陳雷剛，楊曉靜，趙 鴻，高曉莉，馮冬梅，郭寶珠

紫癜性腎炎 （Henoch-Schonlein purpura nephritis，HSPN） 是自身免疫性疾病過敏性紫癜（Henoch-Schonlein purpura，HSP）最常見的合并癥，也是目前兒童繼發(fā)性腎小球疾病最常見的病因[1，2]。多數(shù)HSPN 患兒預(yù)后良好，但也有少數(shù)HSPN 患兒病情遷延、甚至發(fā)展為慢性腎功能不全， 嚴重影響患兒的身心健康。目前，HSPN 的發(fā)病機制尚未完全闡明， 臨床上也缺乏有效的HSPN 防治手段。 近些年，多項研究證實高同型半胱氨酸血癥 （hyperhomocysteinemia，HHcy）與多種腎臟疾病有關(guān)[3，4]。 同型半胱氨酸（homocysteinemia，Hcy）在蛋氨酸代謝循環(huán)中產(chǎn)生，具有激活炎癥反應(yīng)、 細胞凋亡、 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激 （endoplasmic reticulum stress，ESR）等生物學作用。中國吳凱等[5]研究證實，高蛋氨酸飲食誘導(dǎo)的HHcy 引起胱硫醚-β-合酶（cystathionine-β-synthase，CBS）雜合敲除（knockout，KO）小鼠發(fā)生腎損傷且這一作用與激活腎臟內(nèi)ESR 有關(guān)。 HSPN 相關(guān)的臨床研究證實，HSPN 患兒血清Hcy水平升高[6]，但HHcy 在HSPN 發(fā)病中的作用及機制尚不清楚。 因此，筆者以CBS-KO 小鼠為實驗對象，分析HHcy 在HSPN 發(fā)病中的作用及機制，旨在為今后闡明HSPN 的發(fā)病機制、發(fā)現(xiàn)HSPN 的防治靶點提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物

CBS-野生型（wild type，WT）C57BL/6J 雄性小鼠40 只，鼠齡8～10 周，體質(zhì)量18～20g；CBS-KO 雄性小鼠（C57BL/6J 背景）40 只，鼠齡8 ～10 周，體質(zhì)量18 ～20 g。 均購置于上海南方模式生物研究中心，動物使用許可證號SYXK（滬）2018-0002。

1.1.2 主要試劑與儀器

印度墨水、麥醇溶蛋白、ERS 激動劑毒胡蘿卜素、ERS 拮抗劑4-苯基丁酸 （4-phenylbutyric acid，4-PBA）（Sigma， 美國）； 考馬斯亮藍、 蘇木精-伊紅（hematoxylin eosin，HE） 染 色 試 劑 盒、TdT 介 導(dǎo) 的dUTP 缺口末端標記 （TdT-mediated dUTP nick-end labeling，TUNEL）試劑盒（上海碧云天公司，中國）；CAAT 區(qū)/增強子結(jié)合蛋白 （CAAT/enhancer binding protein，C/EBP）同源蛋白（C/EBP-homologous protein，CHOP）、含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶（cysteinyl aspartate specific proteinase，caspase）-12、caspase-3一抗（CST，美國）。

小動物全自動生化分析儀（浙江杭州德格醫(yī)療設(shè)備公司，中國）；正置顯微鏡（尼康公司，日本）；透射電子顯微鏡（日立公司， 日本）； 凝膠電泳及成像系統(tǒng)（Bio-rad，美國）。

1.2 方法

1.2.1 動物分組與干預(yù)

CBS-WT 小鼠隨機分為常規(guī)飲食CBS-WT 組、高蛋氨酸飲食CBS-WT 組、 常規(guī)飲食CBS-WT +HSPN 組、 高蛋氨酸飲食CBS-WT+HSPN 組；CBSKO 小鼠隨機分為常規(guī)飲食CBS-KO 組、高蛋氨酸飲食CBS-KO 組、常規(guī)飲食CBS-KO + HSPN 組、高蛋氨酸飲食CBS-KO+HSPN 組、 高蛋氨酸飲食CBSKO+HSPN+溶劑對照組、 高蛋氨酸飲食CBS-KO+HSPN + ERS 拮抗劑組、 高蛋氨酸飲食CBS-KO +HSPN+ERS 激動劑組。

采用印度墨水尾靜脈注射聯(lián)合麥醇溶蛋白灌胃的方式建立HSPN 模型。尾靜脈注射印度墨水0.4 mg/10 g，1 次/周，連續(xù)3 周；而后給予質(zhì)量濃度1 mg/mL麥醇溶蛋白（溶于6 mmol/L 鹽酸）每只0.5 mL 灌胃，1次/隔天，連續(xù)11 周，其中在最后3 d 給予質(zhì)量濃度1 mg/mL 麥醇溶蛋白尾靜脈注射，每只0.2 mL，1 次/天，連續(xù)3 d。 造模過程中，自由攝水，常規(guī)飲食給予常規(guī)飼料喂養(yǎng)，高蛋氨酸飲食給予含有2%蛋氨酸的飼料喂養(yǎng)。高蛋氨酸飲食CBS-KO+HSPN+溶劑對照組、高蛋氨酸飲食CBS-KO+HSPN+ERS 拮抗劑組、高蛋氨酸飲食CBS-KO+HSPN+ERS 激動劑組在造模過程中分別給予0.9%氯化鈉溶液（生理鹽水）腹腔注射，1 次/天，400 mg/kg 4-PBA 腹腔注射，2 次/周，1 mg/kg 毒胡蘿卜素腹腔注射，1 次/天。

1.2.2 標本收集與保存

造模結(jié)束后，在代謝籠內(nèi)收集24 h 尿液，于-20 ℃條件下保存；禁食12 h 后摘除眼球取血約1 mL，靜置凝血后離心分離血清，于-20 ℃條件下保存；另取腎臟皮質(zhì)標本并分為2 份，1 份用4%多聚甲醛溶液固定并石蠟包埋、室溫保存，1 份用液氮冷凍保存。

1.2.3 腎臟病理改變的檢查

取石蠟包埋的腎臟標本，制作病理切片，采用HE染色試劑盒進行染色， 按照試劑盒說明書進行操作，染色完成后在光學顯微鏡下觀察腎臟的病理改變。

1.2.4 血清指標的檢測

取血清標本， 采用全自動生化分析儀檢測Hcy、血清肌酐（serum creatinine，SCr）、尿素氮（urea nitrogen，BUN）的含量。

1.2.5 24 h 尿蛋白含量的檢測

取24 h 尿液標本，稱量體積，采用考馬斯亮藍法檢測蛋白濃度， 按照蛋白濃度× 體積計算24 h 尿蛋白含量。

1.2.6 腎臟內(nèi)細胞凋亡的檢測

取石蠟包埋的腎臟標本， 制作病理切片， 采用TUNEL 試劑盒進行染色， 按照試劑盒說明書進行操作， 染色完成后在光學顯微鏡下隨機觀察5 個腎小球，對凋亡細胞進行計數(shù)并計算細胞凋亡率。

1.2.7 ERS 途徑凋亡蛋白表達的檢測

取液氮冷凍的腎臟標本，加入裂解液后勻漿提取組織蛋白，測定蛋白濃度并取30 μg 蛋白進行Western blot 實驗。 首先在聚丙烯酰胺凝膠中電泳分離不同分子量的蛋白，而后電轉(zhuǎn)至聚偏氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜。 室溫下用5%脫脂牛奶封閉PVDF 膜1 h，4 ℃條件下用1 ∶1 000 稀釋的CHOP、caspase-12、caspase-3 一 抗 或1 ∶4 000 稀 釋 的βactin 一抗孵育PVDF 膜過夜，次日室溫下用1 ∶5 000稀釋的二抗孵育PVDF 膜1 h， 最后在凝膠成像系統(tǒng)內(nèi)顯影的蛋白條帶，用ImageJ 軟件掃描蛋白條帶的光密值，以β-actin 為內(nèi)參，計算CHOP、caspase-12、caspase-3 的表達水平。

1.3 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 21.0 軟件錄入數(shù)據(jù)。 實驗數(shù)據(jù)均為計量資料，經(jīng)正態(tài)性檢驗后符合正態(tài)分布，以均數(shù)± 標準差表示，多組間比較采用方差分析，有統(tǒng)計學差異后進一步采用LSD-t 檢驗進行兩兩比較。 P<0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 4 組CBS-WT 小鼠與4 組CBS-KO 小鼠血清Hcy 含量的比較

4 組CBS-WT 小鼠中， 高蛋氨酸飲食CBS-WT組、高蛋氨酸飲食CBS-WT+HSPN 組血清Hcy 含量高 于 常 規(guī) 飲 食CBS-WT 組 （t = 5.878、6.977，P <0.05）、 常規(guī)飲食CBS-WT + HSPN 組 （t = 6.848、6.502，P<0.05）。

4 組CBS-KO 小鼠中， 高蛋氨酸飲食CBS-KO組、高蛋氨酸飲食CBS-KO+HSPN 組血清Hcy 含量高于常規(guī)飲食CBS-KO 組 （t = 14.596、13.105，P <0.05）、 常規(guī)飲食CBS-KO + HSPN 組 （t = 14.056、12.691，P<0.05）。

CBS-WT 小鼠與CBS-KO 小鼠比較， 高蛋氨酸飲食CBS-KO 組小鼠的血清Hcy 含量高于高蛋氨酸飲食CBS-WT 組（t = 10.595，P < 0.05），高蛋氨酸飲食CBS-KO+HSPN 組小鼠的血清Hcy 含量高于高蛋氨酸飲食CBS-WT+HSPN 組（t=9.008，P<0.05）。見圖1。

圖1 4 組CBS-WT 小鼠及4 組CBS-KO 小鼠血清Hcy 含量比較的柱狀圖Fig.1 Histograms of serum Hcy content comparison in 4 groups of CBS-WT mice and 4 groups of CBS-KO mice

2.2 4 組CBS-WT 小鼠腎臟病理改變及腎功能指標的比較

常規(guī)飲食CBS-WT 組、 高蛋氨酸飲食CBS-WT組小鼠腎小球結(jié)構(gòu)清晰、基底膜形態(tài)正常，未出現(xiàn)病理改變；常規(guī)飲食CBS-WT+HSPN 組、高蛋氨酸飲食CBS-WT+HSPN 組小鼠均出現(xiàn)腎小球腫脹、基底膜增厚的病理改變， 且兩組間病理改變的程度相當。見圖2。

圖2 4 組CBS-WT 小鼠腎臟病理改變的比較（HE 染色，×400）Fig.2 Comparison of kidney pathological change images in 4 groups of CBS-WT mice(HE staining, ×400)

與常規(guī)飲食CBS-WT 組比較， 高蛋氨酸飲食CBS-WT 組小鼠SCr、BUN、24 h 尿蛋白差異無統(tǒng)計學意義（t=0.772、0.660、0.230，P>0.05）， 常規(guī)飲食CBS-WT+HSPN 組小鼠SCr、BUN、24 h 尿蛋白明顯增加（t=3.726、5.208、8.608，P<0.05）； 與常規(guī)飲食CBS-WT+HSPN 組比較， 高蛋氨酸飲食CBS-WT+HSPN 組小鼠SCr、BUN、24 h 尿蛋白差異無統(tǒng)計學意義（t=0.621、0.738、0.637，P>0.05）。 表1。

表1 4 組CBS-WT 小鼠腎功能指標的比較Tab.1 Comparison of kidney function indexes in 4 groups of CBS-WT mice

2.3 4 組CBS-KO 小鼠腎臟病理改變及腎功能指標的比較

常規(guī)飲食CBS-KO 組小鼠腎小球結(jié)構(gòu)清晰、基底膜形態(tài)正常，未出現(xiàn)病理改變；高蛋氨酸飲食CBSKO 組、常規(guī)飲食CBS-KO+HSPN 組、高蛋氨酸飲食CBS-KO+HSPN 組小鼠均出現(xiàn)腎小球腫脹、 基底膜增厚的病理改變， 且高蛋氨酸飲食CBS-KO+HSPN組病理改變較高蛋氨酸飲食CBS-KO 組、 常規(guī)飲食CBS-KO+HSPN 組加重。 見圖3。

圖3 4 組CBS-KO 小鼠腎臟病理改變的比較（HE 染色，×400）Fig.3 Comparison of kidney pathological change images in 4 groups of CBS-KO mice(HE staining, ×400)

與常規(guī)飲食CBS-KO 組比較， 高蛋氨酸飲食CBS-KO 組、常規(guī)飲食CBS-KO+HSPN 組小鼠SCr、BUN、24 h 尿蛋白明顯增加 （t=2.912、6.071、8.581、3.484、4.741、7.135，P<0.05）；與常規(guī)飲食CBS-KO+HSPN 組比較， 高蛋氨酸飲食CBS-KO+HSPN 組小鼠SCr、BUN、24 h 尿蛋白明顯增加（t=4.687、3.408、 6.843，P<0.05）。 見表2。

表2 4 組CBS-KO 小鼠腎功能指標的比較Tab.2 Comparison of kidney function indexes in 4 groups of CBS-KO mice

2.4 4 組CBS-KO 小鼠腎小球內(nèi)細胞凋亡率的比較

與常規(guī)飲食CBS-KO 組比較， 高蛋氨酸飲食CBS-KO 組、 常規(guī)飲食CBS-KO+HSPN 組小鼠腎小球內(nèi)細胞凋亡率明顯增加（7.69%±1.42%、8.11%±1.63 % vs 1.85 % ± 0.32 %）（t = 12.687、11.917，P <0.05）；與常規(guī)飲食CBS-KO+HSPN 組比較，高蛋氨酸飲食CBS-KO + HSPN 組小鼠腎小球內(nèi)細胞凋亡率明顯增加 （20.19%±5.58%vs 8.11%±1.63 （t=6.582，P<0.05）。 見圖4。

圖4 4 組CBS-KO 小鼠腎小球內(nèi)細胞凋亡率的TUNEL 染色Fig.4 Images of TUNEL staining of glomerular apoptosis rate in 4 groups of CBS-KO mice

2.5 4 組CBS-KO 小鼠腎臟內(nèi)ESR 途徑蛋白基因表達的比較

與常規(guī)飲食CBS-KO 組比較， 高蛋氨酸飲食CBS-KO 組、 常規(guī)飲食CBS-KO+HSPN 組小鼠腎臟內(nèi)CHOP、caspase-12、caspase-3 的表達水平明顯增加 （t = 7.423、6.230、9.325、7.957、7.018、10.704，P <0.05）；與常規(guī)飲食CBS-KO+HSPN 組比較，高蛋氨酸飲食CBS-KO + HSPN 組小鼠腎臟內(nèi)CHOP、caspase-12、caspase-3 的表達水平明顯增加 （t=9.527、7.070、7.011，P<0.05）。 見表3、圖5。

圖5 4 組CBS-KO 小鼠腎臟內(nèi)CHOP、caspase-12、caspase-3表達的電泳圖Fig.5 Electrophoresis of CHOP, caspase-12 and caspase-3 expression of kidney in 4 groups of CBS-KO mice

表3 4 組CBS-KO 小鼠腎臟內(nèi)CHOP、caspase-12、caspase-3 表達水平的比較Tab.3 Comparison of CHOP,caspase-12 and caspase-3 expression levels of kidney in 4 groups of CBS-KO mice

2.6 ERS 拮抗劑及激動劑對高蛋氨酸飲食CBSKO 小鼠腎臟內(nèi)ESR 途徑凋亡蛋白表達影響

與高蛋氨酸飲食CBS-KO+HSPN+ 溶劑對照組比較， 高蛋氨酸飲食CBS-KO+HSPN+ERS 拮抗劑組腎臟內(nèi)CHOP、caspase-12、caspase-3 的表達水平明顯降低（t=12.414、14.110、7.481，P<0.05），高蛋氨酸飲食CBS-KO + HSPN + ERS 激動劑組腎臟內(nèi)CHOP、caspase-12、caspase-3 的表達水平明顯增加（t=11.353、12.091、11.884，P<0.05）。 見表4、圖6。

圖6 ERS 拮抗劑及激動劑對高蛋氨酸飲食CBS-KO 小鼠腎臟內(nèi)CHOP、caspase-12、caspase-3 表達影響的電泳圖Fig.6 Electrophoresis of the effects of ERS antagonists and agonists on the expression of CHOP,caspase-12 and caspase-3 of kidney in high methionine diet CBS-KO mice

表4 ERS 拮抗劑及激動劑對高蛋氨酸飲食CBS-KO 小鼠腎臟內(nèi)CHOP、caspase-12、caspase-3 表達的影響Tab.4 Comparison of ERS antagonists and agonists effects on expression of CHOP, caspase-12 and caspase-3 of kidney in high methionine diet CBS-KO mice

2.7 ERS 拮抗劑及激動劑對高蛋氨酸飲食CBSKO 小鼠腎臟病理改變及腎功能指標的影響

與高蛋氨酸飲食CBS-KO+HSPN+ 溶劑對照組比較， 高蛋氨酸飲食CBS-KO+HSPN+ERS 拮抗劑組腎臟病理改變減輕，SCr、BUN、24 h 尿蛋白明顯降低（t=2.298、4.970、3.900，P<0.05）； 高蛋氨酸飲食CBS-KO + HSPN + ERS 激動劑組腎臟病理改變加重，SCr、BUN、24 h 尿蛋白明顯增加（t=4.258、3.163、5.186，P<0.05）。 見表5、圖7。

圖7 ERS 拮抗劑及激動劑對高蛋氨酸飲食CBS-KO 小鼠腎臟病理改變的病理圖Fig.7 Pathological kidney change images of ERS antagonists and agonists in high methionine diet CBS-KO mice

表5 ERS 拮抗劑及激動劑對高蛋氨酸飲食CBS-KO 小鼠腎功能指標的影響比較Tab.5 Comparison of ERS antagonists and agonists effects on kidney function indexes in high methionine diet CBS-KO mice

2.8 ERS 拮抗劑及激動劑對高蛋氨酸飲食CBSKO 小鼠腎小球細胞凋亡的影響

與高蛋氨酸飲食CBS-KO+HSPN+ 溶劑對照組比較， 高蛋氨酸飲食CBS-KO+HSPN+ERS 拮抗劑組腎小球細胞凋亡率明顯降低 （8.38%±1.58%vs 18.83%±4.38%）（t=4.145，P<0.05）， 高蛋氨酸飲食CBS-KO+HSPN+ERS 激動劑組腎小球細胞凋亡率明顯增加（29.30%±6.68%vs 18.83%±4.38%）（t=7.097，P<0.05）。 見圖8。

圖8 ERS 拮抗劑及激動劑對高蛋氨酸飲食CBS-KO 小鼠腎小球細胞凋亡病理圖Fig.8 Pathological images of ERS antagonists and agonists effects on apoptosis of glomerular cells in high methionine diet CBS-KO mice

3 討論

Hcy 是蛋氨酸代謝的中間產(chǎn)物，異常升高的Hcy通過激活炎癥反應(yīng)、 細胞凋亡、ERS 等參與心腦血管疾病發(fā)病過程中內(nèi)皮損傷[7，8]、腎臟疾病發(fā)病過程中腎小球損傷[3，9，10]。 HSPN 是HSP 發(fā)病過程中免疫復(fù)合物在腎臟內(nèi)沉積引起的并發(fā)癥，發(fā)病機制復(fù)雜，有研究證實HSPN 患兒血清中Hcy 含量明顯升高[6]，提示HHcy 可能參與HSPN 的發(fā)病。基于此，筆者研究將通過動物實驗分析HHcy 在HSPN 發(fā)病中的作用，進而為發(fā)現(xiàn)HSPN 的防治靶點提供實驗依據(jù)。

CBS 是蛋氨酸代謝的限速酶， 敲除CBS 后蛋氨酸代謝發(fā)生障礙、給予高蛋氨酸飲食可引起HHcy[11]。筆者研究給予CBS-WT 小鼠和CBS-KO 小鼠高蛋氨酸飲食后均出現(xiàn)血清Hcy 升高， 且CBS-KO 小鼠接受高蛋氨酸飲食后Hcy 的升高較CBS-WT 小鼠更為顯著。 CBS-WT 小鼠接受高蛋氨酸飲食后Hcy 輕度升高，但腎功能指標正常、腎臟內(nèi)未出現(xiàn)病理改變，可能原因是輕度的血清Hcy 升高不會造成腎損害，與既往吳凱等[5]及Pushpakumar S 等[12]在CBS-WT 小鼠高蛋氨酸飲食后的實驗結(jié)果吻合。CBS-WT 小鼠進行HPSN 造模后出現(xiàn)了腎小球腫脹、基底膜增厚等典型的病理改變；HSPN 造模過程中給予高蛋氨酸飲食，血清Hcy 含量輕度升高，但腎臟病理改變并未加重，表明高蛋氨酸飲食引起CBS-WT 小鼠血清Hcy 輕度升高并不會加重HSPN 的病理改變。在CBS-KO 小鼠中， 高蛋氨酸飲食后Hcy 顯著升高且腎功能發(fā)生損害、 腎臟出現(xiàn)病理改變；HSPN 造模過程中給予高蛋氨酸飲食，血清Hcy 含量顯著升高且腎功能損害、腎臟病理改變加重， 表明在CBS-KO 小鼠中HHcy 使HSPN 加重。 因此，筆者將繼續(xù)在CBS-KO 小鼠中研究HHcy 加重HSPN 的原因分析。

HHcy 引起組織損傷的原因與激活炎癥反應(yīng)、細胞凋亡、ERS 有關(guān)，其中ERS 是一種病理刺激下未折疊或錯誤折疊蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)聚集引發(fā)的未折疊蛋白反應(yīng)，通過下游CHOP/caspase-12 途徑能夠引起細胞凋亡[13~15]。 吳凱等[5]研究證實，HHcy 引起小鼠腎損傷的作用與激活ERS 介導(dǎo)的細胞凋亡有關(guān)。 筆者研究在CBS-KO 小鼠接受高蛋氨酸飲食出現(xiàn)HHcy 后觀察到腎小球內(nèi)細胞凋亡率增加， 且ERS 凋亡途徑中CHOP、caspase-12、caspase-3 表達也明顯增加， 與吳凱的研究結(jié)果一致。在CBS-KO 小鼠進行HSPN 造模后， 腎小球內(nèi)細胞凋亡率及ERS 途徑凋亡蛋白的表達均增加， 表明ERS 途徑介導(dǎo)的細胞凋亡與HSPN發(fā)病有關(guān)；在CBS-KO 小鼠HSPN 造模過程中給予高蛋氨酸飲食、 引起HHcy 后， 腎小球細胞凋亡率及ERS 途徑凋亡蛋白的表達均較接受常規(guī)飲食的HSPN CBS-KO 小鼠增加， 表明HHcy 可能通過激活ERS 介導(dǎo)的細胞凋亡引起或加重HSPN。

最后，為了明確ERS 在HHcy 引起或加重HSPN中的作用， 筆者研究使用ERS 激動劑和拮抗劑進行了實驗。在CBS-KO 小鼠HSPN 造模過程中同時給予高蛋氨酸飲食及ERS 激動劑或拮抗劑， 在HHcy 起到加重HSPN 腎功能損害、腎臟病理改變及腎小球細胞凋亡的作用中，ERS 激動劑能夠使這一作用加劇，ERS 拮抗劑能夠使這一作用減弱， 表明HHcy 加重HSPN 的作用與激活ERS 介導(dǎo)的細胞凋亡有關(guān)。

綜上所述，HHcy 引起CBS-KO 的HSPN 小鼠腎臟病理改變、 腎功能損害及腎小球細胞凋亡加劇，激活ERS 是與HHcy 加重HSPN 相關(guān)的分子機制。 未來，HHcy 有望成為研究HSPN 發(fā)病機制及防治表達的新發(fā)現(xiàn)， 糾正HHcy 可能起到防治HSPN 的作用，但這仍需未來更多的研究來證實。