(yàn)3組。實(shí)驗(yàn)1、2、3組分別給予0.25、0.50、1.00 mmol/L的羅哌卡因處理48 h；對(duì)照組不添加藥物。

1.3 細(xì)胞活力檢測(cè) 將C28/12 細(xì)胞接種到96 孔板，3×103/孔，每孔加入100 μL 培養(yǎng)基。待細(xì)胞狀態(tài)良好、細(xì)胞增殖達(dá)60% ～ 80%，參照“1.2”分組操作，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)48 h后，每孔加入10 μL的CCK-8 溶液，37 ℃搖床孵育2 ～ 4 h。用酶標(biāo)儀測(cè)定每個(gè)孔的光密度（OD）值，以對(duì)照組細(xì)胞活力為100%，以沒(méi)有細(xì)胞且有CCK-8 試劑的空白孔調(diào)零，計(jì)算各組細(xì)胞存活率。細(xì)胞存活率=實(shí)驗(yàn)組OD 值/對(duì)照組OD值×100%。

1.4 細(xì)胞形態(tài)觀察 將C28/I2細(xì)胞接種于12孔板中，5×105/孔，取對(duì)數(shù)增殖期的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，分組處理方式同“1.2”。培養(yǎng)48 h后，顯微鏡下選取多個(gè)視野，觀察各組細(xì)胞形態(tài)并拍照記錄。

1.5 細(xì)胞線粒體活性氧（ROS）及線粒體膜電位檢測(cè) 將C28/I2細(xì)胞接種于24孔板中，5×105/孔，分組處理方式同“1.2”。培養(yǎng)48 h 后，棄掉孔中培養(yǎng)基，用PBS 洗滌2 次。使用ROS 紅色熒光探針二氫乙啶標(biāo)記細(xì)胞DNA中的ROS，37 ℃孵育20 min，PBS洗滌2 次。熒光顯微鏡下觀察，采集相應(yīng)的白光圖像，采用Image J 軟件分析ROS 平均熒光強(qiáng)度。采用JC-1法測(cè)定線粒體膜電位。按照試劑說(shuō)明書(shū)配置JC-1工作液，每孔加入200 μL 的JC-1 工作液覆蓋細(xì)胞，37 ℃孵育20 min，用PBS 洗滌2 次；多聚甲醛室溫固定，PBS洗滌2次，加入細(xì)胞核染料進(jìn)行核復(fù)染，室溫15 min；熒光顯微鏡下觀察并拍照，采用Image J軟件分析各組平均熒光強(qiáng)度，表示膜電位大小。

1.6 細(xì)胞中自噬相關(guān)蛋白及鐵死亡相關(guān)蛋白檢測(cè) 采用Western blotting法。將C28/I2細(xì)胞接種于6 孔板中，5×107/孔，分組處理方式同“1.2”。培養(yǎng)48 h 后，棄掉孔中培養(yǎng)基，用PBS 洗滌2 次，每孔加入蛋白裂解液，在冰上放置15 min，超聲間斷震碎細(xì)胞。放入4 ℃離心機(jī)，13 000 r/min、離心15 min，收集上清液，加入蛋白上樣緩沖液，煮沸使蛋白變性，使用BCA 試劑盒檢測(cè)蛋白濃度。每孔上樣蛋白量25 μg，電泳并轉(zhuǎn)膜，脫脂牛奶室溫封閉1 h，TBST 洗膜后加入稀釋一抗LC3（1∶2 000）、p62（1∶1 000）、GPX4（1∶1 000）、FTH1（1∶1 000）、GAPDH（1∶5 000），4 ℃搖床孵育過(guò)夜，TBST 洗膜3 次。加入羊抗鼠熒光二抗IgG（1∶2 000），室溫孵育1.5 h，TBST洗膜3次。ECL顯影，曝光，使用Image J軟件分析蛋白條帶灰度值并進(jìn)行相對(duì)定量。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS22.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以±s表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD 檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組細(xì)胞活力比較 實(shí)驗(yàn)1、2、3組及對(duì)照組細(xì)胞存活率分別為98% ± 1%、84% ± 3%、22% ± 2%，100% ± 1%。各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞存活率低于對(duì)照組，且實(shí)驗(yàn)1、2、3組細(xì)胞存活率依次下降（P均＜0.05）。

2.2 各組細(xì)胞形態(tài)變化 對(duì)照組細(xì)胞呈多邊形、三角形等不規(guī)則形態(tài)，細(xì)胞體積大，具有人軟骨細(xì)胞的結(jié)構(gòu)及特征。各實(shí)驗(yàn)組隨著羅哌卡因作用濃度增加，軟骨細(xì)胞數(shù)量逐漸減少，細(xì)胞形態(tài)逐漸變得細(xì)長(zhǎng)，胞質(zhì)減少，部分細(xì)胞呈球狀、皺縮，凋亡、壞死細(xì)胞數(shù)量增多。見(jiàn)圖1。

圖1 各組細(xì)胞形態(tài)變化

2.3 各組細(xì)胞線粒體ROS 及線粒體膜電位比較對(duì)照組及實(shí)驗(yàn)1、2、3組線粒體ROS水平分別為1.00 ± 0.11、1.91 ± 0.18、2.48 ± 0.19、3.51 ± 0.44，線粒體膜 電位 分別 為1.31 ± 0.12、0.84 ± 0.08、0.68 ± 0.06、0.51 ± 0.04。實(shí)驗(yàn)3 組細(xì)胞線粒體ROS 水平高于對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)1、2、3組細(xì)胞線粒體ROS水平依次升高（P均＜0.05）。對(duì)照組、實(shí)驗(yàn)1組、實(shí)驗(yàn)2組、實(shí)驗(yàn)3組線粒體膜電位依次降低（P均＜0.05）。

2.4 各組細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白及鐵死亡相關(guān)蛋白表達(dá)比較 對(duì)照組、實(shí)驗(yàn)1組、實(shí)驗(yàn)2組、實(shí)驗(yàn)3組LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ依次增加，p62、FTH1、GPX4 蛋白表達(dá)依次下降（P均＜0.05）。見(jiàn)表1。

表1 各組細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白及鐵死亡相關(guān)蛋白表達(dá)比較（± s）

表1 各組細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白及鐵死亡相關(guān)蛋白表達(dá)比較（± s）

注：與對(duì)照組相比，*P＜0.05；與實(shí)驗(yàn)1組相比，#P＜0.05；與實(shí)驗(yàn)2組相比，△P＜0.05。

GPX4 0.91 ± 0.12*0.80 ± 0.08*#0.47 ± 0.02*#△1.05 ± 0.10組別實(shí)驗(yàn)1組實(shí)驗(yàn)2組實(shí)驗(yàn)3組對(duì)照組LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ1.15 ± 0.25*1.35 ± 0.28*#2.65 ± 0.50*#△0.25 ± 0.05 p62 0.65 ± 0.13*0.47 ± 0.08*#0.18 ± 0.06*#△1.30 ± 0.09 FTH1 0.82 ± 0.04*0.70 ± 0.10*#0.24 ± 0.06*#△0.94 ± 0.07

3 討論

骨關(guān)節(jié)炎好發(fā)于中老年人。我國(guó)人口老齡化趨勢(shì)明顯，骨關(guān)節(jié)炎發(fā)病率較高。骨關(guān)節(jié)炎導(dǎo)致的疼痛、運(yùn)動(dòng)障礙、關(guān)節(jié)畸形、肌肉萎縮等極大降低了患者的生活質(zhì)量［5］。目前對(duì)于骨關(guān)節(jié)炎的治療主要是減輕疼痛、改善功能、延緩疾病進(jìn)展。羅哌卡因作為酰胺類局部麻醉藥的代表，被廣泛應(yīng)用于周圍神經(jīng)阻滯，用于骨折固定術(shù)后鎮(zhèn)痛并減輕局部炎癥反應(yīng)，還可用于骨關(guān)節(jié)炎及關(guān)節(jié)鏡手術(shù)后鎮(zhèn)痛。近年來(lái)，大量研究表明羅哌卡因可對(duì)軟骨細(xì)胞產(chǎn)生毒性作用，但機(jī)制尚不清楚［6］。SILVA 等［7］研究顯示，羅哌卡因通過(guò)降低細(xì)胞活力、增加細(xì)胞凋亡和引起細(xì)胞外基質(zhì)損傷對(duì)軟骨細(xì)胞產(chǎn)生毒性作用。本研究發(fā)現(xiàn)，羅哌卡因作用于軟骨細(xì)胞后，細(xì)胞活力降低且作用呈濃度依賴性，軟骨細(xì)胞形態(tài)也發(fā)生變化［8］，隨著羅哌卡因作用濃度增加，軟骨細(xì)胞數(shù)量逐漸減少，細(xì)胞形態(tài)變得細(xì)長(zhǎng)，胞質(zhì)減少，部分細(xì)胞呈球狀、皺縮，凋亡、壞死細(xì)胞數(shù)量增多，與相關(guān)研究結(jié)果一致。

JAYARAM 等［9］研究顯示，羅哌卡因的軟骨毒性是由線粒體DNA 損傷導(dǎo)致軟骨細(xì)胞凋亡或壞死引起的。線粒體是細(xì)胞進(jìn)行有氧呼吸的部位，通過(guò)氧化磷酸化產(chǎn)生ATP，維持機(jī)體生存所需能量。細(xì)胞在損傷過(guò)程中會(huì)發(fā)生氧化應(yīng)激，導(dǎo)致ROS 生成增多，線粒體膜電位降低，引發(fā)線粒體功能障礙，而受損的線粒體會(huì)進(jìn)一步激活線粒體自噬［10］。自噬可將受損的細(xì)胞成分轉(zhuǎn)運(yùn)至溶酶體，使其被降解和循環(huán)再利用［11］。自噬的特殊類型——線粒體自噬可清除功能失調(diào)和受損的線粒體，維持細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)，保證能量供給［12］。通常情況下，自噬對(duì)細(xì)胞起到保護(hù)作用，然而當(dāng)自噬激活超過(guò)一定范圍時(shí)，則可導(dǎo)致細(xì)胞損傷，包括加劇損傷進(jìn)程及降解正常線粒體成分，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡［13］。曾煉等［14］的研究指出，羅哌卡因可促進(jìn)神經(jīng)元細(xì)胞發(fā)生自噬，導(dǎo)致神經(jīng)元細(xì)胞凋亡。本研究發(fā)現(xiàn)，羅哌卡因作用后，軟骨細(xì)胞線粒體ROS生成增加，線粒體膜電位降低，引起線粒體功能障礙；并且，羅哌卡因可促使LC3-Ⅰ向LC3-Ⅱ轉(zhuǎn)化，自噬小體增多，自噬底物p62 水平降低，自噬水平增加。

有研究表明，自噬可以促進(jìn)鐵死亡的發(fā)生［15-16］，其機(jī)制可能與減少鐵儲(chǔ)存、導(dǎo)致鐵累積有關(guān)。鐵蛋白是一種細(xì)胞內(nèi)廣泛存在的儲(chǔ)鐵蛋白，由FTL1 和FTH1 兩個(gè)鐵蛋白組件構(gòu)成。細(xì)胞內(nèi)游離的Fe2+由轉(zhuǎn)鐵蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)至鐵蛋白中存儲(chǔ)，維持細(xì)胞鐵元素平衡。自噬可降解FTH1/FTL1復(fù)合物，釋放大量Fe2+，增加細(xì)胞內(nèi)鐵水平，促進(jìn)鐵死亡。鐵死亡是一種具有鐵依賴性的、通過(guò)細(xì)胞膜上過(guò)載的脂質(zhì)過(guò)氧化引發(fā)的細(xì)胞死亡方式［17］。鐵死亡的生物特征主要有細(xì)胞線粒體皺縮、嵴減少、膜密度升高、線粒體膜破裂增加、谷胱甘肽耗竭及細(xì)胞內(nèi)Fe2+和ROS 的聚積等［18］。脂質(zhì)過(guò)氧化的過(guò)程依賴于GPX4 的失活。PARK 等［19］研究發(fā)現(xiàn)，抑制GPX4表達(dá)可導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)發(fā)生鐵介導(dǎo)的過(guò)氧化反應(yīng)，從而誘導(dǎo)鐵死亡。HU等［20］發(fā)現(xiàn)，GPX4 可保護(hù)造血干細(xì)胞及祖細(xì)胞免受脂質(zhì)過(guò)氧化和鐵死亡。本研究結(jié)果提示，羅哌卡因作用于軟骨細(xì)胞后，可導(dǎo)致細(xì)胞中FTH1 表達(dá)減少，GPX4活性抑制，最終引發(fā)軟骨細(xì)胞發(fā)生鐵死亡。

綜上所述，羅哌卡因可誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞發(fā)生損傷，降低細(xì)胞活力，破壞細(xì)胞形態(tài)，增強(qiáng)氧化應(yīng)激，導(dǎo)致線粒體功能障礙，且作用呈劑量依賴性；羅哌卡因?qū)浌羌?xì)胞的損傷誘導(dǎo)作用可能與上調(diào)細(xì)胞自噬水平和誘導(dǎo)鐵死亡有關(guān)。然而，本研究為體外實(shí)驗(yàn)，羅哌卡因在體外和體內(nèi)的擴(kuò)散具有一定差異，后續(xù)我們將繼續(xù)進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn)來(lái)驗(yàn)證以上結(jié)論。