劉新亮 戴小英 張?jiān)骆?章挺

(江西省林業(yè)科學(xué)院，南昌，330032)

The effects of different plant growth regulators on callus induction, adventitious bud induction, strong seedling culture and rooting culture were studied with MS as basic medium and new branches germinated from axillary buds of young stems of Cinnamomum porrectum as explants. The optimum medium for callus induction was MS added with 1.0 mg/L 6-benzylaminopurine (6-BA) and 0.2 mg/L 2,4-dichlorophenoxyacetic acid (2,4-D), and the induction rate reached 90.00%. 6-BA and thifenuron (TDZ) play key role in the induction of adventitious buds of C. porrectum. The optimal combination of growth regulators to induce adventitious buds was MS supplemented with 1.0 mg/L 6-BA, 0.8 mg/L TDZ, and 0.05 mg/L naphthylacetic acid (NAA), the induction rate was 89.17%, and the number of adventitious buds was 49.27. Adding vitamin C (VC) and vitamin B2 (VB2) to adventitious bud subculture medium could effectively inhibit browning. The optimum combination was added with 0.5 mg/L 6-BA, 0.05 mg/LNAA, 15 mg/L VC, and 20 mg/L VB2. The most suitable combination for strong seedling culture before rooting was added with 0.2 mg/L 6-BA, 0.05 mg/L NAA, 15 mg/L VC, 20 mg/L VB2, and 15 g/L banana puree (BH). The rooting effect was the best in the medium of 1/2 MS added with 1.0 mg/L IBA and 0.5 mg/L NAA, and the rooting rate was 85.33%.

黃樟(Cinnamomumporrectum(Roxb.) Kosterm)屬樟科(Lauraceae)樟屬(Cinnamomum)植物，主要分布于長(zhǎng)江以南各省區(qū)[1]。黃樟的根、莖、葉、枝均富含精油，是我國(guó)開(kāi)發(fā)天然香料的重要木本精油植物資源之一[2]。黃樟不同個(gè)體間精油含量及主要成分存在較大差異，其精油的多樣性與多功能性符合國(guó)際上對(duì)日化用品在純天然、功能性等方面的需求，具有重要的開(kāi)發(fā)利用價(jià)值和市場(chǎng)潛力。自然界中，黃樟呈小規(guī)模居群散生，加之20世紀(jì)50年代前后“掘根截桿”方式的開(kāi)發(fā)，造成了黃樟資源較大程度的破壞，可開(kāi)發(fā)利用資源極少[3]。黃樟個(gè)體間或世代間精油性狀顯著變異，其精油成分與化學(xué)型研究常根據(jù)單個(gè)種群甚或單株來(lái)源，現(xiàn)有資源不足以滿足其在香精香料產(chǎn)業(yè)發(fā)展中的應(yīng)用，制約了不同化學(xué)型黃樟精油資源的開(kāi)發(fā)利用[4-5]。目前黃樟優(yōu)良種質(zhì)的規(guī)?；敝撤绞街饕獮榍げ宸敝?，隨著可持續(xù)發(fā)展理念的貫徹，創(chuàng)新高效繁育方法已成為當(dāng)今黃樟天然香料產(chǎn)業(yè)發(fā)展的重中之重。

植物組織培養(yǎng)具有繁殖系數(shù)高、育苗周期短、不受外界環(huán)境限制等特點(diǎn)，在種質(zhì)資源保存、大量繁殖方面具有明顯優(yōu)勢(shì)，廣泛應(yīng)用于植物新優(yōu)特種質(zhì)資源的保護(hù)和規(guī)?；敝砙6]。利用組織培養(yǎng)技術(shù)繁殖黃樟優(yōu)良種質(zhì)資源，是解決短期內(nèi)規(guī)?；敝滁S樟種苗有效方法之一，對(duì)提升生產(chǎn)中精油品質(zhì)具有重要意義。植物的離體再生途徑包括腋芽萌發(fā)途徑、間接器官發(fā)生途徑和體細(xì)胞發(fā)生途徑[7]。目前，關(guān)于黃樟組織培養(yǎng)的研究?jī)H限利用帶芽莖段為外植體直接發(fā)生方式繁殖，屬以腋芽萌發(fā)為基礎(chǔ)的離體培養(yǎng)，繁殖系數(shù)較低，關(guān)于誘導(dǎo)愈傷組織分化不定芽獲取再生植株的間接器官發(fā)生途徑研究尚未見(jiàn)報(bào)道[8-9]。相對(duì)于黃樟腋芽萌發(fā)途徑，間接器官發(fā)生途徑具有取材少、再生性強(qiáng)、增殖率高、重復(fù)性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，是保存黃樟優(yōu)良種質(zhì)資源和大規(guī)模擴(kuò)繁的有效途徑，再生體系還可為其遺傳轉(zhuǎn)化及體細(xì)胞雜交奠定基礎(chǔ)。本研究以江西省黃樟良種“贛檸3號(hào)”半木質(zhì)化莖段為材料，通過(guò)運(yùn)用多種植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑和有機(jī)添加物配比進(jìn)行組織培養(yǎng)，誘導(dǎo)產(chǎn)生愈傷組織和不定芽，建立黃樟高頻再生體系，為其下一步的遺傳轉(zhuǎn)化和開(kāi)發(fā)利用提供參考。

1 材料和方法

試驗(yàn)材料：采自江西省林業(yè)科學(xué)院黃樟基因資源庫(kù)(27°53′N(xiāo)，116°47′E)的江西省黃樟良種“贛檸3號(hào)”2年生扦插苗。

無(wú)菌芽體獲取：2020年7月中旬，選擇黃樟單株上當(dāng)年生半木質(zhì)化莖枝為初始試材，用剪刀去除葉片后剪成10 cm左右小段，先用毛筆蘸清洗液刷洗表面污垢，后用清水洗去清洗液，放入空瓶，瓶口用紗布包扎，置流水下沖洗2 h左右，拿超凈工作臺(tái)上用體積分?jǐn)?shù)75%酒精消毒45 s，后用質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1%的氯化汞試劑處理6 min，倒出，加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%的鹽酸溶液搖蕩1 min，倒出，加入無(wú)菌水搖動(dòng)沖洗5～6次，消毒處理后的材料用鑷子取出，放在消毒好托盤(pán)濾紙上吸干水，一手用鑷子捏住莖段，一手用消過(guò)毒的刀片切除莖段兩端以及葉柄，分成帶1～2個(gè)腋芽的小段，接種到啟動(dòng)培養(yǎng)基(MS培養(yǎng)基)中。

愈傷組織誘導(dǎo)：待啟動(dòng)培養(yǎng)基中莖段腋芽萌發(fā)至1～2 cm時(shí)，去除葉片，將腋芽萌發(fā)的莖枝切成長(zhǎng)短為0.5 cm左右的不帶芽小段，接入愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基，莖段平貼培養(yǎng)基表面(圖1A)，探索不同植物生長(zhǎng)劑種類(lèi)及質(zhì)量濃度對(duì)莖節(jié)間段誘導(dǎo)愈傷組織的最適宜培養(yǎng)配方。以MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，添加不同配比的6-芐氨基嘌呤(6-BA，0.5、1.0、2.0 mg/L)和2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D，0、0.1、0.2 mg/L)，采用2因素3水平完全隨機(jī)設(shè)計(jì)，篩選出適合愈傷組織誘導(dǎo)的植物生長(zhǎng)劑質(zhì)量濃度最佳配比[10]。每個(gè)培養(yǎng)皿接種8個(gè)莖間段、每個(gè)處理接種5個(gè)皿，重復(fù)3次，30 d后統(tǒng)計(jì)莖間段愈傷組織誘導(dǎo)情況。愈傷組織誘導(dǎo)率=(誘導(dǎo)出愈傷組織的莖段數(shù)/接種的莖段數(shù))×100%。

愈傷組織分化不定芽培養(yǎng)：挑選微黃愈傷組織團(tuán)接種到愈傷組織分化不定芽的培養(yǎng)基，以MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，添加不同配比的6-BA、萘乙酸(NAA)和噻苯隆(TDZ)，采用3因素4水平正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)(L16(43)，表1)，試驗(yàn)編號(hào)1～16。每個(gè)瓶中放5團(tuán)0.3～0.4 mm大小愈傷組織，每個(gè)處理5瓶，重復(fù)3次。30 d后統(tǒng)計(jì)愈傷組織發(fā)生脫分化形成不定芽的生長(zhǎng)情況。愈傷組織分化率=(發(fā)生分化不定芽的愈傷組織團(tuán)數(shù)/接入的愈傷組織團(tuán)總數(shù))×100%。

表1 愈傷組織分化不定芽培養(yǎng)正交試驗(yàn)各影響因素質(zhì)量濃度梯度設(shè)計(jì)

繼代培養(yǎng)過(guò)程不定芽增殖及防褐化：將愈傷組織已經(jīng)分化的不定芽團(tuán)接種到繼代培養(yǎng)基中進(jìn)行增殖及防褐化培養(yǎng)，所用培養(yǎng)基為“MS培養(yǎng)基1 L+6-BA0.5 mg+NAA0.05 mg+維生素C(VC，5、10、15 mg)+維生素B2(VB2，10、20、30 mg)”，添加VC和VB2采用2因素3水平完全隨機(jī)設(shè)計(jì)。每瓶插8個(gè)芽團(tuán)，每個(gè)處理5瓶，重復(fù)3次。30 d后觀察不定芽團(tuán)生長(zhǎng)情況，統(tǒng)計(jì)褐化率。褐化率=(發(fā)生褐化的不定芽數(shù)/接入不定芽總數(shù))×100%。

不定芽壯苗培養(yǎng)：使用培養(yǎng)基“MS培養(yǎng)基1 L+6-BA0.2 mg+NAA0.05 mg+VC15 mg+VB220 mg+香蕉泥(BH，0、5、10、15、20、30 g)”開(kāi)展壯苗試驗(yàn)[11]。選擇10個(gè)芽為1叢，每瓶接種4叢，每個(gè)處理10瓶，重復(fù)3次，30 d后觀察不定芽生長(zhǎng)的情況，測(cè)量芽高并統(tǒng)計(jì)有效芽(芽高>3 cm)數(shù)量。

莖芽的根系誘導(dǎo)：經(jīng)壯苗培養(yǎng)后，在不定芽叢中剪取3～4 cm長(zhǎng)度的莖枝放入生根培養(yǎng)基中，以0.5倍的MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，添加不同配比的NAA(0.2、0.5、1.0 mg/L)和吲哚丁酸(IBA，0.2、0.5、1.0 mg/L)，采用2因素3水平完全隨機(jī)設(shè)計(jì)。每瓶插入10段，每個(gè)處理5瓶，重復(fù)3次，25 d后觀察生長(zhǎng)狀況并統(tǒng)計(jì)生根數(shù)量。生根率=(生根的株數(shù)/接入生根誘導(dǎo)總株數(shù))×100%。

培養(yǎng)條件：培養(yǎng)基中均添加蔗糖30 g/L和卡拉膠5.0 g/L，生根培養(yǎng)基添加活性炭0.2～0.3 g/L，pH為5.6～5.8，培養(yǎng)溫度為(25±2)℃，光照強(qiáng)度2 500 lx，光照時(shí)間14 h/d。

數(shù)據(jù)處理：采用Excel 2016進(jìn)行數(shù)據(jù)處理、制表，采用SPSS 19.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析和顯著性檢驗(yàn)(Duncan’s新復(fù)極差法)。愈傷組織誘導(dǎo)率、愈傷組織分化率、褐化率及生根率經(jīng)反正弦轉(zhuǎn)換后再進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)黃樟愈傷組織誘導(dǎo)的影響

植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)黃樟莖段愈傷組織誘導(dǎo)的影響見(jiàn)表2。不同生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑組合處理的愈傷組織產(chǎn)生時(shí)間不同，在未添加2,4-D的情況下(處理1、處理4和處理7)，莖段未產(chǎn)生愈傷組織，在30 d時(shí)莖段由硬變松軟；在同時(shí)添加6-BA和2,4-D的培養(yǎng)基中均能成功誘導(dǎo)出愈傷組織(圖1B)。方差分析結(jié)果表明，各處理間愈傷組織誘導(dǎo)率的差異達(dá)到了顯著水平，6-BA和2,4-D對(duì)莖段愈傷組織誘導(dǎo)率的影響及其互作作用均達(dá)到了顯著水平(p<0.05)。處理9條件下莖段愈傷組織誘導(dǎo)產(chǎn)生時(shí)間最早(7 d)，愈傷組織誘導(dǎo)率最高，達(dá)到了95.80%，顯著高于處理8外的其他處理(p<0.05)。但該處理下產(chǎn)生的愈傷組織生長(zhǎng)狀態(tài)過(guò)于松軟，組織透明或組織上出現(xiàn)晶狀白色小點(diǎn)，隨培養(yǎng)時(shí)間的增長(zhǎng)，組織褐變失去活性。處理6條件下的莖段在10 d左右即可產(chǎn)生愈傷組織，愈傷組織誘導(dǎo)率達(dá)到了90.00%，雖顯著低于處理9，但其愈傷組織生長(zhǎng)狀態(tài)最佳，愈傷組織偏緊密，兩端鼓起性狀如小啞鈴，顏色淡黃，表面組織凸起，保存活性時(shí)間最長(zhǎng)。因此，“MS培養(yǎng)基1 L+6-BA1.0 mg+2,4-D0.2 mg”是適宜莖段誘導(dǎo)產(chǎn)生愈傷組織的最佳培養(yǎng)基。

表2 不同質(zhì)量濃度植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑下黃樟莖段愈傷組織誘導(dǎo)情況

2.2 不同生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的組合對(duì)不定芽誘導(dǎo)的影響

莖段誘導(dǎo)的愈傷組織繼代培養(yǎng)2次后，選擇顏色微黃、結(jié)構(gòu)松散的愈傷組織轉(zhuǎn)接入不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)。愈傷組織在不同植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑組合的培養(yǎng)基中分化不定芽的數(shù)量及生長(zhǎng)情況見(jiàn)表3。不同生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑配比處理對(duì)黃樟愈傷組織分化率和每團(tuán)愈傷組織分化不定芽數(shù)量的影響均達(dá)到了顯著水平(p<0.05)。在不添加任何激素的情況下(對(duì)照，處理1)，愈傷組織未分化出現(xiàn)不定芽，愈傷組織培養(yǎng)時(shí)間長(zhǎng)則會(huì)組織邊緣逐漸發(fā)黑，直至失去活性。添加激素的培養(yǎng)基中，愈傷組織表面會(huì)出現(xiàn)綠色芽點(diǎn)，培養(yǎng)2～3周后會(huì)發(fā)生分化形成1～2個(gè)不定芽(圖1C)，后慢慢延續(xù)到整個(gè)愈傷組織團(tuán)，形成團(tuán)狀結(jié)構(gòu)不定芽叢(圖1D)。對(duì)愈傷組織分化率結(jié)果進(jìn)行極差分析(表4)發(fā)現(xiàn)3因素極差從大到小依次為：6-BA、TDZ、NAA，表明6-BA對(duì)愈傷組織分化不定芽的影響最大，TDZ次之，NAA的影響最小。

表3 不同植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑配比下黃樟愈傷組織不定芽再生情況

表4 不定芽誘導(dǎo)正交試驗(yàn)結(jié)果的極差計(jì)算結(jié)果

方差分析結(jié)果表明，6-BA和TDZ對(duì)黃樟愈傷組織分化不定芽的影響均存在顯著性差異，而NAA作用不顯著。處理12和處理16的愈傷組織分化率和不定芽數(shù)量均處于最高水平，顯著高于其他處理(p<0.05)。雖然處理16的愈傷組織分化率和產(chǎn)生的不定芽數(shù)量均高于處理12，但芽太嫩小、脆弱，易斷裂，且大小不一。處理12產(chǎn)生的叢生芽大小均勻，芽嫩綠，芽相對(duì)粗壯，莖芽分化明顯，每團(tuán)愈傷組織產(chǎn)生的不定芽數(shù)量均在40個(gè)以上。綜合各項(xiàng)指標(biāo)，黃樟愈傷組織誘導(dǎo)產(chǎn)生不定芽的最佳培養(yǎng)基為“MS培養(yǎng)基1 L+6-BA1.0 mg+TDZ0.8 mg+NAA0.05 mg”。

2.3 VC和VB2對(duì)不定芽褐化的影響

將分化的不定芽團(tuán)接入含6-BA0.5 mg/L和NAA0.05 mg/L的MS培養(yǎng)基中繼代培養(yǎng)，培養(yǎng)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)芽團(tuán)基部的愈傷組織增殖較快，培養(yǎng)20 d左右愈傷組織顏色發(fā)暗形成硬塊，難以分化產(chǎn)生不定芽，繼續(xù)培養(yǎng)則發(fā)生褐化現(xiàn)象(圖1F)。褐化現(xiàn)象會(huì)抑制不定芽的生長(zhǎng)，嚴(yán)重的會(huì)導(dǎo)致已分化芽團(tuán)“中毒”死亡。為控制愈傷組織褐化現(xiàn)象的發(fā)生，本試驗(yàn)在繼代培養(yǎng)基中添加不同質(zhì)量濃度的VC和VB2，愈傷組織褐化及叢生芽生長(zhǎng)情況見(jiàn)表5。添加VC和VB2可有效地控制褐化的發(fā)生，各處理間愈傷組織褐化率的差異達(dá)到了顯著水平(p<0.05)。方差分析結(jié)果表明，VC和VB2對(duì)莖段愈傷組織褐化率的影響及其互作作用均達(dá)到了顯著水平(p<0.05)。處理1～7條件下的褐化率均在25%以上，均顯著高于處理8和9(p<0.05)。處理1和2愈傷組織褐化較早，未分化出不定芽，處理3～7愈傷組織發(fā)生分化形成不定芽數(shù)量較少，在芽團(tuán)基部周?chē)鷤园l(fā)黑結(jié)團(tuán)變硬，葉也出現(xiàn)黃枯狀。處理9褐化率最低，為12.42%，與處理8(13.33%)的差異未達(dá)到顯著水平。處理9增殖的叢生芽在生長(zhǎng)后期出現(xiàn)芽體發(fā)育呈透明狀現(xiàn)象，葉稍黃，而處理8未出現(xiàn)這種異?，F(xiàn)象(圖1E)。因此，適宜不定芽繼代增殖的最佳培養(yǎng)基為“MS培養(yǎng)基1 L+6-BA0.5 mg+NAA0.05 mg+VC15 mg+VB220 mg”。

表5 不同VC和VB2質(zhì)量濃度下黃樟不定芽繼代增殖情況

2.4 有機(jī)添加物BH對(duì)黃樟不定芽壯苗生長(zhǎng)的影響

繼代培養(yǎng)的不定芽均呈叢生狀，芽密集短小，葉展開(kāi)的數(shù)量少，無(wú)完整莖枝，不利于后期生根誘導(dǎo)。通過(guò)在增殖培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上降低6-BA質(zhì)量濃度、添加有機(jī)添加物BH的方法對(duì)不定芽進(jìn)行壯苗培養(yǎng)。不同質(zhì)量濃度BH對(duì)黃樟不定芽生長(zhǎng)的影響見(jiàn)表6。添加BH具有明顯的壯苗效果，不定芽平均芽高和有效芽數(shù)量隨BH質(zhì)量濃度的升高均表現(xiàn)出先上升后下降的趨勢(shì)，各處理間平均芽高及有效芽數(shù)量的差異均達(dá)到了顯著水平(p<0.05)。不添加BH的情況下，不定芽高生長(zhǎng)有限，平均芽高僅有0.53 cm，有效芽數(shù)量?jī)H為1.23個(gè)，顯著低于添加BH處理(p<0.05)。添加BH后，黃樟叢生芽開(kāi)始出現(xiàn)明顯的高生長(zhǎng)，莖桿由細(xì)弱變粗壯，顏色由白變綠最后微紅色，莖桿硬度增強(qiáng)；葉的顏色由嫩綠轉(zhuǎn)變?yōu)樯罹G色，葉片由薄變厚，由狹小變寬大，葉表面由紙質(zhì)感變光滑發(fā)亮，展葉的數(shù)量明顯增多(圖1G)。在BH質(zhì)量濃度為15 g/L時(shí)，叢生芽生長(zhǎng)狀態(tài)最好，平均芽高和有效芽數(shù)量均處于最高水平，分別為3.67 cm和25.07個(gè)，顯著高于其他處理(p<0.05)。在BH質(zhì)量濃度為20 g/L和30 g/L時(shí)，不定芽生長(zhǎng)減緩，葉數(shù)量增多，葉明顯變小，插入培養(yǎng)基中部分莖桿呈褐色或銹色鼓起狀，芽體生長(zhǎng)狀態(tài)不佳。因此，適宜黃樟不定芽壯苗生長(zhǎng)的培養(yǎng)基為“MS培養(yǎng)基1 L+6-BA0.2 mg+NAA0.05 mg+VC15 mg+VB220 mg+BH15 g”。

表6 不同質(zhì)量濃度BH下黃樟不定芽生長(zhǎng)情況

2.5 生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑組合對(duì)組培苗生根的影響

選擇生長(zhǎng)狀況良好、帶有3～4片葉、莖干粗壯的有效芽，剪取3～4 cm長(zhǎng)芽體插入含有不同質(zhì)量濃度的IBA和NAA培養(yǎng)基中進(jìn)行生根培養(yǎng)。不同生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑組合處理的有效芽產(chǎn)生不定根的時(shí)間不同，方差分析結(jié)果表明，各處理間有效芽生根率和平均根數(shù)的差異達(dá)到了顯著水平(p<0.05)，IBA和NAA對(duì)生根率和平均根數(shù)的影響及其互作作用均達(dá)到了顯著水平(p<0.05)。在低質(zhì)量濃度IBA(0.2 mg/L)條件下生根苗木的根系數(shù)量較少，生根率均較低，且發(fā)生的根系出現(xiàn)偏冠現(xiàn)象，根系細(xì)小，生根效果不理想。處理4～7的生根苗木均出現(xiàn)根系發(fā)粗短小現(xiàn)象，根上有些微發(fā)黃物質(zhì)。處理8的生根率和平均根數(shù)均最高，生根率顯著高于其他組合，平均根數(shù)顯著高于處理9外的其他組合(p<0.05)。處理8條件下的不定芽開(kāi)始發(fā)根時(shí)間較早(15 d)，生根數(shù)量最多，根系粗細(xì)均勻，呈四周輻射狀，苗木生長(zhǎng)狀況最佳(圖1H)。因此，適宜黃樟不定芽生根的最佳培養(yǎng)基為“0.5倍的MS培養(yǎng)基1 L+IBA1.0 mg+NAA0.5 mg”。

表7 不同生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑組合下黃樟不定芽誘導(dǎo)生根情況

A為接種莖節(jié)段；B為誘導(dǎo)產(chǎn)生愈傷組織；C為愈傷組織分化形成不定芽；D為大量分化形成叢生芽；E為叢生芽繼代增殖；F為褐化；G為壯苗培養(yǎng)；H為生根；I為移栽煉苗。

3 結(jié)論與討論

植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)愈傷組織的誘導(dǎo)影響較大，培養(yǎng)基中添加適宜的生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑種類(lèi)和質(zhì)量濃度是愈傷組織發(fā)生的關(guān)鍵因素[12-13]。6-BA、2,4-D、玉米素(ZT)和NAA等生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑常被用在植物組織誘導(dǎo)過(guò)程中，課題組前期試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)添加一定質(zhì)量濃度的6-BA和NAA可直接誘導(dǎo)黃樟莖段產(chǎn)生不定芽，即進(jìn)行腋芽萌發(fā)途徑[8]。本研究通過(guò)添加6-BA和2,4-D成功誘導(dǎo)出愈傷組織，并實(shí)現(xiàn)大量增殖，屬于間接器官發(fā)生途徑，而單獨(dú)添加6-BA則無(wú)法誘導(dǎo)出愈傷組織。2,4-D為一種生長(zhǎng)素類(lèi)似物，在一些植物的愈傷組織誘導(dǎo)中具有較高的活性，可以同時(shí)誘導(dǎo)和抑制體細(xì)胞胚的發(fā)生[14-15]。本研究結(jié)果表明，6-BA和2,4-D對(duì)黃樟嫩莖愈傷組織誘導(dǎo)率的影響均顯著且二者具有顯著的互作作用，添加6-BA1.0 mg/L和2,4-D0.2 mg/L條件下誘導(dǎo)效果最好。添加6-BA為2.0 mg/L時(shí)，愈傷組織誘導(dǎo)率較1.0 mg/L時(shí)有所提高，但愈傷組織出現(xiàn)玻璃化現(xiàn)象，生長(zhǎng)狀態(tài)不佳。其主要原因?yàn)楦哔|(zhì)量濃度的6-BA易引起愈傷組織產(chǎn)生氧化脅迫，阻礙細(xì)胞壁的形成，致使壁壓降低細(xì)胞吸水而形成玻璃苗[16-17]。

TDZ作為苯基脲衍生物，具有雙重的細(xì)胞分裂素和生長(zhǎng)素作用，近年來(lái)在植物的不定芽誘導(dǎo)、增殖、體胚發(fā)生等方面逐漸被廣泛應(yīng)用[18-19]。孫艷艷等[7]對(duì)“玲瓏”楓香(Liquidambarformosana)愈傷組織進(jìn)行不定芽誘導(dǎo)時(shí)發(fā)現(xiàn)，TDZ具有較強(qiáng)的生物活性，可有效地促進(jìn)不定芽的誘導(dǎo)和植株的生長(zhǎng)。鄭小琴等[20]對(duì)薄殼山核桃(Caryaillinoinensis)的葉片進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo)時(shí)發(fā)現(xiàn)，低質(zhì)量濃度TDZ與IBA配比時(shí)，能夠促進(jìn)愈傷組織形成，而高質(zhì)量濃度TDZ則抑制愈傷的形成，且不利于愈傷組織增殖。馮歡等[21]對(duì)微型月季(Rosahybrida)愈傷組織誘導(dǎo)分化時(shí)發(fā)現(xiàn)，添加高質(zhì)量濃度的TDZ時(shí)愈傷組織褐化現(xiàn)象嚴(yán)重。本研究在誘導(dǎo)叢生芽時(shí)發(fā)現(xiàn)，通過(guò)添加TDZ可有效的提高愈傷組織分化率，高質(zhì)量濃度的6-BA和TDZ能夠促進(jìn)愈傷組織分化不定芽，在試驗(yàn)的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，二者濃度越高，愈傷組織分化率和分化不定芽的數(shù)量越高。在高質(zhì)量濃度的6-BA(2.0 mg/L)和TDZ(0.8 mg/L)條件下，雖然黃樟愈傷組織分化率和不定芽數(shù)量最大，但由于生長(zhǎng)空間限制，不定芽大小芽現(xiàn)象明顯。

褐化又稱酚污染，外植體的脫分化和培養(yǎng)物的再分化均受其嚴(yán)重影響，是植物組培能否成功的重要因素。褐化是樟屬植物在組織培養(yǎng)中極易發(fā)生的現(xiàn)象，也是其組培過(guò)程中難以解決的一大難題。因此，選擇合適的防褐化方式如外植體選擇、培養(yǎng)基pH調(diào)節(jié)、有機(jī)附加物添加、抗氧化劑的添加等，對(duì)抑制褐化現(xiàn)象的發(fā)生至關(guān)重要。官錦燕等[22]在牛樟的組織培養(yǎng)中發(fā)現(xiàn)，春夏兩季采集的莖段污染率與褐化率均較低，誘導(dǎo)出芽快且出芽率高。楊柳等[23]在樟樹(shù)體胚萌發(fā)時(shí)添加活性炭150 mg/L可降低褐化率。VC是一種強(qiáng)抗氧化劑，因其可還原醌類(lèi)物質(zhì)，具有多酚氧化酶(PPO)抑制劑功能，還可顯著預(yù)防咖啡酸和綠原酸的氧化，在組織培養(yǎng)中常被用作抗褐化劑[24-25]。本研究在黃樟不定芽繼代培養(yǎng)基中以VC和VB2為褐化抑制劑，發(fā)現(xiàn)VC和VB2均能顯著降低愈傷組織褐化率，但對(duì)愈傷組織和不定芽的生長(zhǎng)影響不同，其中添加VC15 mg/L和VB220 mg/L時(shí)，愈傷組織增殖少，褐化明顯減弱，不定芽分化能力強(qiáng)，叢生芽生長(zhǎng)狀況較好。本研究還發(fā)現(xiàn)，單一添加VC對(duì)黃樟不定芽繼代過(guò)程中褐化現(xiàn)象的抑制效果不佳，配合VB2使用后，褐化率明顯降低，但高質(zhì)量濃度的VB2(30 mg/L)有導(dǎo)致不定芽玻璃化現(xiàn)象發(fā)生的趨勢(shì)。

由于黃樟不定芽增殖較快，叢生芽密集細(xì)小，葉、莖生長(zhǎng)緩慢，生長(zhǎng)較弱，需要在生根誘導(dǎo)前進(jìn)行壯苗培養(yǎng)使其長(zhǎng)出完整莖枝。在植物的組培研究中，常使用土豆泥、香蕉泥、椰子汁、蘋(píng)果泥等有機(jī)添加物促進(jìn)生根壯苗[26]。本研究采用不同質(zhì)量濃度的香蕉泥(BH)進(jìn)行壯苗試驗(yàn)，壯苗效果明顯，添加BH 15 g/L效果最佳，有效芽數(shù)量達(dá)到了25.07個(gè)。以“0.5倍的MS培養(yǎng)基1 L+IBA1.0 mg+NAA0.5 mg”作為生根培養(yǎng)基時(shí)，可誘導(dǎo)產(chǎn)生大量粗細(xì)均勻的再生根，生根率可達(dá)85.33%。