李玲玉，彭戴君，楊海生，朱絢麗，張雯雯，官 兵

甲狀腺癌(thyroid carcinoma, TC)是內分泌系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤[1]，以甲狀腺乳頭狀癌(papillary thyroid carcinoma, PTC)最常見，約占TC總數(shù)的80%[2]。盡管PTC具有惰性生物學行為，早期診斷和手術治療效果較好[3]。然而，TC一旦發(fā)生頸部淋巴結轉移，則嚴重影響患者的預后，復發(fā)的風險也隨之增加[4]。因此，探討PTC發(fā)生淋巴結轉移的機制具有重要意義。上皮-間葉轉化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)[5]是近年腫瘤領域的研究熱點，與腫瘤侵襲和轉移的機制相關[6-7]。TGF-β/Smad信號通路因與EMT密切關聯(lián)，而備受關注[8]。TGF-β超家族在調節(jié)細胞的生長、分化、凋亡、細胞外基質合成與沉積、胚胎發(fā)生、炎癥反應和器官纖維化中起重要作用[9]。其中，TGF-β1的含量最高，活性最強，并且在細胞侵襲、轉移的相關研究中應用較多[10-11]。本文著重分析TGF-β1介導的EMT在PTC增殖和侵襲中的作用，為臨床防治PTC發(fā)生淋巴結轉移提供新思路。

1 材料與方法

1.1 臨床資料收集2016～2021年上海市第六人民醫(yī)院金山分院存檔的44例PTC石蠟包埋標本，其中合并頸部淋巴結轉移的標本26例，無淋巴結轉移的標本18例。患者均經兩名病理醫(yī)師確診，均無糖尿病、高血壓、腦血管病等。患者術前均無其他系統(tǒng)惡性腫瘤，標本病理類型均為經典型乳頭狀癌亞型。

1.2 試劑人PTC細胞系BCPAP購自上海細胞庫；誘導因子rh-TGF-β1和rh-BMP7購自美國R&D公司。一抗E-cadherin(CST-14472, 1 ∶50)、vimentin(CST-5741, 1 ∶100)、TGF-β1(Santa Cruz, sc-146, 1 ∶100)、Smad2/3(Santa Cruz, sc-8332, 1 ∶50)、E-cadherin(CST-14472, 1 ∶1 000)、vimentin(Abcam,Ab92547, 1 ∶2 000)、N-cadherin(Abcam,Ab76011, 1 ∶5 000)、p-Smad2/3(Abcam-Ab254407, 1 ∶1 000)、Smad7(Proteintech, 2584-1-AP, 1 ∶1 000)、GAPDH(Proteintech, 60004-1-Lg, 1 ∶10 000)和IgG二抗(Beyotime, A0208, 1 ∶1 000)；引物設計與合成由上海生工公司完成；CCK-8試劑盒購自上海碧云天公司；TRIzol試劑購自美國Invitrogen公司；qRT-PCR試劑盒和ECL發(fā)光試劑盒購自美國Thermo公司；RIPA裂解液、BCA蛋白定量試劑盒，購自北京天根生化公司；RPMI 1640培養(yǎng)基和Transwell小室購自美國Corning公司。

1.3 方法

1.3.1免疫組化 標本均經10%中性福爾馬林固定，石蠟包埋、切片，其中PTC 44張、癌旁正常組織(normal tissues， NT)44張和有癌轉移淋巴結(metastatic lymph nodes, MLN)26張。免疫組化采用EnVision法染色，烤片，切片脫蠟及水化，EDTA抗原修復，阻斷內源性過氧化物酶，孵育一、二抗，DAB顯色，蘇木精復染，自來水返藍，梯度乙醇脫水干燥，樹膠封固。

1.3.2結果判讀 E-cadherin以細胞膜呈棕黃色顆粒為陽性，TGF-β1、vimentin以細胞質呈棕黃色顆粒為陽性，Smad2/3以細胞質或細胞核呈棕黃色顆粒為陽性。同時由兩名資深病理醫(yī)師根據(jù)陽性細胞的百分比和陽性細胞著色強度進行判讀。(1)根據(jù)陽性細胞百分比計分：陽性細胞數(shù)<1%為0分；1%～25%為1分；26%～50%為2分；51%～75%為3分；76%～100%為4分。(2)根據(jù)陽性細胞著色強度計分：未著色為0分；淡黃色為1分；棕黃色為2分；棕褐色為3分。兩項評分結果相乘：0～1分為陰性(-)；2～4分為弱陽性(+)；5～8分為強陽性()；9～12分為強陽性()。

1.3.3細胞培養(yǎng)與誘導因子處理 BCPAP細胞系用含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)基，置于37 ℃ 5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，實驗細胞均處于對數(shù)生長期。待細胞長到70%～80%融合狀態(tài)時，換無血清細胞培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h，添加誘導因子分為空白對照組(NC，PBS代替誘導因子)、rh-TGF-β1組(rh-TGF-β1濃度為10 ng/mL)、rh-TGF-β1+rh-BMP7組(10 ng/mL rh-TGF-β1+5ng/mL rh-BMP7)繼續(xù)培養(yǎng)48 h。

1.3.4CCK-8細胞增殖實驗 細胞鋪于96孔板，每孔鋪100 μL細胞，每個樣品設7個復孔，邊緣孔加入100 μL無菌水或者PBS。37 ℃ 5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。檢測前加入10 μL的CCK-8于孔中，2 h后，酶標儀于450 nm波長處檢測吸光度(optical density， OD)值。

1.3.5Transwell細胞侵襲實驗 收獲細胞，計數(shù)，調整細胞濃度為每毫升6×104個；在下室(即24孔板底部)加入700 μL含10%血清的培養(yǎng)基，上室加入500 μL細胞懸液，繼續(xù)在CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h。取出小室，吸干上室液體，移到預先加入約800 μL多聚甲醛的孔中，室溫固定30 min。取出小室，吸干上室固定液，移到預先加入約800 μL結晶紫染液的孔中，室溫染30 min。用清水沖洗浸泡數(shù)次，取出小室，吸去上室液體，擦去上室底部膜表面細胞。用小鑷子揭下膜，底面朝上晾干，移至載玻片上用中性樹膠封固。顯微鏡下取10個隨機視野計數(shù)，并進行統(tǒng)計。

1.3.6qRT-PCR 總RNA由TRIzol提取，通過逆轉錄試劑盒完成逆轉錄反應。引物Smad2上游引物：5′-TTCAGTTCCGCCTCCAATCG-3′，下游引物：5′-GCAAGCCACGCTAGGAAAAC-3′；Smad3上游引物：5′-ATGTCATCTACTGCCGCCTG-3′，下游引物：5′-TAGGGATTCACGCAGACCTC-3′；Smad7上游引物：5′-CCTTAGCCGACTCTGCGAA-3′，下游引物：5′-CCCTGTTTCAGCGGAGGAA-3′；N-cadherin上游引物：5′-GCCCAAGACAAAGAGACCCA-3′，下游引物：5′-TGGCCACTGTGCTTACTGAA-3′；vimentin上游引物：5′-AGTCCGCACATTCGAGCAAA-3′，下游引物：5′-AACTTACAGCTGGGCCATCG-3′；E-cadherin上游引物：5′-CCCAGGAGCCAGACACATTT-3′，下游引物：5′-TTAGGGCTGTGTACGTGCTG-3′。以互補DNA為模板，按照qRT-PCR說明書行定量PCR檢測，以GAPDH作為內部對照。采用2-ΔΔCt法分析qRT-PCR的數(shù)值；統(tǒng)計數(shù)據(jù)采用GraphPad PRISM 8.0軟件進行分析。

1.3.7Western blot實驗 用含有蛋白酶抑制劑的RIPA試劑，裂解BCPAP細胞提取總蛋白。應用NanoDrop 2000分光光度計測定所提取蛋白樣品的純度和濃度。取50 μg蛋白樣品進行SDS-PAGE凝膠電泳，轉移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜。用PVDF膜進行染色、封閉、孵育一、二抗，采用高靈敏ECL發(fā)光試劑盒進行顯色，化學發(fā)光成像分析系統(tǒng)曝光并采集圖片。

2 結果

2.1 不同甲狀腺組織中EMT標志物和TGF-β1、Smad2/3的表達本組對44例PTC、44例NT和26例MLN進行E-cadherin和vimentin的免疫組化檢測，E-cadherin在NT、PTC和MLN中表達水平評分平均值分別為12.00、5.60、5.52；vimentin在NT、PTC和MLN中表達水平評分平均值分別為4.00、9.00、9.52；與NT相比，PTC和MLN中E-cadherin表達水平下降，vimentin表達水平升高(圖1)。與NT相比，35例PTC中E-cadherin表達減少，并同時伴vimentin表達增加(79.5%，35/44)，21例MLN中E-cadherin表達減少(+)，并同時伴vimentin表達增加(～)(81%，21/26)，上皮標志物E-cadherin和間葉標志物vimentin的表達呈負相關，提示與正常甲狀腺濾泡相比，PTC和淋巴結轉移癌中均發(fā)生EMT現(xiàn)象。在PTC中TGF-β1和Smad2/3的陽性率分別為70.5%(31/44)和65.9%(29/44)，明顯高于NT中TGF-β1和Smad2/3的陽性率[20.5%(9/44)和18.2%(8/44)]，兩者相比差異有顯著性(P<0.01)。MLN中TGF-β1和Smad2/3的陽性率進一步升高，分別為76.9%(20/26)和69.2%(18/26)，但與PTC相比差異無統(tǒng)計學意義(圖1)。在31例TGF-β1陽性的PTC中有29例同時Smad2/3陽性，而在TGF-β1陰性的組織中Smad2/3也呈陰性，提示Smad2/3與TGF-β1的表達一致(Kappa=0.895，P<0.001)。

NTPTCMLNE-cadherinvimentinTGF-β1Smad2/3

2.2 TGF-β1對PTC細胞形態(tài)的影響三組細胞培養(yǎng)48 h后，用倒置顯微鏡觀察細胞形態(tài)學變化，與NC組相比，rh-TGF-β1組細胞間隙增大，細胞變得松散，離散成單個的細胞呈梭形、紡錘形，細胞由上皮樣形態(tài)向間葉形態(tài)發(fā)生轉變(圖2A)。

2.3 TGF-β1對PTC細胞增殖的影響三組細胞同時培養(yǎng)0、24、48、72 h后經CCK-8檢測，酶標儀檢測OD值。結果顯示：與NC組相比，rh-TGF-β1組細胞增殖能力明顯增強，rh-BMP7可以抑制TGF-β1的促細胞增殖能力，48 h的OD值為0.154、0.185、0.163，72 h的OD值為0.189、0.244、0.207，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.01，圖2B)。

圖2 TGF-β1對甲狀腺乳頭狀癌細胞形態(tài)、增殖和侵襲的影響：A.鏡下示rh-TGF-β1組細胞由上皮樣形態(tài)向間葉細胞形態(tài)轉變；B.CCK-8實驗示rh-TGF-β1組細胞增殖能力增強；C.Transwell實驗示rh-TGF-β1組細胞穿過小室基膜的細胞數(shù)增加；NC.空白對照組；*P<0.05，**P<0.01

2.4 TGF-β1對PTC細胞侵襲的影響與NC組相比，添加rh-TGF-β1組BCPAP細胞穿過小室基膜的細胞數(shù)量明顯增加(P=0.000 2)，說明TGF-β1可以明顯促進PTC細胞的侵襲。同時，添加rh-TGF-β1和rh-BMP7組細胞穿過基膜的數(shù)量比rh-TGF-β1組明顯減少(P=0.024 2)，提示BMP7可以抑制TGF-β1的促細胞侵襲作用，差異均有統(tǒng)計學意義(圖2C)。

2.5 TGF-β1對PTC細胞EMT標志物和TGF-β/Smad信號通路標志物在mRNA水平表達的影響qRT-PCR結果顯示：TGF-β1可以增加TGF-β/Smad信號通路標志物Smad2(1.229±0.016)、Smad3(2.208±0.084)的表達，BMP7可以抑制Smad2(1.016±0.171)、Smad3(1.080±0.185)的表達，上調Smad7(1.729±0.084)的表達(P<0.05，圖3A)。TGF-β1可以誘導上皮標志物E-cadherin(0.525±0.029)的下調和間葉標志物vimentin(1.974±0.194)、N-cadherin(1.590±0.166)的上調，而BMP7可以抑制TGF-β1促EMT作用(P<0.05，圖3B)，

2.6 TGF-β1對PTC細胞EMT標志物和TGF-β/Smad信號通路標志物在蛋白質水平表達的影響Western blot實驗結果顯示：TGF-β1可以增加p-Smad2/3(0.669±0.022)的表達，BMP7可以抑制p-Smad2/3(0.551±0.032)，上調抑制性蛋白Smad7(1.106±0.088)的表達(P<0.05，圖3C)。TGF-β1可以誘導上皮標志物E-cadherin(0.254±0.009)的下調和間葉標志物vimentin(0.473±0.062)、N-cadherin(0.404±0.018)的上調，BMP7可以抑制TGF-β1促EMT作用(P<0.05，圖3D)。

圖3 TGF-β1對甲狀腺乳頭狀癌細胞EMT標志物和TGF-β/Smad信號通路標志物表達的影響：A.qRT-PCR檢測TGF-β1與TGF-β/Smad信號通路標志物Smad2、Smad3的關系；B.qRT-PCR檢測TGF-β1與上皮標志物E-cadherin和間葉標志物vimentin、N-cadherin的關系；C.Western blot法檢測TGF-β1與Smad7、p-Smad2/3表達的關系；D.Western blot法檢測TGF-β1與上皮標志物E-cadherin和間葉標志物vimentin、N-cadherin的關系；NC.空白對照組；ns.差異無統(tǒng)計學意義；*P<0.05，**P<0.01

3 討論

PTC是TC中最常見的病理類型，約占TC的80%。PTC雖然具有惰性生物學行為，經過合理的診斷和治療預后良好，但仍有較多的PTC患者，尤其是合并淋巴結和遠處轉移的患者，易復發(fā)且預后不良，嚴重影響患者的生活質量[12]。淋巴結轉移作為PTC高侵襲性的臨床病理特征之一，與PTC的局部復發(fā)和遠處轉移密切相關[13]，研究PTC侵襲和轉移的分子機制，對于早期識別合并淋巴結轉移的PTC，及時確定其有效的診斷和治療措施具有重要意義。

EMT是指具有極性的上皮細胞發(fā)生表型改變，轉化為具有游走能力的間葉細胞的過程，因此認為EMT與細胞的侵襲和轉移密切相關[14]。EMT的主要分子學標志是上皮標志物E-cadherin的表達下降和間葉標志物vimentin、N-cadherin等的表達上調[15]。本組首先收集PTC患者的石蠟標本，檢測其EMT標志物的表達，實驗結果顯示與NT相比，PTC和MLN中分別有79.5%(35/44)和81%(21/26)病例中E-cadherin的表達減少，并伴vimentin的表達增加，提示PTC中存在EMT現(xiàn)象。本組檢測石蠟切除標本中TGF-β1和Smad2/3的表達，實驗結果顯示：與NT相比，PTC和MLN中TGF-β1和Smad2/3的陽性率明顯升高，提示TGF-β1和Smad通路蛋白在PTC的淋巴結轉移中發(fā)揮重要作用。

Kaimori等[16]將體外培養(yǎng)的小鼠肝細胞中加入TGF-β1誘導因子，發(fā)現(xiàn)小鼠肝細胞向間充質細胞的形態(tài)改變，并且檢測到其上皮標志物E-cadherin的表達下降，而間葉標志物vimentin、FSP-1等的表達升高，提示TGF-β1可以在體外誘導細胞發(fā)生EMT。國內外關于EMT的研究多將TGF-β1作為誘導因子[17-19]。由于TGF-β/Smad通路與EMT過程密切相關[20-23]，本組將TGF-β/Smad通路作為TGF-β1誘導PTC細胞發(fā)生EMT的主要信號轉導途徑進行分析。TGF-β/Smad信號轉導途徑[24]：TGF-β與細胞膜上的TβRⅡ結合，激活TβRⅠ，TβRⅠ使細胞內質核轉導分子Smad2/3磷酸化，磷酸化后的Smad2/3與Smad4形成三聚體復合物進入細胞核，與其他信號轉導分子共同調節(jié)目的基因轉錄。Smad7是抑制型Smad，能夠抑制Smad2/3的磷酸化，阻斷R-Smads的信號轉導[25]。BMP7與TGF-β1在結構上有諸多相似[26]，可通過阻斷TGF-β/Smad信號通路的轉導過程，增加Smad7的表達抑制TGF-β1的作用[27]。因此，本實驗中將BMP7用作TGF-β/Smad信號通路的抑制因子。本課題組在體外細胞實驗中設置NC組、rh-TGF-β1組和rh-TGF-β1+rh-BMP7組，采用CCK-8法檢測細胞增殖能力，應用Transwell實驗檢測細胞侵襲能力，用qRT-PCR和Western blot法檢測EMT標志物E-cadherin、N-cadherin、vimentin的表達變化和Smad通路標志物Smad2、Smad3、Smad7、p-Smad2/3的表達水平。實驗結果顯示：TGF-β1可誘導BCPAP細胞由上皮樣形態(tài)向間葉形態(tài)轉變，明顯增強其增殖和侵襲能力，并且誘導上皮標志物E-cadherin的下調和間葉標志物vimentin、N-cadherin的上調，從而促進細胞發(fā)生EMT，BMP7可以抑制TGF-β1促細胞增殖、侵襲及EMT的作用。TGF-β1可以促使Smad2、Smad3及p-Smad2/3的水平升高，BMP7可以抑制Smad2、Smad3的表達及Smad2/3蛋白的磷酸化，增加抑制型蛋白Smad7的表達，提示BMP7通過作用于TGF-β/Smad信號通路抑制TGF-β1。本實驗結果只在一種PTC細胞系中得到驗證，后續(xù)需進一步在多細胞系和實驗動物中驗證。

綜上所述，PTC及其淋巴結轉移標本發(fā)生EMT現(xiàn)象且TGF-β1和Smad2/3呈高表達；TGF-β1通過TGF-β/Smad信號通路介導EMT，促進PTC的侵襲和淋巴結轉移。本組結果對早期診斷有淋巴結轉移和侵襲性傾向的PTC患者具有重要的臨床意義，也為尋找預防和治療PTC轉移的新靶點提供理論依據(jù)。