劉猷紅 唐傲 張喜娟 董文軍 劉凱 王文龍 徐英哲 孟英* 來永才*

（1黑龍江省農(nóng)業(yè)科學院耕作栽培研究所/黑龍江省作物分子設(shè)計與種質(zhì)創(chuàng)新重點實驗室，哈爾濱 150086；2 國家耐鹽堿水稻技術(shù)創(chuàng)新中心東北中心，哈爾濱 150086；3 黑龍江省農(nóng)業(yè)科學院，哈爾濱 150086；4 東北農(nóng)業(yè)大學 農(nóng)學院，哈爾濱 150030；第一作者：liuyouhong1011@126.com；*通訊作者：18645146186@163.com，yame0451@163.com）

水稻是世界主要糧食作物之一，其90%以上分布在亞洲，稻米是亞洲超過60%以上人口的主食[1-2]。亞洲栽培稻（Oryza sativa）分為秈和粳兩個亞種，粳稻約占10%，主要集中在中國、韓國和日本[3]，中國粳稻的主產(chǎn)區(qū)在東北三省和江蘇省。基于理想株型和秈粳雜交優(yōu)勢理論的利用，秈粳雜交稻為我國糧食安全做出了巨大貢獻[4]。秈型血緣的引入在提高東北粳稻產(chǎn)量潛力的同時會影響其稻米品質(zhì)性狀，而有關(guān)稻米品質(zhì)遺傳研究大多集中在細胞核遺傳上，對細胞質(zhì)遺傳對品質(zhì)性狀的影響研究則較少。多數(shù)研究認為，秈型雜交稻稻米品質(zhì)性狀受母體基因型和胚乳基因型控制，還可能存在細胞質(zhì)效應(yīng)[5-7]。徐辰武等[8]研究了秈粳正反交細胞質(zhì)對雜種稻米品質(zhì)的影響，結(jié)果表明，秈稻的細胞質(zhì)對直鏈淀粉含量有一定的作用。也有研究認為，北方粳稻某些稻米品質(zhì)性狀受母體或細胞質(zhì)遺傳體系控制[9-10]。林建榮等[11]和PEYMAN 等[12]利用正反交方法進行研究，結(jié)果表明，細胞質(zhì)效應(yīng)對稻米品質(zhì)具有極顯著影響，但環(huán)境與細胞核的互作也不能忽視。由于生物體的基因是在環(huán)境條件作用下表達的，環(huán)境條件的不同可能導致基因表達方式或程度有一定差異[13-14]。以往，多數(shù)學者針對的是雜交稻不育系細胞質(zhì)效應(yīng)和常規(guī)粳稻具有秈型血緣的細胞核遺傳效應(yīng)的研究，而對具有秈型血緣的東北粳稻細胞質(zhì)對稻米品質(zhì)的影響鮮有研究報道。本研究利用細胞質(zhì)秈粳特異分子標記對東北粳稻細胞質(zhì)進行秈粳類型鑒定，再以秈質(zhì)粳核材料與粳質(zhì)粳核材料構(gòu)建雙列雜交群體，解析秈型細胞質(zhì)對粳稻品質(zhì)性狀的遺傳效應(yīng)，旨在為東北粳稻品質(zhì)遺傳改良提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

選取8 份東北地區(qū)主栽粳稻品種用于細胞質(zhì)基因組的秈粳差異位點的分子鑒定，以9311 和日本晴作為對照，進而確定每個品種的細胞質(zhì)基因組的秈粳屬性。

選擇出4 份秈型細胞質(zhì)類型粳稻沈農(nóng)9816（P1）、沈農(nóng)265（P2）、沈農(nóng)9741（P3）和遼粳454（P4）與4 份粳型細胞質(zhì)類型粳稻龍稻18（P5）、綏粳18（P6）、龍粳31（P7）、龍粳47（P8）于2019 年進行不完全雙列雜交，配制正反交組合24 個（表1）。

表1 構(gòu)建24 個正反交材料

1.2 試驗設(shè)計

不完全雙列雜交于2019 年在黑龍江省農(nóng)業(yè)科學院民主試驗園區(qū)試驗田（E1）和沈陽農(nóng)業(yè)大學水稻研究所試驗田（E2）種植，隨機區(qū)組排列，3 次重復，每份材料插植5 行，每叢插單苗，每行10 叢。行株距30.0 cm×13.3 cm。4 月育苗，5 月移栽，田間管理同大田生產(chǎn)。

1.3 測定內(nèi)容與方法

1.3.1 PCR 反應(yīng)體系的建立

根據(jù)秈粳差異片段序列比對方法合成2 個秈粳特異性線粒體引物P1（5’- TGAGACCCGCCCACTATTAC-3’）和P2（5’- CATATAGATCGGAACCCGGA -3’），命名為分子標記mt1，按照趙林森[15]方法（CTAB）提取DNA，再以瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA。PCR 反應(yīng)體系為：PCR 擴增總體積為20 μL，包括DNA 模板2、buffer（MgCl22.0 Mm）2 μL，引物 各1 μL、dNTP 1 μL，Taq DNA 聚合酶0.5 μL，不足部分用ddH2O 補充。擴增程序為：94 ℃預變性4 min，接著94 ℃0.5 min，55 ℃40 s，72 ℃1 min，40 個循環(huán)；最后延伸72 ℃7 min。擴增產(chǎn)物用3%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，最后紫外凝膠成像檢測。

1.3.2 稻米品質(zhì)測定

水稻成熟期籽粒收獲后在室內(nèi)儲藏3 個月，采用大竹FC2K 型礱谷機加工稻谷，測定糙米率；用Kett 精米機加工后稱重，測定精米率；整精米率和外觀品質(zhì)（堊白粒率和堊白度）采用萬深SC-E 型稻米品質(zhì)分析儀測定。蒸煮與食味品質(zhì)（直鏈淀粉含量、蛋白質(zhì)含量和食味值）及營養(yǎng)品質(zhì)（蛋白質(zhì)含量）采用佐竹RCTA11A 型米粒食味計測定。

1.4 數(shù)據(jù)分析

用Excel 2007 軟件整理和錄入數(shù)據(jù)，用SPSS 20軟件進行數(shù)據(jù)分析，LSD0.05法進行差異顯著性檢驗。

2 結(jié)果與分析

2.1 東北粳稻細胞質(zhì)秈粳屬性

從圖1 可以看出，利用分子標記mt1 對8 份東北粳稻的線粒體基因組進行PCR 擴增的目的片段有秈粳差異，可以作為細胞質(zhì)秈粳分型的分子標記。以典型秈稻9311 和典型粳稻日本晴為對照，分子標記mt1 擴增目的片段秈型mtDNA 為1 223 bp，而粳型mtDNA為729 bp，秈粳差異片段大小為494 bp；粳型mtDNA的擴增產(chǎn)物在電泳條帶上領(lǐng)先于秈型mtDNA；通過對線粒體分子標記mt1 的擴增片段長度差異比較可知，沈農(nóng)265、沈農(nóng)9741、沈農(nóng)9816 和遼粳454 的帶型與典型秈稻9311 帶型一致。表明這4 個常規(guī)栽培粳稻品種線粒體為秈型。龍稻18、綏粳18、龍粳31 和龍粳47的帶型與典型粳稻日本晴帶型一致，為粳型線粒體。

圖1 線粒體DNA 的PCR 檢測結(jié)果

2.2 東北粳稻親本及雜交后代稻米品質(zhì)性狀表現(xiàn)及差異性檢驗結(jié)果

將供試遺傳群體在不同環(huán)境下稻米品質(zhì)性狀的平均值列于表2，差異性分析結(jié)果列于表3。方差分析表明，在哈爾濱和沈陽不同生態(tài)環(huán)境下，供試遺傳材料8個稻米主要品質(zhì)指標在不同生態(tài)區(qū)均達極顯著差異，品質(zhì)指標遺傳變異幅度均表現(xiàn)為環(huán)境最大，此外除蛋白質(zhì)含量和食味值品種間差異小于品種與環(huán)境互作，其余品質(zhì)指標均是品種大于其與環(huán)境互作。

表2 供試材料稻米品質(zhì)性狀平均值

表3 雜交后代F1 主要稻米品質(zhì)指標F 值方差分析

2.3 雜交后代F1 稻米品質(zhì)相關(guān)性分析

由表4 可以看出，就秈質(zhì)粳核材料而言，在哈爾濱點，直鏈淀粉含量與食味值極顯著正相關(guān)，而精米率、整精米率和蛋白質(zhì)含量與食味值呈顯著或極顯著負相關(guān)；在沈陽點未找到相關(guān)指標具有顯著正向遺傳效應(yīng)，蛋白質(zhì)含量與食味值極顯著負相關(guān)，糙米率和精米率與食味值顯著負相關(guān)。就粳質(zhì)粳核材料而言，兩試驗點均得出直鏈淀粉與食味值呈極顯著正相關(guān)，蛋白質(zhì)含量、堊白粒率、堊白度與食味值呈極顯著負相關(guān)，且蛋白質(zhì)含量的相關(guān)性最大。說明在適宜的范圍內(nèi)通過增加直鏈淀粉含量和降低蛋白質(zhì)含量有利于提高稻米口感。

表4 不同細胞質(zhì)類型雜交后代F1 的稻米品質(zhì)與食味值的相關(guān)分析

由表5 可以看出，在兩試驗點，秈質(zhì)粳核材料蛋白質(zhì)含量顯著低于粳質(zhì)粳核材料，而大多稻米加工品質(zhì)和蒸煮食味品質(zhì)高于粳質(zhì)粳核材料，說明秈型細胞質(zhì)基因和核質(zhì)互作基因可能有利于提高稻米加工和食味品質(zhì)。哈爾濱試點參試粳稻材料的堊白粒率、堊白度和蛋白質(zhì)含量均顯著低于在沈陽試點種植的相同類型材料，而直鏈淀粉含量顯著高于沈陽試點。說明不同類型材料的稻米品質(zhì)受環(huán)境影響較大。

表5 不同細胞質(zhì)類型粳稻品質(zhì)性狀分析

3 討論與結(jié)論

以往的研究多針對葉綠體秈粳分化位點的基因型進行鑒定，ORF69 是一種鑒定水稻細胞質(zhì)秈粳分型的特殊分子標記[16-17]。為了進一步驗證細胞質(zhì)秈粳分型的準確性，采用秈粳序列比對方法開發(fā)設(shè)計了線粒體秈粳差異引物，本研究篩選到4 份粳稻品種的細胞質(zhì)為秈型，這種粳核秈質(zhì)基因組組合模式并非有意創(chuàng)制，而是地區(qū)生態(tài)適應(yīng)性與育種選擇的結(jié)果。

在東北粳稻育種實踐中，秈粳交雜種優(yōu)勢利用在提高東北粳稻產(chǎn)量的同時，也逐漸改善其稻米品質(zhì)，以往的研究多集中于細胞質(zhì)效應(yīng)對產(chǎn)量相關(guān)性狀影響上[18-21]，而關(guān)于細胞質(zhì)效應(yīng)對秈粳交品種稻米品質(zhì)的影響則研究較少。細胞質(zhì)遺傳效應(yīng)常用的研究方法是雙列雜交比較差異法[22-24]，而細胞質(zhì)效應(yīng)的分析常見于雜交稻方面的研究。石春海等[23]研究認為，雜交水稻稻米營養(yǎng)品質(zhì)性狀雜種優(yōu)勢的表現(xiàn)還受到除種子和母體核基因之外遺傳效應(yīng)的影響，細胞質(zhì)遺傳效應(yīng)對稻米品質(zhì)性狀雜種優(yōu)勢的表現(xiàn)有著不可忽視的作用。朱滿山等[24]研究結(jié)果表明，不育系細胞質(zhì)效應(yīng)對雜種F1的米粒長寬比、堊白粒率、堊白度和直鏈淀粉含量有顯著影響，且因質(zhì)核互作效應(yīng)的不同存在組合的特異性。本研究結(jié)果表明，秈質(zhì)粳核材料的稻米品質(zhì)優(yōu)于粳質(zhì)粳核材料，尤其是稻米加工品質(zhì)和食味值，而食味值與直鏈淀粉含量呈正相關(guān)性，與蛋白質(zhì)含量呈極顯著負相關(guān)。由于試驗點地理環(huán)境不同，不同試驗點秈型細胞質(zhì)遺傳效應(yīng)影響不同的稻米指標，說明品質(zhì)指標受環(huán)境影響較大，但在同一試驗點細胞質(zhì)效應(yīng)和核質(zhì)互作效應(yīng)顯著。

本研究利用正反交方法初步研究了細胞質(zhì)遺傳效應(yīng)對稻米品質(zhì)的影響，由于控制稻米品質(zhì)的一些細胞質(zhì)基因也與核基因一樣產(chǎn)生了某些分化，現(xiàn)有的水稻細胞質(zhì)中存在一些會使米質(zhì)變優(yōu)的基因，下一步研究需構(gòu)建同核異質(zhì)系群體深入挖掘影響稻米品質(zhì)的相關(guān)基因。本研究結(jié)果對于提高東北粳稻稻米品質(zhì)性狀的雜種優(yōu)勢分析效果和組合選配具有一定指導意義。因此，在今后的優(yōu)質(zhì)稻育種中，應(yīng)該注重核質(zhì)匹配的選育工作。