王 晨 林 栩

系統(tǒng)性紅斑狼瘡 (systemic lupus erythematosus，SLE)是一種復(fù)雜自身免疫性疾病，累及全身多器官系統(tǒng)，有多種免疫細(xì)胞如T淋巴細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞的參與，以多種抗體以及免疫復(fù)合物的形成、補(bǔ)體激活為特征。狼瘡性腎炎 (lupus nephritis, LN)是SLE患者的常見(jiàn)并發(fā)癥。臨床上以免疫抑制劑合并糖皮質(zhì)激素為主要治療手段，雖然病死率及腎臟存活率有所改善，還是有10%～30%的狼瘡性腎炎發(fā)展為腎衰竭，需要腎臟替代治療[1,2]。因而早期診斷及規(guī)范化治療對(duì)提高狼瘡病人生活質(zhì)量以及改善預(yù)后有及其重要的意義。隨著學(xué)術(shù)界對(duì)細(xì)胞程序性死亡的深入了解，目前已有研究表明，細(xì)胞焦亡這種新型細(xì)胞死亡方式與狼瘡性腎炎的疾病進(jìn)展密切相關(guān)。本文就細(xì)胞焦亡參與狼瘡性腎炎疾病發(fā)生、發(fā)展機(jī)制的研究進(jìn)展及未來(lái)應(yīng)用前景展開(kāi)討論。

一、細(xì)胞焦亡

焦亡屬于細(xì)胞程序性死亡(progammed cell death,PCD)的一種，是混合壞死和凋亡特征的一種非典型細(xì)胞死亡方式，在促進(jìn)人的生長(zhǎng)發(fā)育以及維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)方面具有重要意義[3]。在1992年，Zychlinsky等發(fā)現(xiàn)了福氏志賀菌感染的巨噬細(xì)胞發(fā)生了細(xì)胞死亡，該型細(xì)胞死亡有細(xì)胞凋亡的特征：染色質(zhì)固縮及DNA片段化，當(dāng)時(shí)認(rèn)定這種細(xì)胞死亡方式為細(xì)胞凋亡；無(wú)獨(dú)有偶，Hilbi前后在1997年及1998年，在觀察福氏志賀菌誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞凋亡的過(guò)程中發(fā)現(xiàn)了激活的含半胱氨酸的天冬氨酸水解酶1(cysteinyl aspartate specific proteinase 1，caspase-1)表達(dá)，且證明該種死亡方式不依賴(lài)于caspase-3，而是依賴(lài)于caspase-1[4，5]；1999年，Hersh等通過(guò)敲除巨噬細(xì)胞caspase-1阻斷巨噬細(xì)胞死亡，證明caspase-1可能是此種細(xì)胞死亡方式的關(guān)鍵蛋白[6]。此后Brennan在2000年通過(guò)沙門(mén)菌誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞死亡實(shí)驗(yàn)中也同樣發(fā)現(xiàn)了該死亡方式與caspase-1密切相關(guān)，明確提出該種細(xì)胞死亡方式不同于細(xì)胞凋亡，可以破壞細(xì)胞膜，不伴有凋亡相關(guān)caspase-3及PARP的活化，且有明顯的DNA片段化[7]。2001年Cookson和Brennan等正式以細(xì)胞焦亡來(lái)命名這種死亡方式[8]。至此關(guān)于細(xì)胞焦亡的研究開(kāi)始飛速發(fā)展。2015年Gasdermin D作為焦亡關(guān)鍵效應(yīng)蛋白被報(bào)道，焦亡的下游作用機(jī)制逐步完善[9]。隨著對(duì)細(xì)胞死亡方式的研究以及對(duì)相關(guān)機(jī)制的了解，2018年細(xì)胞死亡命名委員會(huì)(Nomenclature Committee on Cell Death,NCCD)定義細(xì)胞焦亡為依賴(lài)Gasdermin蛋白家族成員形成的質(zhì)膜孔隙的一種細(xì)胞死亡方式，與炎性caspase的激活與否沒(méi)有必然聯(lián)系，至此學(xué)術(shù)界對(duì)于細(xì)胞焦亡的定義日趨完善[10]。

細(xì)胞焦亡、細(xì)胞凋亡及細(xì)胞壞死三者同屬PCD，彼此之間在生化和形態(tài)學(xué)特征雖有相似也各有不同，簡(jiǎn)言之胞核固縮或斷裂，胞膜完整，有凋亡小體形成，為凋亡(apoptosis)細(xì)胞形態(tài)特征；胞核固縮或斷裂，胞質(zhì)腫脹，胞膜不完整，且有炎性小體的形成，為焦亡(pyroptosis)細(xì)胞形態(tài)特征；胞核腫脹或溶解，胞質(zhì)腫脹，胞膜不完整，且有壞死小體的形成，為壞死(necrosis)細(xì)胞形態(tài)特征。細(xì)胞凋亡是一種由基因調(diào)控由凋亡小體介導(dǎo)的非炎性細(xì)胞程序性死亡方式。細(xì)胞壞死和焦亡可引起強(qiáng)烈的細(xì)胞炎癥，質(zhì)膜的完整與否是區(qū)別細(xì)胞凋亡與細(xì)胞壞死和焦亡的標(biāo)志，細(xì)胞壞死中細(xì)胞膜通道成孔是由混合譜系激酶結(jié)構(gòu)域樣蛋白(mixed lineage kinase domain-like protein,MLKL)介導(dǎo)的，而細(xì)胞焦亡則依賴(lài)于Gasdermin蛋白家族的非選擇性打孔特性[11，12]。根據(jù)不同細(xì)胞死亡過(guò)程中細(xì)胞膜通透性的變化，可以通過(guò)Yo-PRO-1和Eth D-2雙染證實(shí)是否發(fā)生焦亡現(xiàn)象[13～16]。Yo-PRO-1是一種細(xì)胞膜封閉的陽(yáng)離子，在凋亡早期細(xì)胞膜通透性輕微增加，此時(shí)Yo-PRO-1可以進(jìn)入細(xì)胞與DNA結(jié)合形成綠色熒光，Eth D-2相對(duì)分子質(zhì)量則較大不能通過(guò)焦亡的細(xì)胞膜孔進(jìn)入，而在壞死細(xì)胞中可呈現(xiàn)陽(yáng)性，且有不能與其他染料共存的特性，詳見(jiàn)表1。

表1 細(xì)胞凋亡、焦亡及壞死的比較

二、細(xì)胞焦亡關(guān)鍵蛋白

焦亡主要發(fā)生機(jī)制為NOD樣受體(NLRs)或Toll樣受體(TLRs)通過(guò)識(shí)別胞內(nèi)或胞外的刺激因子，從而促進(jìn)炎性小體的組裝，炎性小體(inflammasome)由3個(gè)主要部分構(gòu)成，細(xì)胞質(zhì)傳感器NLR蛋白 (NOD-containing protein-like receptors)、銜接蛋白凋亡相關(guān)斑點(diǎn)蛋白ASC (apoptotic-associated speck-like protein containing CARD) 和炎性半胱天冬氨酸蛋白酶-1前體蛋白(pro-caspase-1)。ASC作為接頭蛋白負(fù)責(zé)NLR蛋白及pro-caspase-1的連接。又根據(jù)炎性小體的組成受體不同，分為NLRP1炎性小體、NLRP3炎性小體、AIM2炎性小體、IPAF炎性小體。其中NLRP1炎性小體及IPAF炎性小體可以不依賴(lài)于接頭蛋白ASC可以直接與pro-caspase-1連接[17]。炎性小體在細(xì)胞焦亡中起承上啟下的關(guān)鍵作用，炎性小體是一類(lèi)可以在胞內(nèi)識(shí)別病原體相關(guān)分子模式(PAMPs)和損傷相關(guān)分子模式(DAMPs)信號(hào)的受體。通過(guò)識(shí)別上游刺激，募集并活化caspase-1，活性caspase-1切割下游關(guān)鍵蛋白GSDMD，形成有細(xì)胞毒性的GSDMD-N端，激活下游炎性細(xì)胞因子IL-1β、IL-18。最終導(dǎo)致細(xì)胞焦亡?；罨腸aspase切割 GSDMD-N端及GSDMD-C端之間的柔性連接蛋白從而解除C端的自身抑制效應(yīng)，以此激活Gasdermin。Gasdermin蛋白作為一種打孔蛋白可以在細(xì)胞膜上形成功能性孔隙，導(dǎo)致細(xì)胞腫脹破裂，胞內(nèi)炎性物質(zhì)釋放激活并放大炎性反應(yīng)。以下就caspase家族及Gasdermin家族在細(xì)胞焦亡這一過(guò)程中的作用機(jī)制作簡(jiǎn)略闡述。

caspase家族首先是作為細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵蛋白而被人們熟知，隨著研究的不斷深入，caspase家族的其他功能也被漸漸發(fā)掘。目前已知caspase家族有16個(gè)成員，序列及結(jié)構(gòu)高度相似，主要以N端前域結(jié)構(gòu)的不同而鑒別，通常以無(wú)活性的酶原形式存在。這其中以caspase-1研究歷史最為久遠(yuǎn)，參與多種疾病的發(fā)生、發(fā)展。caspase-1最早是作為白細(xì)胞介素(IL)-1β轉(zhuǎn)換酶(ICE)被發(fā)現(xiàn)，且與1993年發(fā)現(xiàn)的線蟲(chóng)凋亡相關(guān)的蛋白CED-3具有同源性。

目前認(rèn)為細(xì)胞焦亡主要是由caspase-1/4/5/11介導(dǎo)的一種細(xì)胞程序性死亡。根據(jù)caspase的不同區(qū)分焦亡的經(jīng)典與非經(jīng)典途徑。依賴(lài)于caspase-1的細(xì)胞死亡方式稱(chēng)為經(jīng)典焦亡途徑，在內(nèi)源性或者外源性危險(xiǎn)信號(hào)刺激下，炎性小體組裝活化，炎性小體活化后將pro-caspase-1 激活為活化的 caspase-1，并介導(dǎo)促進(jìn)白細(xì)胞介素 -1β 和 IL-18 等炎性細(xì)胞物質(zhì)的成熟及釋放，從而招募更多的炎性細(xì)胞一步放大炎性反應(yīng)。依賴(lài)人源caspase-4/5和鼠源的caspase-11的細(xì)胞死亡方式稱(chēng)為非經(jīng)典焦亡途徑，脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)不依賴(lài)與TLR4 可以直接通過(guò)與CARD域(caspase募集結(jié)構(gòu)域)結(jié)合激活caspase-4/5/11[9,18,19]?；罨蟮?caspase-4/5/11同樣可以通過(guò)切割下游GSDMD，使后者C端結(jié)構(gòu)域與N端結(jié)構(gòu)域分離，暴露N端結(jié)構(gòu)域，解除GSDMD的自身抑制作用。2015年有研究者發(fā)現(xiàn)縫隙連接蛋白1(pannexin-1,Panx-1)及膜通道嘌呤能受體蛋白P2X7(purinergic receptor P2X ligand-gated ion channel 7)在非經(jīng)典途徑中發(fā)揮不可或缺的作用[20]。也有研究發(fā)現(xiàn)caspase-3可以通過(guò)切割GSDME并引發(fā)焦亡。

Gasdermins家族是一類(lèi)在細(xì)胞焦亡的下游通路發(fā)揮活性的具有打孔功能的蛋白家族。包括括Gasdermin-A(GSDMA)、Gasdermin-B(GSDMB)、Gasdermin-C(GSDMC)、Gasdermin-D(GSDMD)、Gasdermin-E(GSDME/DFNA5)和 Pejvakin(PJVK/DFNB59)。其中GSDMD及GSDME在細(xì)胞焦亡中發(fā)揮主要作用，GSDMD的N端具有細(xì)胞毒性，C端與N端在靜息狀態(tài)下結(jié)合抑制不發(fā)揮毒性作用。當(dāng)caspase活化后，可激活GSDMD解除自身抑制。該N端結(jié)構(gòu)域具有在膜上打孔的作用，可導(dǎo)致細(xì)胞膜孔洞形成，細(xì)胞不斷膨脹直至破裂，細(xì)胞內(nèi)容物 IL-1β和IL-18等釋放，從而激活并放大炎性反應(yīng)，引發(fā)細(xì)胞焦亡[21]。

三、細(xì)胞焦亡在LN的炎性進(jìn)展中發(fā)揮重要作用

無(wú)菌性炎性反應(yīng)是許多臨床腎臟疾病的特征，SLE及LN中炎癥機(jī)制的失調(diào)，可以促進(jìn)LN的器官損害，已有研究表明細(xì)胞焦亡在SLE和LN疾病發(fā)展過(guò)程中起重要作用，細(xì)胞焦亡可能成為系統(tǒng)性紅斑狼瘡的一種重要發(fā)病機(jī)制[22]。研究證實(shí)，NLRP3炎癥體的激活以及其介導(dǎo)下游caspase -1依賴(lài)的細(xì)胞因子IL-1β和IL-18的釋放，導(dǎo)致Gasdermin D介導(dǎo)的致死性細(xì)胞焦亡[23]。在LN患者和狼瘡易感小鼠的足細(xì)胞中NLRP3炎性小體及caspase-1的活性片段p20被激活，且抑制NLRP3的激活可以減少狼瘡性腎炎IL-1β、caspase-1的表達(dá)、足細(xì)胞損傷和蛋白尿的產(chǎn)生[24]。

2011年Kahlenberg等在狼瘡性腎炎活檢組織中檢測(cè)到NLRP3、caspase-1和血清IL-18表達(dá)的增加[25]。提示這一組織為炎性小體的激活及細(xì)胞焦亡的發(fā)生做準(zhǔn)備。2013年該課題組又發(fā)現(xiàn)SLE患者中發(fā)現(xiàn)中性粒細(xì)胞胞外殺傷網(wǎng)格(neutrophil extracellular traps, NETs)增多，可激活巨噬細(xì)胞中的NLRP3小體，促進(jìn)caspase-1的活化及IL-1β和IL-18的釋放，誘導(dǎo)細(xì)胞焦亡的產(chǎn)生，IL-18能夠再次誘發(fā)NETs，循環(huán)加重SLE的發(fā)展及器官損害[26]。2014年Kahlenberg等[27]通過(guò)進(jìn)一步構(gòu)建狼瘡小鼠模型，發(fā)現(xiàn)缺乏炎性小體中樞caspase-1 的小鼠不表現(xiàn)出SLE和LN的癥狀。在LN中，Pim-1可以激活NLRP3炎性小體導(dǎo)致焦亡通路的進(jìn)一步活化，而在沉默Pim-1基因的足細(xì)胞中NLRP3、caspase-1、p20及IL-1β的活性則明顯降低，這同樣提示了細(xì)胞焦亡通路激活在SLE及LN發(fā)病機(jī)制中的重要作用[28]。也有研究者提出在LN中不僅有焦亡通路活性的增強(qiáng)，焦亡細(xì)胞的清除障礙可能會(huì)導(dǎo)致狼瘡患者長(zhǎng)期暴露自身抗原從而破壞免疫耐受進(jìn)一步推動(dòng)SLE的發(fā)病[29，30]。但這一觀點(diǎn)還需要更多臨床研究數(shù)據(jù)證實(shí)。

四、展 望

細(xì)胞焦亡發(fā)現(xiàn)以來(lái)，研究者通過(guò)對(duì)細(xì)胞焦亡的定義、打破、再定義、再打破。隨著對(duì)細(xì)胞焦亡的了解不斷深入，作用機(jī)制也逐漸明朗。大量研究表明細(xì)胞焦亡在許多腫瘤免疫及心血管疾病發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮了重要作用。學(xué)術(shù)界關(guān)于狼瘡與焦亡的研究空間很大，其中抑制細(xì)胞焦亡的過(guò)度激活并加速焦亡細(xì)胞的清除有可能是一種有力的狼瘡治療措施。未來(lái)的研究可以針對(duì)caspase的激活機(jī)制及與 GSDMD的直接作用關(guān)系，實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)用藥，使導(dǎo)入體內(nèi)的細(xì)胞焦亡關(guān)鍵蛋白caspase-1及GSDMD等抑制劑直接作用于狼瘡關(guān)鍵靶點(diǎn)。