馬亮亮 張俊飛 田 芳 韓鳳玉

壓瘡(pressure ulcer，PU)是由于局部組織長期受壓，繼而發(fā)生持續(xù)性缺血、缺氧及營養(yǎng)不良，從而導(dǎo)致組織發(fā)生了潰爛和壞死的疾病[1]。歐美等國家研究指出PU已經(jīng)是繼癌癥和心血管疾病之后醫(yī)療花費(fèi)最高的疾病[2,3]。目前關(guān)于PU的治療主要包括藥物療法、手術(shù)、電刺激、封閉負(fù)壓引流療法和紅外線光療等方法[4,5]。比較手術(shù)等西醫(yī)治療方案，中醫(yī)藥外用膏劑、散劑、煎劑、艾灸、針灸和內(nèi)服藥物等方法在治療PU方面也取得了很好的效果，并且患者治療費(fèi)用和接受度更高[6]。

產(chǎn)自寧夏回族自治區(qū)的枸杞是我國傳統(tǒng)名貴中藥之一，現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)，從枸杞中提取的多種天然化合物具有多種藥理活性，其中枸杞多糖(Lycium barbarum polysaccharides，LBP)因具有抗氧化、抗衰老、抗腫瘤及免疫調(diào)節(jié)等多種藥理作用備受關(guān)注[7,8]。同時(shí)研究發(fā)現(xiàn)，LBP在治療皮膚損傷和潰瘍中都表現(xiàn)出良好的化學(xué)活性[9]。此外，LBP已經(jīng)被證明可以通過激活Wnt/β-catenin信號(hào)通路減輕高血糖加重腦的缺血再灌注損傷和增加骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的活化治療骨質(zhì)疏松[10,11]。但是LBP是否可以通過調(diào)控Wnt/β-catenin信號(hào)通路促進(jìn)PU創(chuàng)面的愈合尚不清楚，因此，本研究擬通過構(gòu)建PU大鼠模型，探討LBP是否通過Wnt/β-catenin信號(hào)通路促進(jìn)創(chuàng)面愈合，從而為LBP臨床治療PU提供理論依據(jù)。

材料與方法

1.主要儀器與試劑：枸杞多糖(批號(hào)：MCA2016157)、水合氯醛(批號(hào)：P11259)、IL-6(批號(hào)：P1042)、IL-1β(批號(hào)：P1037)、TNF-α(批號(hào)：P1003)、SOD(批號(hào)：P1042)、MDA(批號(hào)：P 1040)和VEGF(批號(hào)：P1012)酶聯(lián)免疫吸附測定法(Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay， ELISA)試劑盒購自上海善然生物科技有限公司；Wnt1、β-catenin、GSK-3β和β-actin引物由上海英杰生物科技有限公司設(shè)計(jì)合成。RT-PCR試劑盒(批號(hào)：D7277S)、BCA蛋白濃度測定試劑盒(批號(hào)：P0009)、Wnt1(批號(hào)：AF8349)、β-catenin(批號(hào)：AC106)、GSK-3β(批號(hào)：AF1531)和GAPDH(批號(hào)：AF1186)購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。實(shí)時(shí)定量Agilent PCR 儀購自美國安捷倫科技公司。

2.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：SPF級(jí)雄性SD大鼠[許可證號(hào)：SCXK(寧)2015-0001]18只，6～8周齡。適應(yīng)性飼養(yǎng)后嚴(yán)格按照動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理相關(guān)規(guī)定開展實(shí)驗(yàn)，本研究通過寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理學(xué)委員會(huì)批準(zhǔn)(倫理審批號(hào)：2020-096)。

3.動(dòng)物模型制備：10%水合氯醛(0.3ml/kg)腹腔注射麻醉大鼠，將其背部皮膚剃毛至表面無毛發(fā)，備皮區(qū)域面積約為10cm×5cm。將其背部皮膚提起后對(duì)稱性扣上強(qiáng)力磁鐵，靠磁鐵的強(qiáng)大磁力作用對(duì)其進(jìn)行壓力損傷，造成壓迫缺血，采用夾(缺血)12h再松(灌注)12h連續(xù)3個(gè)循環(huán)的造模方法對(duì)大鼠的皮膚造成損傷制備PU模型[4]。

4.分組和給藥：將大鼠隨機(jī)分為3組，每組6只大鼠，既對(duì)照組、模型組和LBP組。LBP組將LBP粉末溶于0.9%氯化鈉溶液配制成LBP溶液，按照100mg/(kg·d)連續(xù)灌胃干預(yù)2周。對(duì)照組和模型組采用同等體積0.9%氯化鈉溶液給予連續(xù)灌胃2周。實(shí)驗(yàn)執(zhí)行期間所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物均正常飲水飲食。給藥后12h 10%水合氯醛(0.3ml/kg)腹腔注射麻醉大鼠后進(jìn)行組織取材。

5.創(chuàng)面愈合率的測定：參考高翔等[12]研究方法在治療后第1天、3天、7天和14天進(jìn)行大鼠PU創(chuàng)面愈合率計(jì)算[愈合率(%)=(造模后PU面積-治療后PU面積)/造模后PU面積×100%]。通過ImageJ軟件進(jìn)行輔助計(jì)算。

6.HE染色：實(shí)驗(yàn)結(jié)束后對(duì)各組大鼠PU創(chuàng)面進(jìn)行組織取材，組織進(jìn)行4%多聚甲醛保存，按照組織病理學(xué)檢測要求對(duì)組織進(jìn)行石蠟包埋處理后，按照HE染色試劑盒相關(guān)說明書對(duì)組織進(jìn)行HE病理染色檢測，顯微鏡下觀察并拍照。

7.ELISA法檢測：大鼠麻醉后通過心尖采血，按照操作要求離心保存血清后參照腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor,TNF)-α、白細(xì)胞介素(interleukin，IL)-6、IL-1β，超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、丙二醛(malondialdehyde,MDA)、血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)的ELISA試劑盒說明書分別進(jìn)行檢測。

8.反轉(zhuǎn)錄定量聚合酶鏈反應(yīng)(RT-qPCR)檢測：對(duì)各組大鼠PU創(chuàng)面組織進(jìn)行取材后，參考于澤洋等[13]研究方法進(jìn)行，主要包括提取組織中總RNA后按照相關(guān)操作試劑盒進(jìn)行cDNA合成，最后采用熒光定量PCR試劑盒在反應(yīng)條件下進(jìn)行PCR檢測。相對(duì)表達(dá)水平采用2-ΔΔCt分析方法測定。各基因引物序列詳見表1。

表1 基因引物方向(5′→3′)

9.Western blot法檢測PU組織中相關(guān)蛋白表達(dá)情況：對(duì)各組大鼠PU創(chuàng)面組織蛋白進(jìn)行提取后，參考于澤洋等[13]研究方法對(duì)Wnt1(抗體1∶1000)、β-catenin(抗體1∶1000)、GSK-3β(抗體1∶1000)和GAPDH(抗體1∶1000)蛋白表達(dá)情況進(jìn)行檢測，收集蛋白帶后用凝膠成像分析系統(tǒng)分析相對(duì)光密度，用靶蛋白積分光密度(IOD)值/GAPDH(IOD)值顯示靶蛋白相對(duì)水平[13]。

結(jié) 果

1.LBP對(duì)PU大鼠創(chuàng)面愈合的影響： 大鼠PU模型制備成功后給予LBP治療，在第1天、3天、7天和14天時(shí)分別測量創(chuàng)面愈合情況，結(jié)果表明LBP組大鼠創(chuàng)面在3天、7天和14天時(shí)治愈率明顯高于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),詳見圖1和圖2。

圖1 LBP治療后不同時(shí)間點(diǎn)大鼠PU創(chuàng)面治愈率*P<0.05

圖2 LBP治療后不同時(shí)間點(diǎn)大鼠PU創(chuàng)面情況

2.LBP對(duì)PU大鼠創(chuàng)面組織學(xué)改變：PU大鼠創(chuàng)面組織損傷嚴(yán)重，產(chǎn)生了大量的炎性細(xì)胞浸潤，成纖維細(xì)胞和毛細(xì)血管數(shù)目明顯減少，給予LBP治療后PU大鼠創(chuàng)面組織損傷得到了有效的修復(fù)，減輕了表皮炎性浸潤增加了毛細(xì)血管數(shù)量，詳見圖3。

圖3 各組大鼠皮膚HE染色病理結(jié)果(×400)A.空白組；B.模型組；C.LBP組

3.LBP對(duì)PU大鼠血清TNF-α、IL-6和IL-1β表達(dá)水平的影響：PU大鼠血清中炎性細(xì)胞因子TNF-α、IL-6和IL-1β表達(dá)水平明顯升高，給予LBP治療后可以有效降低血清中炎性細(xì)胞因子TNF-α、IL-6和IL-1β的表達(dá)水平，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，詳見圖4。

圖4 LBP對(duì)PU大鼠血清TNF-α、IL-6、IL-1β表達(dá)水平的影響A.TNF-α;B.IL-6;C.IL-1β。*P<0.05

4.LBP對(duì)PU大鼠血清SOD、MDA和VEGF表達(dá)水平的影響：與模型組比較，LBP對(duì)PU大鼠治療后可以明顯提高血清SOD表達(dá)水平，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，同時(shí)LBP可以降低PU大鼠血清MDA表達(dá)水平，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。LBP治療后與模型組比較，可以明顯提高PU大鼠血清中VEGF表達(dá)水平，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，詳見圖5。

圖5 LBP對(duì)PU大鼠血清SOD、MDA和VEGF表達(dá)水平的影響A.SOD;B.MDA;C.VEGF。*P<0.05

5.LBP對(duì)PU大鼠組織中相關(guān)基因mRNA表達(dá)的影響：與模型組比較，LBP治療后PU大鼠創(chuàng)面組織中Wnt1 mRNA和β-catenin mRNA表達(dá)明顯升高，而GSK-3β mRNA表達(dá)降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，詳見圖6。

圖6 LBP對(duì)PU大鼠組織中相關(guān)基因mRNA表達(dá)水平的影響A.Wnt1 mRNA;B.β-catenin mRNA;C.GSK-3β mRNA。*P<0.05

6.LBP對(duì)PU大鼠組織中相關(guān)蛋白表達(dá)的影響：Western blot法結(jié)果表明，與模型組比較，LBP治療后可以明顯提高PU大鼠創(chuàng)面組織中Wnt1和β-catenin蛋白表達(dá)水平，降低GSK-3β蛋白表達(dá)水平，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，詳見圖7。

圖7 LBP對(duì)PU大鼠組織中相關(guān)蛋白表達(dá)水平的影響A.Western blot法檢測結(jié)果；B.Wnt1/GAPDH;C.β-catenin/GAPDH;D.GSK-3β/GAPDH。*P<0.05

討 論

PU又稱為壓力性潰瘍，目前對(duì)其定義中明確提出了“三力學(xué)說”，即壓力、剪切力和摩擦力，各因素可單獨(dú)或復(fù)合存在作用。雖然PU的具體發(fā)病機(jī)制依然不清，但是目前主要認(rèn)為其與皮膚缺血損傷、缺血再灌注損傷、代謝障礙和細(xì)胞變形等機(jī)制相關(guān)[2,14]。其中缺血再灌注損傷在PU的發(fā)生機(jī)制中得到了越來越多的關(guān)注，筆者前期研究與其他人研究都采用了缺血再灌注損傷方法進(jìn)行模型制備，病理結(jié)果顯示模型穩(wěn)定可靠，為后續(xù)研究提供了保障[4,12, 13]。對(duì)于PU創(chuàng)面治療中，損傷皮膚組織的治愈率是判斷藥物治療成功的主要指標(biāo)之一[12,13]。

本研究表明，給予LBP治療后大鼠PU創(chuàng)面治愈率明顯高于模型組。同時(shí)組織病理檢測也表明，給予LBP治療后創(chuàng)面得到了有效修復(fù)，減輕了表皮炎性浸潤增加了毛細(xì)血管數(shù)量促進(jìn)了創(chuàng)面的愈合。有研究表明，在PU形成過程中會(huì)產(chǎn)生大量炎性細(xì)胞因子，這些炎性細(xì)胞因子會(huì)破壞酶的活性降解細(xì)胞的基質(zhì)和纖維連接蛋白，從而導(dǎo)致了創(chuàng)面的難愈合[15]。本研究表明，給予LBP治療后可以有效降低血清中炎性細(xì)胞因子TNF-α、IL-6和IL-1β的表達(dá)水平，通過降低機(jī)體炎性細(xì)胞因子水平從而促進(jìn)了創(chuàng)面的愈合，研究與鄭焱江等[16]研究結(jié)果相一致。有研究認(rèn)為VEGF表示增高可以誘導(dǎo)微血管通透性增強(qiáng)，導(dǎo)致血漿蛋白廣泛滲漏，直接或間接地改變細(xì)胞外主要成分，形成臨時(shí)的新基質(zhì)來支持內(nèi)皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞的遷移，從而促進(jìn)傷口愈合[17]。本研究給予LBP治療后PU大鼠血清中VEGF表達(dá)水平明顯增加，組織病理也表明更多的毛細(xì)管生成促進(jìn)了創(chuàng)面的愈合。此外，在PU損傷中也會(huì)導(dǎo)致MDA表達(dá)水平升高和SOD表達(dá)降低，引起氧化應(yīng)激損傷加重了皮膚組織損傷[18]。筆者研究表明，LBP治療后可以有效提高血清中SOD表達(dá)水平，而降低MDA表達(dá)水平，表明LBP可以通過抑制氧化應(yīng)激損傷達(dá)到治療PU的作用，結(jié)果與肖洪玲等[19]研究結(jié)果相近。

在創(chuàng)面愈合中涉及多種調(diào)控因素和細(xì)胞信號(hào)通路，其中Wnt信號(hào)通路與創(chuàng)面修復(fù)密切相關(guān)[20]。研究表明，在皮膚發(fā)育過程中，Wnt信號(hào)通路是出現(xiàn)最早，也是皮膚損傷修復(fù)中最重要的信號(hào)通路。在毛發(fā)生長調(diào)節(jié)中Wnt信號(hào)通路也是必不可少，它可以促進(jìn)毛裹生長，其中Wnt1是激活調(diào)控Wnt信號(hào)通路的關(guān)鍵蛋白[21]。此外，β-catenin也是Wnt信號(hào)通路中的關(guān)鍵蛋白，它可以進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)，從而導(dǎo)致靶基因CDK4等的表達(dá)，改變細(xì)胞周期[22]。而在皮膚損傷時(shí)，周圍細(xì)胞釋放的Wnt信號(hào)啟動(dòng)了β-catenin核轉(zhuǎn)位，使其與Lef1/TCF等DNA結(jié)合蛋白形成轉(zhuǎn)錄復(fù)合物，啟動(dòng)Wnt靶基因轉(zhuǎn)錄和細(xì)胞的増殖分化過程，促進(jìn)皮膚修復(fù)，而β-catenin蛋白表達(dá)降低會(huì)提高下游GSK-3β蛋白表達(dá)的增加使得皮膚自行修復(fù)能力下降，不利于創(chuàng)面的愈合[23]。

有研究表明，在PU的組織創(chuàng)面中，會(huì)出現(xiàn)β-catenin表達(dá)降低，而GSK-3β蛋白表達(dá)增加[24]。仇蓮胤等[25]研究發(fā)現(xiàn)，黃芪提取液可以有效增加Wnt1和β-catenin表達(dá)，降低GSK-3β表達(dá)水平從而達(dá)到治療糖尿病大鼠皮膚潰瘍的作用。雷霆等[26]研究發(fā)現(xiàn)，三七/白芨膠海綿可以通過Wnt/β-catenin通路調(diào)控達(dá)到治療皮膚潰瘍的作用。此外，于澤洋等[13]研究也發(fā)現(xiàn)金雞毛草提取物可以通過Wnt/β-catenin信號(hào)通路促進(jìn)大鼠Ⅲ期壓瘡潰瘍的愈合。本研究發(fā)現(xiàn)，LBP治療后可以有效促進(jìn)PU大鼠創(chuàng)面的愈合，通過增加Wnt/β-catenin信號(hào)通路中的關(guān)鍵調(diào)控蛋白Wnt1和β-catenin的表達(dá)水平，同時(shí)降低GSK-3β的表達(dá)水平，表明LBP可能是通過調(diào)控Wnt/β-catenin信號(hào)通路達(dá)從而到治療PU大鼠創(chuàng)面的作用。