李建彪，李 靖

近年來，鮑曼不動桿菌（Acinetobacter baumannii,AB）已成為導(dǎo)致醫(yī)院內(nèi)爆發(fā)感染的主要致病菌，被認為是全球范圍內(nèi)，尤其是重癥監(jiān)護病房（intensive care unit，ICU）中爆發(fā)新的院內(nèi)感染的重要原因[1]。 在科學(xué)家們已經(jīng)研發(fā)的所有抗生素產(chǎn)品中，碳青霉烯類作為一種抗菌譜廣、抗菌效力強及毒性低的抗生素，已成為臨床上控制重癥感染的一線藥物， 被醫(yī)生普遍使用，也因此造成AB 對碳青霉烯類藥物耐藥率明顯上升。 2016 年中國細菌耐藥性監(jiān)測網(wǎng)CHINET 監(jiān)測數(shù)據(jù)顯示AB 對碳青霉烯類抗生素的耐藥率已經(jīng)達到70%[2]，人們越來越重視耐碳青霉烯類鮑曼不動桿菌(carbapenem-resistant Acinetobacter baumannii，CRAB)的檢出。 目前，臨床上常采用傳統(tǒng)培養(yǎng)和實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng) （real time quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR） 法檢測耐藥基因的方法檢出CRAB，以便臨床醫(yī)生可以準確選擇治療藥物。

1 耐藥菌在重癥醫(yī)學(xué)中的危害

ICU 之所以作為醫(yī)院感染的高危場所，是由于患者病情危急及各種侵入治療導(dǎo)致身體機能差、自身免疫能力低下，對外界感染抵抗力低。有研究顯示，ICU 患者醫(yī)院感染發(fā)生率相比普通病房高5 ～10 倍[3]。 ICU內(nèi)一旦發(fā)生醫(yī)院感染，其炎癥控制非常困難，不僅延長了患者的住院時間、增加了醫(yī)療費用，而且患者的疾病控制及預(yù)后效果也隨之變差[4]。

由于不動桿菌屬細菌的毒力低，其很少能在正常宿主的機體中引起感染，然而這種病原體在醫(yī)院環(huán)境中可長時間存活，并可與土壤、水和食物隔離，可以在健康人和住院患者體內(nèi)定植， 是ICU 感染的最重要原因[5]。 AB 是不動桿菌屬中最常見的一種條件致病菌，是醫(yī)院暴發(fā)感染的主要病原菌，一旦感染通常很難控制[6，7]。近年來，這種病原體可引起醫(yī)院內(nèi)肺炎、血液感染、傷口感染和醫(yī)院內(nèi)腦膜炎等，成為導(dǎo)致患者死亡的主要原因[8]。 防控多重耐藥菌是醫(yī)院感染管理工作中的重要內(nèi)容，對降低患者住院周期、減少住院費用、降低患者死亡率有著重要意義。 ICU 的多重耐藥菌防控更是重點中的重點和難點。

2 耐碳青霉烯類鮑曼不動桿菌的耐藥機制

抗生素的發(fā)展是影響感染治療過程中最重要的因素，自英國細菌學(xué)家弗萊明發(fā)現(xiàn)青霉素之后，人們逐漸尋找和開發(fā)出更多種類的抗生素及其衍生物，在臨床上得到了廣泛的應(yīng)用。在抗細菌感染治療的進程中，抗生素拯救了無數(shù)人的生命，成為中流砥柱[9]。 碳青霉烯類抗生素是抗菌譜廣、效力強，且對β-內(nèi)酰胺酶穩(wěn)定， 成為臨床醫(yī)生廣泛用于抗感染治療的一線藥物。

碳青霉烯類抗生素主要包括亞胺培南、 美羅培南、帕尼培南等，臨床多用于革蘭陰性菌感染的治療，主要是AB[10]。 近年來廣泛輕率地使用抗生素導(dǎo)致大量耐藥菌的出現(xiàn)，甚至出現(xiàn)“超級細菌”[11]。

2.1 碳青霉烯類抗生素作用機制

抗生素產(chǎn)生殺菌作用主要有4 種作用機制：抑制DNA 復(fù)制與轉(zhuǎn)錄、與細胞膜相互作用、干擾蛋白質(zhì)合成、抑制細胞壁合成[12]。 碳青霉烯類抗生素的作用機制主要是抑制細菌細胞壁的合成，通過胞漿滲透壓的變化來加速細胞溶解[13]。 由于人體細胞不存在細胞壁，故而沒有藥物的作用靶點，所以機體不受此類藥物的作用，其影響小、毒性小，因而抗菌效果較好。

2.2 鮑曼不動桿菌的耐藥機制研究進展

碳青霉烯類抗生素是一類高度有效的抗生素，多用于治療多重耐藥（multidrug resistance,MDR）革蘭陰性細菌感染。 然而，由于碳青霉烯類耐藥性細菌的出現(xiàn)，這些抗生素的有效性正受到嚴重的威脅[14，15]。到目前為止，關(guān)于AB 對碳青霉烯類抗菌藥物的耐藥機制主要有以下4 種，分別是產(chǎn)碳氫霉烯酶、外膜蛋白表達的改變、青霉素結(jié)合蛋白的改變和細菌膜上外排泵表達的增強。其中碳青霉烯酶的產(chǎn)生被人們認為是耐藥的主要機制[16]。 碳青霉烯酶是一類可以水解滅活碳青霉烯類抗生素的酶類， 這種酶主要編碼在質(zhì)粒上，具有很強的傳播性[17]。

目前在世界范圍內(nèi)廣泛流行碳青霉烯酶按照β-內(nèi)酰胺酶末端氨基酸序列特征的分子生物學(xué)分類法（Ambler 分類法）分為A 類、B 類和D 類酶。A 類酶為絲氨酸酶，主要包括肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶（Klebsiella pneumoniae carbapenemases，KPC）、亞胺培南水解β-內(nèi)酰胺酶（imipenem，IMP）等基因型，其中KPC基因型主要見于腸桿菌科細菌[18]。 B 類酶為金屬酶，又稱金屬β-內(nèi)酰胺酶 （metallo-beta-lactamase，MBL），它們可以通過水平基因轉(zhuǎn)移機制（特別是接合作用）在各種細菌之間轉(zhuǎn)移[16]。 D 類碳青霉烯酶是苯唑西林酶 （oxacillin- hydrolyzing，OXA）， 主要包括OXA-23、OXA-51、OXA-24、OXA-58 等亞型[19]。

3 耐藥基因檢測與研究

傳統(tǒng)培養(yǎng)方法作為細菌鑒定的金標準，是CRAB檢出的主要方法[20]。 傳統(tǒng)培養(yǎng)方法相對于耐藥基因檢測，其檢測準確度要高，但最大的缺點在于過程復(fù)雜、檢測周期長，其對人員和試劑要求均較高，因而臨床應(yīng)用的時間局限性對于ICU 患者非常不利[21]。且標本是否合格、雜菌抑制、菌齡大小等因素，都會使得陽性檢出率受到很大影響[22]。 而較高級的二代測序技術(shù)（next-generation sequencing，NGS）或宏基因檢測等手段[23]，耗費昂貴，且所有三級醫(yī)院開展該項目的能力有限，外送檢測也存在一系列問題。 而重癥醫(yī)學(xué)及急診、感染等這些科室迫切需要對感染的病原體有一個較早的了解[24]。 隨著分子診斷技術(shù)的不斷發(fā)展，細菌DNA 同源性分析技術(shù)，如脈沖場凝膠電泳、聚合酶鏈式反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）、DNA 探針雜交及序列分析等方法是目前在分子水平上分析細菌的主要手段[25]。 RT-qPCR 技術(shù)成為臨床一種潛在的可以發(fā)展為檢測病原菌的首要方法，特別是耐藥基因的檢測。其優(yōu)勢在于周期短，僅需2 ～3 h，且結(jié)果準確度較高，在重癥醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用越來越引起臨床重視。

3.1 實時熒光定量聚合酶鏈式反應(yīng)

RT-qPCR 是在PCR 擴增的基礎(chǔ)上加入熒光信號標記的探針[26]，這種探針可以與目的檢測基因特異性雜交，實現(xiàn)信號的放大，通過儀器對熒光信號的檢測， 對樣本中含量較少的目的基因可以準確檢出，靈敏度較高，現(xiàn)在以TaqMan 探針較為常見[27]。由于該方法簡便、快速、特異性強、靈敏度高，已廣泛應(yīng)用于臨床檢測和基礎(chǔ)研究[28]。 隨著PCR 擴增產(chǎn)物的增加，熒光信號呈對數(shù)積累， 可達到對目的基因進行實時監(jiān)測[29]。 在PCR 的指數(shù)階段，當(dāng)反應(yīng)的任何成分都不受限制時， 定量擴增的DNA 足以使得靶序列定量的精確度顯著提高[30]。

RT-qPCR 也存在一定的局限性。 DNA 擴增是關(guān)鍵步驟，但實驗對象針對基因水平DNA，即無法區(qū)分致病菌有無活性，可能導(dǎo)致假陽性結(jié)果，是目前所有可用RT-qPCR 方法的主要限制因素之一[31]。

3.2 耐藥基因種類及臨床意義

產(chǎn)苯唑西林酶（AmpC、OXA-23、OXA-24、OXA-51、IMP-1、IMP-2、VIM-1 和VIM-2 等） 和主動外排系統(tǒng)（adeA、adeB、adeC、adeJ 和adeG 等）是CRAB 對碳青霉烯類抗菌藥物的主要耐藥基因[32]。這些耐藥基因通過細菌基因組中的整合子作用，可整合到其他細菌基因組或通過插入序列共同區(qū)移動DNA 序列，為耐藥性傳播提供媒介[33]。 目前，臨床上針對CRAB 的耐藥基因檢測主要為OXA-51 基因與OXA-23 基因。其中OXA-51 基因只在AB 中檢測到，其他細菌擴增結(jié)果為陰性，也因此人們將OXA-51 基因作為AB 的特有基因；OXA-23、OXA-24、OXA-58 基因?qū)儆贏B獲得性耐藥基因。 據(jù)報道，OXA-23 基因在CRAB 中檢出率較高， 所以目前臨床上通過檢測OXA-23 基因來判斷CRAB[34]。

通過檢測OXA-51 基因可以快速判斷是否為AB 感染，陽性則代表標本中存在AB；通過耐藥基因OXA-23 來判斷AB 是否對碳青霉烯類抗生素耐藥，即是否為CRAB 感染。利用OXA-51 基因和OXA-23基因可及時有效監(jiān)測重癥醫(yī)學(xué)科CRAB 感染情況，為臨床用藥提供參考，避免抗生素濫用，緩解CRAB耐藥性居高不下的現(xiàn)狀。 耐藥基因檢測雖然能夠滿足臨床快速檢測的要求， 為臨床的經(jīng)驗性用藥提供依據(jù)，但是臨床開展的耐藥基因檢測項目并沒有完全覆蓋，且有一定的局限性，可與細菌培養(yǎng)的方法有效互補。

耐藥基因檢測假陽性原因： ①OXA-51 基因陽性，而AB 在培養(yǎng)時并非優(yōu)勢菌；②耐藥基因的檢測無法判斷細菌的死亡情況；③OXA-51 基因可能存在于其他革蘭陰性菌，如黏質(zhì)沙雷菌、銅綠假單胞菌和大腸埃希菌中，但在上述細菌中OXA-51 基因的檢出率極低[35]。 耐藥基因檢測假陰性可能與耐藥基因檢測項目未完全覆蓋有關(guān)， 如OXA-23 基因是CRAB 耐藥的主要機制，AB 中還可能攜帶OXA-24 和OXA-58基因。 高通量多基因檢測有望提高檢測準確度，更好地提高重癥患者的臨床決策。 但價格和時效等問題制約了更多檢測項目的廣泛普及，未來仍有很多進步空間。

4 總結(jié)

近年來AB 的耐藥率逐漸增高， 特別是ICU 患者，CRAB 黏附力極強， 易在ICU 環(huán)境中的物體表面黏附而成為貯菌源[10]，引起院內(nèi)感染，導(dǎo)致患者住院時間延長、醫(yī)療費用增加、病死率升高[36，37]。 CRAB 對常用消毒劑耐受， 容易造成ICU 環(huán)境及物體表面污染且很難被清除，同時可通過污染的環(huán)境、醫(yī)務(wù)人員的手和各種診療用品導(dǎo)致院內(nèi)感染暴發(fā)，是醫(yī)院最常見、最難控制的病原菌之一[38，39]。 陶紅英等分析了2016 年至2019 年CRAB 的檢出率， 并得出結(jié)論：各ICU 的CRAB 總檢出率為93.23%，綜合ICU 的CRAB檢出率均>95%，與國內(nèi)文獻報道基本一致[40，41]。 因此快速準確診斷AB 感染及耐藥性是重癥醫(yī)學(xué)耐藥菌防控的重中之重。 RT-qPCR 耐藥基因檢測能夠及時有效地提供患者感染細菌及耐藥情況，應(yīng)在重癥醫(yī)學(xué)中得到廣泛應(yīng)用。 因此，加強CRAB 監(jiān)測并提早采取院內(nèi)感染防控措施，優(yōu)化抗生素的合理應(yīng)用，才能有效遏制臨床治療將面臨的無藥可用境地。