張建萍 段桂芳 楊爽 余柳青 陸永良 唐偉*

（1 中國水稻研究所/水稻生物育種全國重點實驗室，杭州 310006；2 上海曉明檢測技術(shù)服務(wù)有限公司，上海 201612；第一作者：zhangjianping@caas.cn；*通訊作者：tangwei@caas.cn）

雜草是影響水稻高產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)的有害生物因子，目前主要依賴化學(xué)除草劑進行防治[1]。長期大量使用化學(xué)除草劑不僅造成生態(tài)環(huán)境破壞，還導(dǎo)致雜草產(chǎn)生抗藥性[2]。微生物除草劑具有對環(huán)境友好等特點，是化學(xué)農(nóng)藥的有益補充或替代品。微生物除草劑，如真菌菌絲體、孢子等作為防治制劑使用的基本原理是用病原菌感染靶標雜草，以抑制雜草生長達到防治雜草的目的[3]。在這個過程中宿主、病原菌和環(huán)境因子對雜草防治效果都有很重要的影響，因此，需要篩選到高除草活性真菌菌株，并在適宜的環(huán)境下施用才能達到好的防治效果。

禾長蠕孢菌（Helminthosporium gramineumRabenh.f.sp．echinochloae，簡稱HGE）是從自然感病稗草上分離到的一種絲狀真菌，能有效感染稗草、鴨舌草等雜草，但對水稻、小麥等主要作物安全，具有開發(fā)為稻田生物除草劑的潛力[4-6]。然而，HGE 在田間應(yīng)用時易受環(huán)境因子，包括溫度、濕度以及紫外線的影響而降低活性甚至失活。研制劑型是解決實驗室高效菌株在田間應(yīng)用防效下降問題的有效途徑，也是將實驗室效果轉(zhuǎn)化為田間應(yīng)用的基礎(chǔ)保證[7]。為此，本研究在前期研究的基礎(chǔ)上[8-10]，采用二次通用旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計HGE 孢子制劑配方，并進行田間小區(qū)試驗驗證，為其進一步開發(fā)和商品化生產(chǎn)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試菌株和稗草

HGE 分離于自然感病稗草[4]，保藏于中國水稻研究所。供試稗草種子采集于中國水稻研究所試驗田，曬干后-20 ℃冷凍保藏備用。

1.2 培養(yǎng)基

PDB 培養(yǎng)基：去皮馬鈴薯20%，葡萄糖2%，蒸餾水。PDA 培養(yǎng)基：PDB 培養(yǎng)基添加1.7%瓊脂粉。固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基I：米粉4%，豆粕粉1%，Na3PO4·12H2O 0.2%，MgSO4·7H2O 0.1%。

1.3 菌種活化和轉(zhuǎn)接體制備

將4 ℃斜面保存的HGE 轉(zhuǎn)接到新鮮PDA 培養(yǎng)基上，28 ℃黑暗培養(yǎng)7 d 活化。將活化的禾長蠕胞菌株轉(zhuǎn)接PDB 培養(yǎng)基中，28 ℃振蕩培養(yǎng)3 d 后制成菌懸液備用。

1.4 孢子粉制備

稱取1.5 L（約106.5 g）珍珠巖置于托盤中，添加4%米粉、1%豆粕粉、0.2% Na3PO4·12H2O、0.1% MgSO4·7H2O、40%蒸餾水，充分攪拌混合均勻，121 ℃高溫滅菌40 min。培養(yǎng)基冷卻后，接入8%HGE 懸液，用無菌玻棒攪拌均勻。用8 層無菌紗布覆蓋托盤口，用橡皮筋固定。置于28 ℃光照培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng)，期間用黑光燈12 h 循環(huán)光照誘導(dǎo)產(chǎn)孢。14 d 后收集獲得孢子粉。

1.5 稗草

將稗草種子在溫室中浸泡2 d，催芽露白后，挑選發(fā)芽較好的稗草種子（50 粒左右）播種于0.25 m2圓形小盆中，溫室培育至2.0~3.0 葉期，備用。

1.6 試驗設(shè)計

為篩選HGE 孢子制劑配方，在單因素試驗結(jié)果[10]的基礎(chǔ)上，將孢子粉按比例與增效劑、溶劑油、穩(wěn)定劑和乳化劑混合均勻，配制成孢子粉劑，噴施于2.0~3.0葉期稗草上，14 d 后測定稗草株高和鮮質(zhì)量防效，以稗草死亡率為考察指標，采用二次通用旋轉(zhuǎn)組合實驗設(shè)計，篩選增效劑（X1）、溶劑油（X2）、穩(wěn)定劑（X3）和乳化劑（X4）這4 個因素的最佳配比，確定HGE 孢子制劑配方。其中，增效劑選用種類、零水平和間隔設(shè)計參考耿銳梅[11]的研究結(jié)果，混合使用增效劑A（10%吡嘧磺隆WP）+增效劑B（2.5%五氟磺草胺OD）。二次通用旋轉(zhuǎn)組合實驗因素水平編碼表和結(jié)構(gòu)矩陣見表1 和表2。

表1 二次通用旋轉(zhuǎn)組合試驗因素及水平表

1.7 稗草防效測定

將HGE 孢子粉與各助劑按照表2 配制，孢子粉制劑施用方法為噴霧法。用壓力噴霧器對稗草葉片均勻噴灑孢子懸液100 mL/m2。將噴完藥的稗苗繼續(xù)在溫室培養(yǎng)，14 d 后實測取樣法調(diào)查稗草株高、鮮質(zhì)量和死亡率。試驗共設(shè)置25 個處理，分別為二次通用旋轉(zhuǎn)組合試驗設(shè)計的20 個處理，以及清水對照、不添加任何助劑的孢子粉對照、10%田間常規(guī)用量的增效劑A+增效劑B 對照、20%田間常規(guī)用量的增效劑A+增效劑B 對照和30%田間常規(guī)用量的增效劑A+增效劑B 對照。每個處理3 次重復(fù)，試驗重復(fù)3 次。

表2 二次通用旋轉(zhuǎn)組合試驗結(jié)構(gòu)矩陣

1.8 數(shù)據(jù)處理

二次通用旋轉(zhuǎn)組合試驗結(jié)果用DPS 數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)統(tǒng)計分析[12]。

2 結(jié)果與分析

2.1 HGE孢子制劑對稗草的防效

HGE 孢子制劑對稗草的株高和鮮質(zhì)量防效以及稗草死亡率見表3。對2.0~3.0 葉期稗草只噴施孢子粉處理時，稗草的死亡率為0，稗草株高和鮮質(zhì)量防效也僅為3.11%和7.78%。而在孢子粉中添加不同比例助劑的20 個處理，株高防效、鮮質(zhì)量防效及稗草死亡率均優(yōu)于單獨噴施孢子粉的對照處理，表明在HGE 孢子粉中添加助劑能有效提高其對稗草的防治效率。

表3 HGE 孢子制劑對稗草防效 （單位：%）

2.2 回歸方程的建立與檢驗

二次通用旋轉(zhuǎn)組合實驗方案及結(jié)果如表4 所示。增效劑、溶劑油、穩(wěn)定劑、乳化劑4 個因素對稗草死亡率相互作用所得方差分析結(jié)果詳見表5。

利用DPS 分析軟件對實驗結(jié)果進行分析，得到二次回歸方程為：

回歸方程顯著性檢驗結(jié)果如表4 所示。剔除不顯著項后，得到回歸方程（2）：

表4 二次通用旋轉(zhuǎn)組合實驗設(shè)計與結(jié)果

由表5 可見，回歸方程失擬檢驗F1=1.69967（p=0.3514），差異不顯著，說明控制因素對實驗結(jié)果影響較小，可以進一步對回歸方程進行擬合檢驗。顯著性檢驗F2=24.62342（p=0.0001），達到極顯著水平，說明方程與實際情況擬合良好，能夠反應(yīng)除草效果（死亡率）與增效劑、溶劑油、穩(wěn)定劑和乳化劑的關(guān)系。

2.3 主因子效應(yīng)分析

由表5 可見，回歸方程一次項對稗草死亡率的影響顯著，其中增效劑對稗草死亡率的影響達到極顯著水平（p=0.000077<0.01），溶劑油、穩(wěn)定劑和乳化劑對稗草死亡率也有顯著影響（p<0.05）?；貧w方程的偏回歸系數(shù)（即偏相關(guān)）絕對值的大小可以判明各決定因子的重要程度，系數(shù)的正負表示因子效應(yīng)作用的方向[12]。因此，各因素在實驗取值范圍內(nèi)對稗草死亡率作用大小依次為：X1（增效劑）> X4（乳化劑）> X2（溶劑油）> X3（穩(wěn)定劑），其中X2為負效應(yīng)，其余3 個因素均為正效應(yīng)。

2.4 單因子效應(yīng)分析

將4 個因素中的3 個固定在零水平，對數(shù)學(xué)模型進行降維分析，得到以其中1 個因素為決定變量的偏回歸方程：

上述4 個方程其二次項系數(shù)都是負值，說明其表征的效應(yīng)曲線均是一條開口向下的拋物線，即隨著增效劑、溶劑油、穩(wěn)定劑和乳化劑用量的不斷增加，死亡率將表現(xiàn)出先增后減的趨勢，說明這4 個因素均存在最佳值，用量太高或太低都影響其對稗草的防治效果。

2.5 互作效應(yīng)分析

對數(shù)學(xué)模型的方差分析表明，交互項X1X2的p值>0.05，說明增效劑與溶劑油之間的交互作用對稗草死亡率沒有顯著影響。交互項X1X3和X1X4均達到顯著水平（p值均小于0.05），其中X1X4達到極顯著水平，說明增效劑與穩(wěn)定劑、增效劑與乳化劑之間的交互作用對稗草死亡率有顯著影響（表5）。

2.6 變量輪換直接尋優(yōu)

根據(jù)已建立的數(shù)學(xué)模型，在-1.682≤Xi≤1.682（i=1，2，3）范圍內(nèi)，每個因素取5 個水平（±1.682，±1 和0），對54=625 個方案進行統(tǒng)計尋優(yōu)，在試驗范圍內(nèi)可得稗草最大死亡率為100%，此時各因素取值為：X1=1.682，X2=-1，X3=1.682，X4=-1.682，對應(yīng)著4 種助劑的用量是：1 g 孢子粉中添加8.28 mg 增效劑A（10%吡嘧磺隆WP）、33 μL 增效劑B（2.5%五氟磺草胺OD）、0.25 mL 大豆油、0.5523 g 羧甲基纖維素鈉和0.0318 g SP-20。

2.7 頻率分析及統(tǒng)計尋優(yōu)

變量輪換直接尋優(yōu)法可求出優(yōu)化配方組合，但沒有考慮到隨機因素，在實際生產(chǎn)中很難實現(xiàn)。采用計算機對不同設(shè)計水平下的組合進行模擬試驗，以孢子制劑對稗草殺草活性80% 作為臨界值，獲得大于臨界值的方案有34 個，各變量取值的頻率分布見表6。表6 顯示在95%置信區(qū)間、稗草死亡率大于80%的優(yōu)化方案：增效劑A（10%吡嘧磺隆WP）添加量為6.56~8.10 mg，增效劑B（2.5%五氟磺草胺OD）添加量為26~32 μL，大豆油添加量為0.21~0.33 mL，羧甲基纖維素鈉添加量為0.49~0.53 g，SP-20 添加量為0.09~0.23 g。

表6 優(yōu)化方案中Xi 取值頻率分布表

然而，在現(xiàn)實農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，微生物除草劑中化學(xué)除草劑的添加量越少越好，只要能夠保證微生物除草劑的田間藥效在80%以上即可；穩(wěn)定劑用量也不應(yīng)很多，因為在加水噴霧時，穩(wěn)定劑太多可能會影響制劑在水中分散性。綜合考慮各種影響因素后獲得最終優(yōu)化配方為：增效劑用量為常規(guī)用量的30%，即增效劑A（10%吡嘧磺隆WP）添加量為6.56 mg，增效劑B（2.5%五氟磺草胺OD）添加量為26 μL，大豆油添加量為0.25 mL，羧甲基纖維素鈉添加量為0.49 g，SP-20 添加量為0.10 mL。

對此配方進行試驗驗證，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該制劑配方在溫室對稗草殺草活性為100%，與理論值相符，同時對水稻生長沒有負面影響，進一步證實了優(yōu)化配方的可行性。

3 結(jié)論與討論

微生物除草劑具有對生態(tài)環(huán)境友好、不易產(chǎn)生抗藥性等優(yōu)點，但田間除草效率較低，不如化學(xué)除草劑見效快、防效好[13-14]。這是因為微生物除草劑活性成分易受環(huán)境因子影響而失活或降低感染效率，再加上有些微生物除草劑對靶標雜草具有特性選擇性，通常不能將田間雜草全部除掉，而是將雜草控制在一定閾值內(nèi)，但對作物生長沒有影響。因此，本試驗采用二次通用旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計優(yōu)化HGE 孢子制劑配方時，對靶標稗草防效定于80%，通過頻率分析及統(tǒng)計尋優(yōu)求得在95% 的置信區(qū)間稗草死亡率大于80%的方案有34 個，在這34 個優(yōu)化方案中，4 種助劑的添加量被縮小到一定范圍，在此范圍內(nèi)對目標雜草防效的理論值就應(yīng)在80%以上，從中篩選獲得符合實際生產(chǎn)應(yīng)用的最佳制劑配方。

二次通用旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計可以在減少試驗次數(shù)的同時獲得較為準確的結(jié)果。該試驗方法已經(jīng)被研究人員廣泛應(yīng)用于優(yōu)化數(shù)據(jù)、模型的模擬與預(yù)測中[15-17]。因本試驗數(shù)據(jù)量大，為保證試驗精度，提高試驗效率，特選用此方法優(yōu)化制劑配方中各助劑的添加量。研究結(jié)果表明，建立的數(shù)學(xué)模型擬合檢驗極為顯著，說明方程與實際情況擬合良好，對于稗草死亡率的因子效應(yīng)分析具有實際意義。4 種助劑對稗草死亡率作用大小依次為：X1（增效劑）>X4（乳化劑）>X2（溶劑油）>X3（穩(wěn)定劑）。其中，增效劑對稗草死亡率影響極顯著，溶劑油大豆油、穩(wěn)定劑CMC 和乳化劑SP-20 對稗草死亡率影響顯著。頻率分析及統(tǒng)計尋優(yōu)求得在95% 的置信區(qū)間稗草死亡率大于80%的優(yōu)化方案。綜合生產(chǎn)實際應(yīng)用，將優(yōu)化方案確定為：增效劑用量大約為常規(guī)用量的30%，即增效劑A（10%吡嘧磺隆WP）添加量為6.56 mg，增效劑B（2.5%五氟磺草胺OD）添加量為26 μL，大豆油添加量為0.25 mL，CMC 添加量為0.49 g，SP-20 添加量為0.10 mL。

微生物除草劑與低劑量化學(xué)除草劑復(fù)配有益于微生物除草劑商品化推廣應(yīng)用，這是因為二者混配后產(chǎn)生的菌藥協(xié)同作用能降低其使用劑量，增強微生物除草劑控草效率[18]，還可改變真菌寄主選擇性，擴大殺草譜[7]。PENG 等[19]報道，混合使用40%推薦劑量與亞劑量（2.3×107孢子/mL）真菌Pyricularia setariaeNiskada 孢子就能夠完全控制狗尾草，僅添加10%或40%推薦劑量的烯禾啶后，能有效增強真菌對大齡狗尾草的防治效率。HEINY[20]報道，真菌（Phoma proboscis）與2,4-D和MCPA 混配后在田間能有效防治田旋花。本試驗根據(jù)前期研究篩選到的對HGE 孢子相容性較好的化學(xué)除草劑五氟磺草胺和吡嘧磺隆，通過優(yōu)化方案確定只需推薦用量的30%，即可有效提高HGE 除草效率，起到增效劑的作用，為今后HGE 孢子制劑的推廣應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。