張 崢 崔 泳 王 翀 丁 路 王 武 黃 濤

糖皮質(zhì)激素(glucocorticoids, GC)被廣泛用于治療自身免疫性疾病，但治療后2年內(nèi)易出現(xiàn)骨壞死癥狀[1，2]。糖皮質(zhì)激素性股骨頭壞死(steroid induced necrosis of femoral head，SONFH)已涉及年輕人，嚴重影響患者的生活質(zhì)量[2]。然而，激素性股骨頭壞死的發(fā)病機制尚不清楚。研究顯示，人骨髓間充質(zhì)干細胞(human bone marrow mesenchyml stem cells，hBMSCs)與骨壞死的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[3]。因此，研究hBMSCs的異常成骨分化機制在激素性股骨頭壞死的治療中有重要意義。

長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA, lncRNA)HOTAIR是一種關(guān)鍵的致癌lncRNA，參與細胞增殖、凋亡與分化的調(diào)節(jié)[4]。已知lncRNA和微小RNA(miRNA)的相互作用可以影響hBMSCs的成骨分化，且上調(diào)miR-17-5p抑制成骨[5，6]。但在激素性股骨頭壞死中HOTAIR對miR-17-5p的調(diào)控關(guān)系鮮有報道。因此，本研究探討激素性股骨頭壞死中HOTAIR的異常表達對hBMSCs的成脂和成骨分化的影響以及對預(yù)測靶基因的調(diào)控作用。

材料與方法

1.受試者和標本采集：骨髓樣本取自2018年4月～2020年3月在筆者醫(yī)院接受手術(shù)的25例激素性股骨頭壞死患者和25例股骨頸骨折患者。根據(jù)Steinberg或賓夕法尼亞大學(xué)的系統(tǒng)，術(shù)前X線片和磁共振診斷激素性股骨頭壞死。所有服用超過1800mg 糖皮質(zhì)激素或長期糖皮質(zhì)激素治療超過4周的激素性股骨頭壞死患者均納入研究，同時排除心血管疾病、先天性疾病或腫瘤相關(guān)疾病的患者。將25例激素性股骨頭壞死患者骨髓組織命名為激素性股骨頭壞死組；將25例股骨頸骨折患者的骨髓組織命名為正常對照組，股骨頸骨折患者沒有糖皮質(zhì)激素治療史。將25例激素性股骨頭壞死的患者命名為激素性股骨頭壞死組。所有參與者均簽署了書面知情同意書，本研究獲得了筆者醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理學(xué)委員會批準(倫理審批號：20180182-91)。

2.實驗試劑耗材：hBMSCs購自武漢普諾賽生命科技公司；地塞米松(dexamethasone,DEX，ID0170)和茜素紅染液試劑盒(G8550)購自美國Solarbio科技有限公司；β-甘油磷酸鈉(G8100)和抗壞血酸(A8100)購自美國Sigma-Aldrich生物科技有限公司；3-異丁基-1-甲基黃嘌呤(IBMX)、吲哚美辛及油紅O染色液(G1262)購自北京索萊寶科技有限公司；麗春紅S(3761-53-3)購自上海國藥集團化學(xué)試劑有限公司；電化學(xué)(electrochemiluminescence, ECL)發(fā)光液(ECL-0011)購自北京鼎國生物技術(shù)有限責(zé)任公司；堿性磷酸酶測試盒購自南京建成生物工程研究所有限公司 A059-2；Trizol購自美國英杰生命技術(shù)有限公司；SYBRGreen PCR試劑盒購自德國Qiagen公司；real-time檢測儀(ABI-7500)購自美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司。

3.hBMSCs培養(yǎng)：hBMSCs在含10%胎牛血清的低糖DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)環(huán)境為37℃，含5% CO2，每3天更換新鮮培養(yǎng)基。將hBMSCs細胞分為兩組，分別命名為對照組和地塞米松組。收集5×105個/毫升正常培養(yǎng)的細胞用于對照組，而地塞米松組hBMSCs則在上述培養(yǎng)基中加入1×10-7mol/L的地塞米松30μl，其余方法不變，收集5×105個/毫升細胞用于檢測。

4.細胞轉(zhuǎn)染：過表達HOTAIR載體(過表達HOTAIR組)和空載體(空載組)，miR-17-5p的擬似物(miR-17-5p-mimics, mimic組)、miR-17-5p的抑制劑(miR-17-5p-inhibitors, inhibitor組)和二者相應(yīng)的陰性對照(negative control, NC組)均構(gòu)建于上海GenePharma公司；mimic、inhibitor、NC的轉(zhuǎn)染方法均根據(jù)制造商的說明執(zhí)行操作，通過 Lipofectamine 2000(美國Invitrogen公司)進行轉(zhuǎn)染。反轉(zhuǎn)錄-定量聚合酶鏈反應(yīng)(RT-qPCR)用于確定轉(zhuǎn)染效率。

5.RT-qPCR 檢測：根據(jù)制造商的說明，TRIzol 試劑(美國Invitrogen公司)用于從25例正常對照組和25例激素性股骨頭壞死組骨髓組織中分別提取總RNA。從對照組hBMSCs細胞和地塞米松組hBMSCs細胞中分別提取細胞總RNA。通過PrimeScript RT-PCR試劑盒提取總 RNA 用于 cDNA 的反轉(zhuǎn)錄。隨后，通過SYBR Green PCR試劑盒在ABI 7500實時PCR系統(tǒng)上進行RT-PCR。mRNA相對表達量采用2-ΔΔCt法計算，以GAPDH或U6為內(nèi)參。引物方向如下：HOTAIR上游引物為 5′-TGATAGGATACATCTTGGACATGGA-3′，下游引物為5′-AACCTAATGAAACAAGTCCTGACATACA-3′；miR-17-5p上游引物為5′-CGCGAATTCTTGAGGTGAGGCTCAGGAGG-3′，下游引物為5′-ACGGGATCCTTGGCTACAGGCAAAGGGTT-3′；U6上游引物為 5′-CTCGCTTCGGCAGCAGCACATATA-3′，下游引物為 5′-AAATATGGAAACGCTTCACGA-3′； Smad7上游引物為 5′-TCGAAGTTCATTCCGTTAGCGCGAGC-GAATCCT-3′，下游引物為5′-TCCAGTACGGTACCGCCTGCCGCCTCAA-3′；RUNX2上游引物為5′-TCGCACGTCAAGTCACAGGCCGGAATATCGT-3′，下游引物為5′-CAGCTTAAGCCACATGGGGACCTAG-CTCTGA-3′； PPAR-γ上游引物為 5′-GTCGCGGATCATGTGAGGACCGTTCCAGCTTA-3′，下游引物為5′-GAGDCTTGATCCCTTCGTGAGCGCAGTCGC-3′。PCR擴增后，實時熒光定量PCR儀自動分析結(jié)果，計算公式如下：△Ct= Ct目的基因-Ct內(nèi)參，記為ΔCt對照，用各組的ΔCt分別減去ΔCt對照平均，求得ΔΔCt值，再計算各組2-ΔΔCt值，即為各組中基因的相對表達量。

6.Western blot法檢測：BCA測定hBMSCs中總蛋白的濃度。將等量的蛋白質(zhì)(30μg)進行 10% 十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳并轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。用5%脫脂牛奶封閉后，將膜與 Smad7(1∶500)和GAPDH(1∶1000)的一抗在4℃下孵育過夜。隨后將膜與HRP 標記的二抗(1∶5000)在37℃下孵育1h。用ECL系統(tǒng)顯示蛋白條帶，用ImageJ -lab 3.0分析條帶強度。

7.雙熒光素酶報告基因檢測：通過StarBase預(yù)測HOTAIR與miR-17-5p的潛在結(jié)合位點，上海吉瑪公司合成相關(guān)的引物[HOTAIR突變型(HOTAIR-MUT)和HOTAIR野生型(HOTAIR-WT)]基因制藥。將hBMSCs接種在96孔板中直到生長到約85%的濃度，并使用lipofectamine 2000聯(lián)合轉(zhuǎn)染mimic和HOTAIR-MUT或OTAIR-WT，或用lipofectamine 2000聯(lián)合轉(zhuǎn)染NC和HOTAIR-MUT或OTAIR-WT。分別設(shè)置為mimic組和NC組、HOTAIR-MUT組、HOTAIR-WT組。轉(zhuǎn)染48h后，用雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)檢測相對熒光強度。

通過StarBase預(yù)測 Smad7與miR-17-5p的潛在結(jié)合位點，上海吉瑪公司合成相關(guān)的引物[Smad7-3′UTR突變型(Smad7-3′UTR-MUT)和Smad7-3′UTR野生型(Smad7-3′UTR-WT)]基因制藥。將hBMSCs接種在96孔板中直到生長到約85%的濃度，并使用lipofectamine 2000聯(lián)合轉(zhuǎn)染mimic和Smad7-3′UTR-WT(mimic+Smad7-3′UTR-WT組)，或聯(lián)合轉(zhuǎn)染mimic和Smad7-3′UTR-MUT(mimic+Smad7-3′UTR-MUT組)，或者聯(lián)合轉(zhuǎn)染NC和Smad7-3′UTR-WT(NC+Smad7-3′UTR-WT組)。轉(zhuǎn)染48h后，用雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)檢測相對熒光強度。

8.細胞成骨誘導(dǎo)和成脂誘導(dǎo)實驗分組：hBMSCs分為hBMSCs組、hBMSCs+成骨誘導(dǎo)液組、hBMSCs+成骨誘導(dǎo)液+空載組、hBMSCs+成骨誘導(dǎo)液+過表達HOTAIR慢病毒組、hBMSCs+成脂誘導(dǎo)液組、hBMSCs+成脂誘導(dǎo)液+空載組和hBMSCs+成脂誘導(dǎo)液+過表達HOTAIR慢病毒組。利用成骨誘導(dǎo)液和成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基100ml(含10% FBS，2%雙抗，0.01μmol/L DEX，10mmol/L β-甘油磷酸鈉，50mg/L抗壞血酸)誘導(dǎo)成骨分化。將100μl 1×105個/毫升的P3代細胞的單細胞懸液滴加至細胞爬片進行孵育，2h后向培養(yǎng)皿內(nèi)加入DMEM完全培養(yǎng)基2ml孵育，24h后首次換液，并將培養(yǎng)液換為成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)液，2～3天進行換液，培養(yǎng)至14天，取細胞上清進行堿性磷酸酶活性測定和茜素紅染色。細胞成脂誘導(dǎo)：①BMSCs接種到35mm細胞培養(yǎng)皿，并在含有10%FBS的DMEM培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)；②待細胞貼壁并長到90%時，換成成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)基進行培養(yǎng)(成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)基：DMEM，10μg/ml胰島素，1μmol/L DEX，0.5mmol/L IBMX，0.1mmol/L吲哚美辛)；③3天換液1次，誘導(dǎo)分化14天。按照“RT-qPCR檢測”項中的方法檢測每組hBMSCs細胞中RUNX2和PPAR-γ的表達。

9.茜素紅染色：細胞接種于6孔板內(nèi)，誘導(dǎo)培養(yǎng)至28天時進行茜素紅染色。具體染色步驟：取出6孔板，棄盡原培養(yǎng)液，無菌PBS漂洗2次；4%多聚甲醛固定15min；棄固定液，雙蒸水漂洗3次；每孔加入0.2%茜素紅染液2ml，染色30min；棄去染料，雙蒸水漂洗5次；充分漂洗后，每孔加入適量雙蒸水防止孔內(nèi)干燥，顯微鏡下觀察拍照。

10.堿性磷酸酶ALP活性測定：吸取誘導(dǎo)分化14天各組中細胞的培養(yǎng)液，1000～1500r/min，離心10min，取上清液備用；酚標準應(yīng)用液配制：1.1mg/ml酚標準貯備液∶蒸餾水=1∶54，現(xiàn)配現(xiàn)用；輕輕振蕩孔板，520nm波長測定各孔吸光度(A)。

11.油紅O染色：將各組誘導(dǎo)分化14天的細胞棄去上層培養(yǎng)液，用PBS清洗3次；每孔加入1ml 10%中性甲醛固定30min，PBS洗滌3次；加入0.5%油紅工作液，避光染色1h；異丙醇漂洗，洗去多余染料，加PBS拍照觀察。

結(jié) 果

1.DEX處理的hBMSCs中HOTAIR/miR-17-5p/Smad7的表達：激素性股骨頭壞死組中HOTAIR和 Smad7的表達較對照組上調(diào)(P均<0.05)，而miR-17-5p下調(diào)(P<0.05，圖1中A～C)。地塞米松組hBMSCs的增殖率較對照組降低，而HOTAIR和 Smad7的mRNA表達上調(diào)，miR-17-5p表達水平降低(P均<0.05，圖1中D～G)。

圖1 激素性股骨頭壞死的骨髓組織和地塞米松處理的hBMSCs后HOTAIR/miR-17-5p/Smad7通路分子的表達以及細胞增殖率A～C.RT-qPCR檢測激素性股骨頭壞死組(n=25)和正常對照組(n=25)患者骨髓樣本中HOTAIR、miR-17-5p、Smad7的相對表達；D.CCK-8法測定hBMSCs增殖率；E、F.RT-qPCR檢測10-8mol/L DEX處理的hBMSCs中HOTAIR、miR-17-5p和 Smad7的相對表達。*P<0.05

2.miR-17-5p是HOTAIR的靶點：StarBase預(yù)測發(fā)現(xiàn)，HOTAIR對miR-17-5p具有直接調(diào)控潛力(圖2A)。與HOTAIR-WT聯(lián)合NC組比較，HOTAIR-WT聯(lián)合mimic組的熒光素酶活性降低(P<0.05，圖2B)，而HOTAIR-MUT組中NC組與mimic組比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05，圖2B)。此外，激素性股骨頭壞死組中HOTAIR與miR-17-5p表達呈負相關(guān)(P<0.05，圖2C)。

圖2 miR-17-5p是HOTAIR的靶點A.HOTAIR和miR-17-5p的假定結(jié)合位點;B.雙熒光素酶基因報告檢測HOTAIR和miR-17-5p之間的結(jié)合；C.SONFH患者HOTAIR與miR-17-5p表達的相關(guān)性。與NC組比較，*P<0.01

3.Smad7是miR-17-5p的靶基因：StarBase預(yù)測表明，miR-17-5p對Smad7具有直接調(diào)控潛力(圖3A)。與NC+Smad7-3′UTR-WT組比較，hBMSCs的mimic+Smad7-3′UTR-WT組的熒光素酶活性顯著降低，而mimic+Smad7-3′UTR-MUT組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(圖3B)。此外，mimic可以抑制Smad7的表達，inhibitor上調(diào)了Smad7的表達(P<0.05，圖3C)。激素性股骨頭壞死組織中Smad7與miR-17-5p表達呈負相關(guān)(P<0.05，圖3D)。

圖3 Smad7是miR-17-5p的靶基因A.Smad7和miR-17-5p的假定結(jié)合位點;B.雙熒光素酶基因報告檢測 Smad7和miR-17-5p之間的結(jié)合;C.Western blot法檢測Smad7的表達;D.激素性股骨頭壞死患者Smad7和miR-17-5p表達的相關(guān)性。*P<0.001

4.HOTAIR過表達對hBMSCs成骨分化的影響：與hBMSCs組比較，成骨誘導(dǎo)后ALP活性水平增加(P<0.05)；而轉(zhuǎn)染過表達HOTAIR慢病毒顯著降低ALP活性水平(P<0.05)；與hBMSCs組比較，hBMSCs的成脂誘導(dǎo)組、成脂誘導(dǎo)+空載組和成脂誘導(dǎo)+過表達HOTAIR組中ALP活性明顯降低(P<0.05)，詳見圖4A。而過表達HOTAIR抑制RUNX2的表達(P<0.05)，詳見圖4B。

hBMSCs經(jīng)過成骨培養(yǎng)基誘導(dǎo)之后，視野內(nèi)茜素紅染色增加，細胞顯著成骨(P<0.05)；轉(zhuǎn)染過表達HOTAIR慢病毒顯著抑制成骨分化；成脂誘導(dǎo)組、成脂誘導(dǎo)+空載組和成脂誘導(dǎo)+過表達HOTAIR組基本無成骨形成，詳見圖4C。

圖4 HOTAIR過表達對hBMSCs成骨分化的影響A.ALP活性檢測結(jié)果；B.RTqPCR檢測RUNX2的mRNA相對水平；C.茜素紅染色(×200)。與hBMSCs組比較，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001；#P<0.01

5.HOTAIR過表達對hBMSCs成脂分化的影響：hBMSCs經(jīng)成脂培養(yǎng)基誘導(dǎo)之后，油紅O染色增加(P<0.05)；轉(zhuǎn)染過表達HOTAIR慢病毒顯著促進成脂分化，油紅O染色增加(P<0.05)。而成骨誘導(dǎo)組、成骨誘導(dǎo)+空載組和成骨誘導(dǎo)+過表達HOTAIR組基本無成脂形成(P>0.05)，詳見圖5。

圖5 HOTAIR過表達對hBMSCs成脂分化的影響A.油紅O染色(×200)；B.油紅O陽性細胞數(shù)量;C.RTqPCR檢測RRAR-γ的相對表達水平。與hBMSCs組比較，*P<0.01，**P<0.001；#P<0.01

6.HOTAIR過表達對miR-17-5p和 Smad7表達的影響:過表達HOTAIR后的成骨細胞和成脂細胞中miR-17-5p水平顯著降低(P<0.05)，而 Smad7的水平顯著升高(P<0.05)，詳見圖6。

圖6 過表達HOTAIR對分化的hBMSCs中 Smad7和miR-17-5p的影響成骨誘導(dǎo)(A)和成脂誘導(dǎo)(B)中hBMSCs的miR-17-5p相對表達。通過RT-qPCR檢測成骨分化(C)和成脂分化(D)誘導(dǎo)的hBMSCs中 Smad7mRNA的相對表達。與hBMSCs比較，*P<0.01，**P<0.001；#P<0.01

討 論

BMSCs與股骨頭壞死(osteonecrosis of the femoral head，ONFH)發(fā)展密切相關(guān)，而且lncRNAs和miRNAs在ONFH發(fā)展中也具有調(diào)控作用[7，8]。HOTAIR已被證實在癌癥中高表達，且參與細胞增殖、分化和凋亡[9]。本研究中HOTAIR在激素性股骨頭壞死組的組織中表達量增加，而miR-17-5p表達下調(diào)。體外DEX也誘導(dǎo)了HOTAIR和 Smad7的表達，促進了hBMSCs增殖。此外，過表達HOTAIR會抑制hBMSCs中miR-17-5p表達，并促進 Smad7表達。研究還發(fā)現(xiàn)，HOTAIR在非創(chuàng)傷性O(shè)NFH樣本中上調(diào)，且抑制HOTAIR的表達可以促進成骨分化和成骨細胞增殖，表明HOTAIR參與抑制hBMSCs的成骨分化[10,11]。

研究表明，miR-17-5p通過靶向 Smad7促進hMSC-BM細胞的增殖和分化[12]。本研究首先用StarBase預(yù)測了HOTAIR和miR-17-5p、miR-17-5p和 Smad7的3′UTR均具有結(jié)合位點，并通過熒光素酶基因報告實驗證實HOTAIR和miR-17-5p、miR-17-5p和 Smad7的直接作用；另外，HOTAIR與miR-17-5p以及 Smad7與miR-17-5p均呈負相關(guān)。表明在BMSCs中，HOTAIR/miR-17-5p/Smad7三者可以通過直接作用從而對細胞的分化發(fā)揮重要作用。

RUNX2是一種特異性轉(zhuǎn)錄因子，參與腫瘤轉(zhuǎn)移和成骨分化[13]。已證明 HOTAIR過表達會抑制RUNX2的mRNA表達[14]。在本研究中，筆者獲得了類似的結(jié)論，HOTAIR的過表達顯著抑制成骨誘導(dǎo)細胞中RUNX2的mRNA?？傊@些結(jié)果表明高表達HOTAIR后 hBMSCs中miR-17-5p被抑制，并抑制了hBMSCs的成骨分化。

研究已證實HOTAIR參與BMSCs的成脂分化作用，例如Kalwa等[15]研究表明，HOTAIR可促進MSCs的成脂分化。另有研究證實，HOTAIR在激素性股骨頭壞死模型小鼠中高表達，這與筆者在激素性股骨頭壞死患者體內(nèi)的觀察結(jié)果一致[14]。該研究還發(fā)現(xiàn)，成脂分化后HOTAIR的表達上調(diào)，但是成骨分化后下調(diào)。而且HOTAIR過表達抑制成骨分化和RUNX2、OCN、ALP的表達，而且增加了成脂分化[14]。而本研究中利用油紅O染色檢測觀察到HOTAIR過表達明顯促進了油紅O染色效果，并增加了成脂標志物RRAR-γ的表達。

綜上所述，HOTAIR表達在激素性股骨頭壞死的組織中上調(diào)，而miR-17-5p 表達下調(diào)， Smad7表達上調(diào)。而且在成脂分化和成骨分化的hBMSCs中HOTAIR過表達可通過直接抑制miR-17-5p上調(diào) Smad7。而且HOTAIR過表達可抑制成骨分化促進成脂分化。本研究可能為激素性股骨頭壞死的治療和診斷提供新的見解。