李揚(yáng)波 董衛(wèi)國(guó)

結(jié)直腸癌是最常見(jiàn)的胃腸道惡性腫瘤之一，根據(jù)世界衛(wèi)生組織2020年發(fā)表的數(shù)據(jù)，結(jié)直腸癌發(fā)生率在世界惡性腫瘤排行表中居第3位,而且全球死亡病例數(shù)超93萬(wàn)例，僅次于肺癌[1]。中國(guó)仍是結(jié)直腸癌高發(fā)國(guó)家，2015年新發(fā)病例數(shù)和死亡病例數(shù)分別為388000和187000例[2]。盡管現(xiàn)代診療技術(shù)在癌癥治療領(lǐng)域取得了巨大進(jìn)展，但是結(jié)直腸癌容易轉(zhuǎn)移，86%的終末期結(jié)直腸癌患者會(huì)在確診5年內(nèi)死亡[3]。目前，結(jié)直腸癌的主要治療方式是手術(shù)和聯(lián)合放化療，但是由于化療藥物如5-氟尿嘧啶耐藥性問(wèn)題日益嚴(yán)重，導(dǎo)致治療效果不盡人意。因此，有必要尋找新型低毒且高效的天然抗癌藥物，構(gòu)建新的化療方案，避免結(jié)直腸癌耐藥性問(wèn)題的進(jìn)一步惡化。

紫檀芪是最初從紫檀心材中分離出來(lái)的植物代謝產(chǎn)物，廣泛存在于藍(lán)莓、葡萄等漿果中。紫檀芪是白藜蘆醇的天然類似物，但是比白藜蘆醇具有更強(qiáng)的親脂性和更高的細(xì)胞攝取潛力[4]。紫檀芪具有廣泛的藥理作用，如抗炎、降低血糖血脂以及營(yíng)養(yǎng)神經(jīng)等作用。既往研究證實(shí)，紫檀芪可對(duì)乳腺癌、膀胱癌、胰腺癌等多種腫瘤發(fā)揮治療作用，但對(duì)結(jié)直腸癌的抗癌作用機(jī)制尚不明確[5～8]。本研究探討了紫檀芪在結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖和凋亡過(guò)程中的作用及其機(jī)制。

材料與方法

1.實(shí)驗(yàn)材料：人結(jié)直腸癌細(xì)胞株SW480、HCT116、DLD-1和人結(jié)腸上皮細(xì)胞NCM460購(gòu)自中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心；紫檀芪購(gòu)自美國(guó)Selleck公司；胎牛血清、RPMI-1640培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Gibco公司; 青霉素、鏈霉素、CCK-8試劑盒、Hoechst 33258染色試劑盒、ROS檢測(cè)試劑盒、線粒體膜電位檢測(cè)試劑盒、BCA蛋白定量試劑盒購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司; Annexin V-PE/7-AAD細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)BD公司; Apaf-1、AIF、Bax、Bcl-2、Cyt C、cleaved caspase-3、cleaved caspase-9、GAPDH、PCNA、survivin兔單克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling Technology公司。

2.細(xì)胞培養(yǎng)和分組：人結(jié)直腸癌細(xì)胞株(SW480、HCT116、DLD-1)和人結(jié)腸上皮細(xì)胞NCM460在質(zhì)量濃度為100g/L胎牛血清、1%抗生素溶液(青霉素 100U/ml和鏈霉素100g/ml)的RPMI-1640培養(yǎng)基， 37℃、體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2加濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。選用處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，分為梯度濃度紫檀芪處理組和陰性對(duì)照組，陰性對(duì)照組加入同濃度的DMSO。

3.細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)：用CCK-8試劑盒檢測(cè)細(xì)胞活力。將細(xì)胞(5×103個(gè)/孔)接種在96孔培養(yǎng)板中，第2天更換上清液，在含有紫檀芪(0、10、20、40、60、80、120、160μmol/L)的新鮮培養(yǎng)基中培養(yǎng)12、24、48h。每孔加入CCK-8溶液10μl，再孵育2h，用酶標(biāo)儀測(cè)定450nm處的吸光度(A)值。

4.Hoechst 33258熒光染色法： 利用Hoechst 33258染色試劑盒檢測(cè)細(xì)胞凋亡。將處于指數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞種植于6孔板，培養(yǎng)24h。用含有紫檀芪(0、20、40、80μmol/L)的新鮮培養(yǎng)基培養(yǎng)24h，然后固定細(xì)胞，用PBS沖洗3次，按照說(shuō)明書(shū)用Hoechst 33258染色液染色。在熒光顯微鏡下觀察和捕捉細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)特征。

5.Annexin V-PE/7-AAD雙染流式細(xì)胞術(shù)：利用Annexin V-PE/7-AAD細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒檢測(cè)細(xì)胞凋亡。將處于指數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞種植于6孔板，培養(yǎng)24h。用含有紫檀芪(0、20、40、80μmol/L)的新鮮培養(yǎng)基培養(yǎng)24h，收集每孔細(xì)胞，PBS沖洗兩遍，離心收集細(xì)胞沉淀，按照說(shuō)明書(shū)設(shè)置單染組和雙染組，單染組只加5μl Annexin V-PE或7-AAD，雙染組兩者均加，置于室溫避光孵育15min，隨后用流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

6.ROS測(cè)定實(shí)驗(yàn)：利用ROS檢測(cè)試劑盒測(cè)定細(xì)胞內(nèi)ROS水平。將細(xì)胞接種于6孔培養(yǎng)板，培養(yǎng)24h后用不同濃度的紫檀芪(0、20、40、80μmol/L)再培養(yǎng)24h。細(xì)胞在含10μmol/L DCFH-DA的1ml培養(yǎng)基中37℃培養(yǎng)20min，用PBS洗滌3次。然后用熒光顯微鏡觀測(cè)。

7.線粒體膜電位測(cè)定實(shí)驗(yàn)：利用帶有JC-1探針的線粒體膜電位檢測(cè)試劑盒測(cè)定細(xì)胞線粒體膜電位。將細(xì)胞接種于6孔培養(yǎng)板，培養(yǎng)24h后用不同濃度的紫檀芪(0、20、40、80μmol/L)再培養(yǎng)24h。次日去除上清液，并用JC-1染料處理細(xì)胞1h，最后使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)和分析細(xì)胞。

8.Western blot法檢測(cè)：經(jīng)上述紫檀芪處理后，提取細(xì)胞總蛋白，測(cè)定蛋白濃度。蛋白質(zhì)經(jīng)10% SDS-PAGE電泳分離后，轉(zhuǎn)膜，含濃度為5%的脫脂牛奶TBST中室溫封閉1h，TBST清洗4次，每次5min。隨后4℃下一抗孵育過(guò)夜，TBST清洗4次后，在室溫黑暗條件下二抗孵育1h，再用TBST洗滌4次，最后用Odyssey紅外熒光掃描成像系統(tǒng)掃描。

結(jié) 果

1.紫檀芪抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖：將3株結(jié)直腸癌細(xì)胞暴露于不同濃度的紫檀芪，CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，紫檀芪能抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖，且呈劑量和時(shí)間依賴性, 而在正常人結(jié)腸上皮細(xì)胞NCM460中，紫檀芪對(duì)其增殖的抑制作用較弱 (圖1)。此外，可觀察到SW480對(duì)紫檀芪最敏感，因此選SW480進(jìn)行以下的實(shí)驗(yàn)。

圖1 紫檀芪對(duì)細(xì)胞增殖的影響A.不同濃度的紫檀芪處理結(jié)直腸癌細(xì)胞(HCT116、SW480、DLD-1) 24h;B.不同濃度的紫檀芪對(duì)NCM460細(xì)胞的影響; C.不同濃度的紫檀芪處理 SW480 細(xì)胞 12、24和48h

2.紫檀芪促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞的凋亡：Hoechst 33258染色用于評(píng)估暴露于紫檀芪的結(jié)直腸癌細(xì)胞的細(xì)胞核，正常細(xì)胞核呈藍(lán)色熒光，而凋亡細(xì)胞核呈明亮的藍(lán)色熒光，伴有碎裂和染色質(zhì)濃縮。隨機(jī)選擇的視野顯示，經(jīng)紫檀芪處理后，結(jié)直腸癌細(xì)胞的細(xì)胞核凋亡水平增加，且呈劑量依賴性。流式細(xì)胞術(shù)的結(jié)果進(jìn)一步顯示，紫檀芪處理組與對(duì)照組比較，結(jié)直腸癌細(xì)胞凋亡率增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05, 圖2)。

圖2 紫檀芪對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞凋亡的影響A.Hoechst 33258染色觀察凋亡細(xì)胞(×100)； B.流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)凋亡率。與對(duì)照組比較，*P<0.05

3.紫檀芪通過(guò)線粒體途徑促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞凋亡：為了確定紫檀芪是否通過(guò)線粒體凋亡途徑促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞凋亡，評(píng)估了ROS水平和線粒體膜電位水平的變化。結(jié)果表明，與對(duì)照組比較，紫檀芪提高了結(jié)直腸癌細(xì)胞內(nèi)ROS水平，降低了線粒體膜電位水平，且呈劑量依賴性(P<0.05, 圖3)。Western blot法檢測(cè)用于評(píng)估線粒體凋亡途徑相關(guān)蛋白的水平。結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，紫檀芪處理結(jié)直腸癌細(xì)胞24h后，AIF、Apaf-1、Bax、Cyt C、cleaved caspase-3和cleaved caspase-9蛋白表達(dá)量增加，Bcl-2、PCNA、survivin表達(dá)量減少，且呈劑量依賴性，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05, 圖4)。

圖3 紫檀芪對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞內(nèi)ROS及線粒體膜電位的影響A.DCFH-DA 探針染色觀察胞內(nèi)ROS水平(×200)；B.流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)線粒體膜電位水平

圖4 紫檀芪對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞線粒體途徑的影響與0μmol/L比較，*P<0.05

討 論

抗癌藥物主要通過(guò)誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡發(fā)揮作用，而細(xì)胞凋亡途徑主要有兩種：外源性凋亡途徑和內(nèi)源性凋亡途徑[9]。內(nèi)源性細(xì)胞凋亡主要通過(guò)線粒體途徑來(lái)實(shí)現(xiàn)，是一種進(jìn)化上高度保守的細(xì)胞凋亡形式，對(duì)多細(xì)胞生物的發(fā)育和內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定中起著舉足輕重的作用[10]。線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔(mitochondrial permeability transition pore，MPTP)的開(kāi)放是維持線粒體動(dòng)態(tài)穩(wěn)定的核心環(huán)節(jié)，特殊刺激施加于線粒體可以使MPTP的開(kāi)閉狀態(tài)改變，實(shí)現(xiàn)線粒體通透性的變化，從而在線粒體途徑中發(fā)揮著關(guān)鍵作用[11]。ROS主要來(lái)源于線粒體，而線粒體又是ROS的靶標(biāo)之一， MPTP短期且可逆地開(kāi)放會(huì)釋放少量ROS，有利于細(xì)胞生長(zhǎng)；然而，持續(xù)且不可逆地打開(kāi)MPTP會(huì)導(dǎo)致ROS的爆炸性釋放，從而導(dǎo)致氧化應(yīng)激反應(yīng)損傷線粒體膜完整性甚至細(xì)胞[12]。ROS的積累會(huì)損傷線粒體膜，導(dǎo)致氧化應(yīng)激損傷線粒體膜， 隨后MPTP持續(xù)開(kāi)放，從而使得細(xì)胞內(nèi)具有促進(jìn)凋亡的蛋白Cyt C和AIF從線粒體釋放，在細(xì)胞質(zhì)中不斷累積[13,14]。緊接著，Cyt C與半胱氨酸蛋白酶家族因子Apaf-1相互作用，Bcl-2家族蛋白被釋放到細(xì)胞質(zhì)中，加速細(xì)胞凋亡過(guò)程[15]。

傳統(tǒng)化療藥物隨著耐藥性的增加，對(duì)癌癥的治療效果有限，且細(xì)胞毒性等不良反應(yīng)影響了患者的生活質(zhì)量[16]。目前，開(kāi)發(fā)新型低毒、高效的抗結(jié)直腸癌藥物，探索其作用機(jī)制成為研究熱點(diǎn)[17]。紫檀芪作為植物產(chǎn)生的天然代謝產(chǎn)物，在多種腫瘤中已證明具有高效的抗癌作用。既往研究發(fā)現(xiàn)，紫檀芪誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞氧化應(yīng)激，通過(guò)線粒體途徑抑制肝癌細(xì)胞增殖、促進(jìn)肝癌細(xì)胞凋亡[18]。然而，紫檀芪對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞的抑制作用機(jī)制暫不明確，本研究探討了紫檀芪對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞的抑制作用機(jī)制。

經(jīng)不同濃度的紫檀芪處理結(jié)直腸癌細(xì)胞后，結(jié)果顯示，紫檀芪顯著抑制了結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖，并且抑制作用呈劑量和時(shí)間依賴性。此外，DCFH-DA探針染色和流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果分別表明了紫檀芪可以提高結(jié)直腸癌細(xì)胞的ROS水平、降低線粒體膜電位水平。同時(shí)，Hoechst 33258染色和Annexin V-PE/7-AAD雙染流式結(jié)果表明紫檀芪能夠顯著促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞凋亡，提示紫檀芪可能激活氧化應(yīng)激、通過(guò)線粒體途徑誘導(dǎo)結(jié)直腸癌細(xì)胞凋亡。因此，筆者進(jìn)一步通過(guò)Western blot法測(cè)定線粒體凋亡途徑相關(guān)蛋白的表達(dá)水平。結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，紫檀芪處理組細(xì)胞的Apaf-1、AIF、Bax、Cyt C、cleaved caspase-3和cleaved caspase-9的水平顯著升高，Bcl-2、PCNA和survivin的水平顯著降低。綜上所述，紫檀芪可增加結(jié)直腸癌細(xì)胞內(nèi)ROS水平、降低線粒體膜電位水平，通過(guò)線粒體途徑促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞的凋亡，并且抑制細(xì)胞增殖、遷移和侵襲，提示紫檀芪具有治療結(jié)直腸癌的潛在應(yīng)用價(jià)值。