苗婷婷，胡澆澆，鄭士耀，孫 暢，楊 銘，曹玉文,，王良海,，胡建明,，沈西華，楊 蘭,

食管癌是消化系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤，主要有兩種組織學(xué)類型：食管腺癌和食管鱗狀細胞癌(esophageal squamous cell carcinoma, ESCC)[1-2]。我國食管癌主要以ESCC為主，患者預(yù)后差[3-5]。目前，靶向治療為ESCC的治療帶來了希望，但其預(yù)后效果仍然不佳。因此，尋找ESCC患者新的預(yù)后生物學(xué)標志物可能會為靶向治療提供新思路。細胞焦亡也稱為炎癥性死亡，是一種由半胱天冬氨酸蛋白酶-1(caspase-1)介導(dǎo)激活，并通過切割gasdermin(GSDM)家族蛋白，使質(zhì)膜穿孔，同時伴隨炎性分子釋放和免疫系統(tǒng)激活的細胞死亡方式[6-7]。有文獻報道，細胞焦亡相關(guān)基因(pyroptosis-related genes, PRG)在多種腫瘤的進展和預(yù)后中起重要作用[8-9]。然而，關(guān)于PRG在ESCC組織中的表達及預(yù)后的研究較少。本文通過生物信息學(xué)法分析ESCC組織和正常食管黏膜組織中差異表達的PRG，探討其與ESCC患者預(yù)后的關(guān)系，并運用體外實驗對與ESCC患者預(yù)后相關(guān)的差異表達PRG基因進行驗證和功能研究，為ESCC患者診斷、鑒別診斷及預(yù)后提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)來源從TCGA數(shù)據(jù)庫(https: // portal. gdc. cancer. gov/)和GTEx數(shù)據(jù)庫(http: // www. gtexportal. Org / home/)中獲取82例人ESCC組織和82例人正常食管黏膜組織的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)及患者的臨床資料，包括ESCC患者ID號、性別、年齡、生存狀態(tài)、生存時間、臨床分期和腫瘤分級等。

1.2 細胞系及試劑人ESCC細胞系(KYSE-30、Eca-109、EC9706、KYSE-150、TE-1、KYSE-410)、人食管上皮細胞系HET-1A，均購自中國科學(xué)院上海細胞庫。KYSE-30專用培養(yǎng)基購自武漢普諾賽公司，RPMI-1640培養(yǎng)基、胎牛血清均購自美國Gibco公司。GSDMC siRNA和陰性對照siRNA(negative control siRNA, NC siRNA)質(zhì)粒，由上海吉瑪基因公司設(shè)計和合成。轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000購自美國Thermo Fisher公司；RNA提取試劑盒購自美國Omega公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒為美國Thermo Fisher公司；實時定量PCR試劑盒購自德國凱杰生物公司；CCK-8試劑盒購自日本同仁化學(xué)研究所。

1.3 差異表達PRG的篩選從Pubmed、中國知網(wǎng)和萬方等數(shù)據(jù)庫中下載并閱讀細胞焦亡相關(guān)文獻[10-14]，合計有33個PRG。用R軟件“Limma”和“DESeq2”提取ESCC和正常食管黏膜組織中PRG的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，篩選差異表達的PRG，同時以log2FC>0.5和P<0.001為篩選標準，進一步繪制熱圖和條形圖。

1.4 差異表達PRG和ESCC患者預(yù)后分析運用R軟件“Limma”從TCGA數(shù)據(jù)庫中提取ESCC患者的生存時間和生存狀態(tài)(95例患者有64例生存，31例死亡)。用R軟件“Survival”對差異表達的PRG與ESCC患者的生存時間進行Cox單因素、多因素回歸分析，獲得ESCC患者不良預(yù)后的獨立危險因素，并繪制森林圖。

1.5 細胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染KYSE-30細胞使用專用細胞基，其余細胞系均使用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基，在37 ℃、5% CO2的細胞培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。收集對數(shù)生長期的KYSE-30細胞，按照每孔4×105個細胞的數(shù)量接種于6孔板。待細胞融合度約為60%時，采用Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑分別將GSDMC siRNA和 NC siRNA轉(zhuǎn)染到細胞中，7 h后更換培養(yǎng)基，48 h后收集細胞用于后續(xù)實驗。GSDMC-Homo-960、GSDMC-Homo-1740和GSDMC-Homo-1244合計3對siRNA及1對無任何靶基因的NC siRNA，引物均由上海吉瑪基因公司合成(表1)。

表1 GSDMC siRNA候選序列

1.6 qRT-PCR檢測按照RNA提取試劑盒說明書提取RNA，并測定RNA濃度，通過逆轉(zhuǎn)錄得到相應(yīng)的cDNA，隨后進行qRT-PCR檢測，每個樣本同時擴增3個復(fù)管，并連續(xù)進行3次重復(fù)實驗，采用2-△△Ct法計算目的基因表達量，引物由上海吉瑪公司合成(表2)。

表2 qRT-PCR引物序列

1.7 CCK-8法檢測細胞活力常規(guī)培養(yǎng)si-GSDMC組和si-NC組KYSE-30細胞，選取生長狀態(tài)良好的兩組細胞以每孔3×103個細胞接種于96孔板，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱常規(guī)孵育過夜，收集1～5天的細胞，在避光條件下每孔加入10 μL CCK-8溶液，將培養(yǎng)板置于培養(yǎng)箱內(nèi)孵育2 h，酶標儀檢測450 nm處的吸光度(OD)值。

1.8 平板克隆實驗檢測細胞增殖將細胞以每孔 2×103個分別接種于6孔板，用KYSE-30細胞專用培養(yǎng)基在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)，10天后PBS清洗3次。經(jīng)4%多聚甲醛固定30 min，PBS清洗3次；用0.1%結(jié)晶紫染色20 min，PBS清洗；采集圖像并計數(shù)平板克隆形成數(shù)。

1.9 腫瘤免疫評估資源(TIMER)數(shù)據(jù)庫分析使用TIMER數(shù)據(jù)庫分析差異表達PRG的表達水平，與食管癌免疫微環(huán)境中免疫細胞浸潤水平的相關(guān)性。

2 結(jié)果

2.1 ESCC組織中PRG的表達從TCGA和GTEx數(shù)據(jù)庫下載82例ESCC組織和82例正常食管黏膜組織的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，篩選并分析33個PRG的mRNA表達，從中選出23個差異表達的PRG。其中，GSDMC、CASP5、NLRP6、IL-1β、TNF和PYCARD等13個基因在ESCC組織中表達上調(diào)，PRKACA、PLCG1、NOD1和GSDMD等10個基因在ESCC組織中表達下調(diào)(P<0.001，圖1)。

圖1 差異表達的PRG：A.差異表達的PRG熱圖，紅色代表高表達，綠色代表低表達；B.差異表達的PRG條形圖；***P<0.001

2.2 差異表達PRG與ESCC患者預(yù)后分析Cox單因素回歸模型分析：差異表達PRG中的CASP5(HR=4.065 3，95%CI: 1.477 3～11.187 5，P=0.006 6)和GSDMC(HR=1.096 0，95%CI: 1.036 6～1.158 8，P=0.001 3)基因的表達水平與ESCC預(yù)后相關(guān)(圖2A)。Cox多因素回歸模型分析：GSDMC(HR=1.080 1，95%CI: 1.022 3～1.141 2，P=0.006 0)基因是ESCC患者不良預(yù)后的獨立危險因素(圖2B)。

圖2 差異表達PRG與食管鱗狀細胞癌患者預(yù)后分析：A.Cox單因素回歸模型分析；B.Cox多因素回歸模型分析

2.3 ESCC細胞株中GSDMC mRNA的表達qRT-PCR檢測顯示，與正常食管上皮細胞HET-1A(1.15±0.62)相比，GSDMC mRNA表達水平在食管癌細胞株EC9706(4.13±1.00)、Eca-109(5.01±2.17)、KYSE410(12.98±1.49)、TE-1(3.81±0.96)、KYSE-150(9.78±3.51)和KYSE-30(25.01±4.09)細胞中上調(diào)(P均<0.001，圖3)，其上調(diào)趨勢與TCGA數(shù)據(jù)庫中的RNAseq數(shù)據(jù)一致。由于GSDMC基因在KYSE-30細胞系表達相對較高，故選擇其進行下一步實驗。

圖3 qRT-PCR實驗檢測GSDMC mRNA在正常食管上皮細胞和食管鱗狀細胞癌細胞中的表達：*P<0.05，***P<0.001

2.4 敲低GSDMC mRNA對ESCC細胞活力、克隆形成能力和凋亡的影響

2.4.1si-GSDMC篩選 qRT-PCR檢測顯示，轉(zhuǎn)染GSDMC-Homo-960、GSDMC-Homo-1740及GSDMC-Homo-1244 siRNA的KYSE-30細胞中GSDMC mRNA表達量有不同程度的降低，與si-NC(1.00±0.08)相比，其中轉(zhuǎn)染GSDMC-Homo-1244(0.27±0.11)的抑制效果最明顯(t=9.355，P<0.001，圖4)，將其用于后續(xù)實驗。

圖4 qRT-PCR實驗檢測敲低GSDMC mRNA的KYSE-30細胞中GSDMC mRNA表達水平：***P<0.001

2.4.2轉(zhuǎn)染si-GSDMC檢測ESCC細胞活力、平板克隆能力和凋亡 本組CCK-8、平板克隆實驗及qRT-PCR檢測顯示，與si-NC組相比，si-GSDMC組ESCC細胞活力在轉(zhuǎn)染后第1～5天均降低，其中第4天降低最明顯[OD值：(1.73±0.07)vs(1.10±0.09),t=13.55,P<0.001] ，si-GSDMC組ESCC細胞克隆形成能力降低[克隆形成數(shù)目：(686±94.30)vs(377±77.31),t=4.389，P<0.05，圖5、6)，凋亡能力增強[Bax：(1.00±0.08)vs(6.43±0.75)，t=12.51;BCL-2：(1.05±0.06)vs(0.26±0.12)，t=10.06，P均<0.001，圖7]。

圖5 CCK-8實驗檢測敲低GSDMC對KYSE-30細胞增殖能力的影響：**P<0.01，***P<0.001

圖6 平板克隆實驗檢測敲低GSDMC對KYSE-30細胞克隆形成能力的影響：A.轉(zhuǎn)染si-NC后，KYSE-30細胞的克隆形成能力；B.轉(zhuǎn)染si-GSDMC后，KYSE-30細胞的克隆形成能力；C.敲低GSDMC后，KYSE-30細胞克隆形成能力的統(tǒng)計圖,*P<0.05

圖7 qRT-PCR實驗檢測敲低GSDMC對KYSE-30細胞中Bax和BCL-2表達的影響：***P<0.001

2.5 TIMER數(shù)據(jù)庫分析運用TIMER數(shù)據(jù)庫初步分析GSDMC mRNA表達與食管癌免疫細胞浸潤水平之間的相關(guān)性。結(jié)果表明：GSDMC的mRNA表達與B細胞(r=-0.317，P=1.58e-05)、巨噬細胞(r=-0.252，P=6.48e-04)、CD8+T細胞(r=-0.15，P=4.44e-02)的浸潤程度呈負相關(guān)，與樹突狀細胞(r=0.353，P=1.16e-06)、中性粒細胞(r=0.287，P=9.40e-05)的浸潤程度呈正相關(guān)(圖8)。

3 討論

細胞焦亡是近期發(fā)現(xiàn)的一種程序性細胞死亡方式[15]。有文獻報道，PRG與多種惡性腫瘤具有相關(guān)性[12]。如Feng等[16]研究發(fā)現(xiàn)，黑色素瘤缺乏因子2(absent in melanoma 2, AIM2)炎性小體在胃癌組織和細胞中高表達，且促進胃癌細胞的增殖和遷移。此外，有文獻報道GSDMD蛋白在非小細胞肺癌中表達上調(diào)，是肺腺癌的獨立預(yù)后標志物，與腫瘤大小、TNM分期等有關(guān)[17]。本實驗通過查閱文獻獲得33個PRG，并以此為基礎(chǔ)展開分析。首先，對TCGA和GTEx數(shù)據(jù)庫下載的ESCC和正常食管黏膜組織中33個PRG的mRNA表達水平進行分析，獲得23個差異表達基因；提示這些差異表達PRG在ESCC中起重要作用。其次，進一步對差異表達PRG進行Cox單因素回歸分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)GSDMC和CASP5基因與ESCC患者預(yù)后相關(guān)。最后，Cox多因素回歸分析表明，GSDMC是ESCC患者的獨立預(yù)后生物學(xué)標志物。

GSDMC是GSDM家族中的一員，廣泛表達于食管、胃、腸、氣管和皮膚中，其N端結(jié)構(gòu)域能夠誘導(dǎo)細胞發(fā)生焦亡[18]。有研究報道GSDMC在多種腫瘤的發(fā)生和預(yù)后中發(fā)揮重要作用，如GSDMC過表達能誘導(dǎo)乳腺癌細胞焦亡，且與乳腺癌患者生存期低有關(guān)[19]。在結(jié)直腸癌細胞中，GSDMC可能通過抑制TGF-β Ⅱ型受體的活性促進細胞增殖和腫瘤形成[20]。Yan等[21]研究表明在胰腺癌組織中GSDMC表達上調(diào)，與患者預(yù)后不良相關(guān)。此外，在胃癌細胞中GSDMC可能是一種潛在的腫瘤抑制因子，能夠抑制胃癌細胞生長[22]。本組通過體外實驗發(fā)現(xiàn)GSDMC在ESCC細胞中高表達，敲低GSDMC后能夠抑制ESCC細胞的增殖和克隆形成能力，促進凋亡。

最近研究表明腫瘤細胞發(fā)生焦亡時，釋放多種趨化因子和炎癥因子，產(chǎn)生強烈的炎癥反應(yīng)，參與腫瘤免疫微環(huán)境的調(diào)節(jié)[23]。Xu等[24]通過生物信息學(xué)分析和實驗驗證，發(fā)現(xiàn)在乳腺癌中GSDMC高表達與乳腺癌患者的不良預(yù)后和免疫浸潤細胞相關(guān)。此外，有研究者在肝細胞癌中發(fā)現(xiàn)GSDME能夠促進CD8+T 細胞和B細胞的浸潤，為腫瘤提供炎性微環(huán)境，從而參與肝細胞癌的抗腫瘤免疫[25]。本組運用TIMER數(shù)據(jù)庫進一步分析GSDMC基因表達與食管癌免疫微環(huán)境的關(guān)系，結(jié)果顯示GSDMC基因表達水平與食管癌B細胞、CD8+T細胞和巨噬細胞浸潤程度呈負相關(guān)，提示GSDMC高表達的食管癌患者體液免疫和細胞免疫過程減弱。故推測高表達GSDMC的ESCC患者預(yù)后不良，可能是由于抗腫瘤免疫水平減弱導(dǎo)致的。

本文通過TCGA和GTEx數(shù)據(jù)庫運用生物信息學(xué)篩選出與ESCC患者預(yù)后相關(guān)的差異表達PRG，并通過體外實驗進一步驗證了相關(guān)基因在ESCC細胞中的表達和生物學(xué)功能。結(jié)果顯示：GSDMC基因在ESCC組織和細胞中高表達，與ESCC患者預(yù)后不良相關(guān)，且高表達GSDMC的ESCC患者免疫細胞浸潤水平降低。GSDMC基因有望成為ESCC新的預(yù)后生物學(xué)標志物，并參與免疫細胞的浸潤，為ESCC患者的靶向治療及預(yù)后提供參考。