施付艷，蘇小紅，王 欣，孟利強(qiáng)，劉 澤，王 雪，陸 佳，劉 偉*

(1.黑龍江省能源環(huán)境研究院，哈爾濱 150000；2.黑龍江省科學(xué)院微生物研究所，哈爾濱 150000)

我國(guó)是農(nóng)業(yè)大國(guó)，秸稈資源豐富，年均產(chǎn)量約為8.65億t[1-3]。在我國(guó)廣大農(nóng)村地區(qū)農(nóng)戶(hù)大規(guī)模露天焚燒廢棄農(nóng)作物秸稈已成為顯著的社會(huì)問(wèn)題[4]，秸稈焚燒不僅對(duì)土壤造成影響，還易引發(fā)火災(zāi)，導(dǎo)致人身財(cái)產(chǎn)損失，影響群眾生活和空氣質(zhì)量[5-7]，秸稈中含有較高的有機(jī)質(zhì)，其資源化利用一直是我國(guó)研究和討論的熱點(diǎn)。

農(nóng)業(yè)秸稈的主要成分是木質(zhì)素、纖維素及半纖維素[8]，三者通過(guò)化學(xué)鍵緊密纏繞包裹形成難以降解的木質(zhì)纖維素結(jié)構(gòu)，是秸稈資源化利用的天然屏障。木質(zhì)素主要存在于植物細(xì)胞壁中，給植物提供結(jié)構(gòu)支撐，因其具有抗?jié)B，抗微生物，抗氧化，非水溶性和無(wú)光學(xué)活性等特性，使得很難降解[9-10]。纖維素和半纖維素包裹于木質(zhì)素中，且纖維素、半纖維素和木質(zhì)素分子之間存在著不同的結(jié)合力，極大地阻礙了玉米秸稈的厭氧發(fā)酵性能，降低了秸稈的利用率[11-12]。蘇小紅[13-15]等的研究中表明預(yù)處理過(guò)程可將秸稈中的纖維素-半纖維素-木質(zhì)素結(jié)構(gòu)破壞，使得纖維素與半纖維素更多地暴露出來(lái)，為后續(xù)厭氧發(fā)酵產(chǎn)能過(guò)程提供了條件，可有效提高厭氧發(fā)酵產(chǎn)能效益。

生物預(yù)處理是既環(huán)保又有效的預(yù)處理方法之一，其中木霉預(yù)處理是利用木霉菌分泌的纖維素酶對(duì)秸稈中的木質(zhì)纖維素進(jìn)行降解，將秸稈中復(fù)雜的多聚糖分解為便于利用的單糖[16]。經(jīng)過(guò)預(yù)處理后的秸稈在厭氧發(fā)酵過(guò)程中通過(guò)水解酸化、產(chǎn)氫產(chǎn)乙酸及產(chǎn)甲烷3個(gè)步驟實(shí)現(xiàn)生物質(zhì)能源的轉(zhuǎn)化，生產(chǎn)出清潔能源甲烷[17]。此外，俞游[18]等的研究表明外源加入氫氣可以促進(jìn)厭氧發(fā)酵中食氫產(chǎn)甲烷途徑，從而提升厭氧發(fā)酵甲烷產(chǎn)量。

本實(shí)驗(yàn)以還原糖為指標(biāo)探索了木霉預(yù)處理玉米秸稈的最佳初始料液比、處理時(shí)間和處理溫度，通過(guò)正交實(shí)驗(yàn)得到最佳預(yù)處理?xiàng)l件組合，在此基礎(chǔ)上進(jìn)行厭氧發(fā)酵產(chǎn)甲烷實(shí)驗(yàn)及加氫厭氧發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，分析木霉預(yù)處理和外源加氫對(duì)玉米秸稈厭氧發(fā)酵產(chǎn)甲烷的影響，為秸稈厭氧發(fā)酵產(chǎn)甲烷預(yù)處理技術(shù)的研究提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

采用自然條件下風(fēng)干的玉米秸稈作為實(shí)驗(yàn)材料。取自黑龍江省哈爾濱市松北區(qū)松花江村的玉米農(nóng)田，粉碎成2～3 cm的小段，并取適量置于250 mL錐形瓶中，用6層紗布封口，于121℃高壓蒸汽滅菌30 min。

玉米秸稈理化性質(zhì)如表1。

表1 玉米秸稈理化性質(zhì) (%)

厭氧發(fā)酵接種物選擇黑龍江省能源環(huán)境研究院正在運(yùn)行的厭氧發(fā)酵中試平臺(tái)的沼液。

綠色木霉(Trichodermaviride)來(lái)自本實(shí)驗(yàn)室馴化培養(yǎng)，由黑龍江省科學(xué)院微生物研究所提供源菌株。

1.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.2.1 木霉預(yù)處理秸稈實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)改變綠色木霉預(yù)處理玉米秸稈的初始料液比、預(yù)處理溫度及預(yù)處理時(shí)間，進(jìn)行單因素及正交實(shí)驗(yàn)，優(yōu)化綠色木霉預(yù)處理玉米秸稈條件，具體方案如下。

1.2.1.1 單因素實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

木霉預(yù)處理玉米秸稈單因素實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)見(jiàn)表2。

表2 木霉預(yù)處理玉米秸稈單因素實(shí)驗(yàn)因素水平選取表

1.2.1.2 正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

木霉預(yù)處理玉米秸稈正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)見(jiàn)表3。

表3 木霉預(yù)處理玉米秸稈正交實(shí)驗(yàn)因素水平選取表

1.2.2 發(fā)酵實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

將預(yù)處理后的玉米秸稈進(jìn)行厭氧發(fā)酵產(chǎn)甲烷潛力分析，未經(jīng)過(guò)預(yù)處理的玉米秸稈作為對(duì)照組，同時(shí)設(shè)置一組預(yù)處理秸稈進(jìn)行外源加氫厭氧發(fā)酵產(chǎn)甲烷實(shí)驗(yàn)，每個(gè)樣品做3個(gè)平行。厭氧發(fā)酵裝置采用全自動(dòng)產(chǎn)甲烷分析測(cè)試系統(tǒng)(AMPTSII°碧普儀器有限公司)，發(fā)酵溫度為55℃，發(fā)酵總固體含量(TS)為8%，發(fā)酵15 d。加氫組每日通氣2次，每次通氣45 mL，通氣時(shí)間為2 min。

1.3 實(shí)驗(yàn)裝置

1.3.1 預(yù)處理實(shí)驗(yàn)裝置

預(yù)處理實(shí)驗(yàn)裝置見(jiàn)圖1。

圖1 預(yù)處理實(shí)驗(yàn)裝置

1.3.2 厭氧發(fā)酵實(shí)驗(yàn)裝置

本實(shí)驗(yàn)使用AMPTSII°產(chǎn)甲烷潛力分析測(cè)試系統(tǒng)(型號(hào)01-0000-02，瑞典)作為厭氧發(fā)酵實(shí)驗(yàn)裝置，具體如圖2所示，由恒溫水浴發(fā)酵裝置、CO2脫除裝置及甲烷產(chǎn)量計(jì)量裝置組成。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 菌懸液制備

PDA培養(yǎng)基配制：土豆洗凈削皮取200 g，加入1000 mL蒸餾水煮沸30 min，以?xún)蓪蛹啿歼^(guò)濾得濾液，加入20 g葡萄糖。固體培養(yǎng)基加入15～20 g瓊脂粉。

菌液制備：取實(shí)驗(yàn)室封存的綠色木霉菌液200 μL接種于PDA液體培養(yǎng)基中于28℃搖床培養(yǎng)48 h，再次取200 μL活化菌液接種于PDA固體培養(yǎng)基中，于28℃恒溫培養(yǎng)48 h，挑取單菌落接種于事先準(zhǔn)備的PDA液體培養(yǎng)基中，于28℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)72 h(調(diào)整菌液濃度為7.5×107個(gè)·mL-1)，用于玉米秸稈預(yù)處理。

1.4.2 基質(zhì)液制備

取2 g預(yù)處理后玉米秸稈，加入蒸餾水20 mL，于28℃，140rpm振蕩浸提1 h，用5 mL注射器抽取混合液，經(jīng)0.45 μm濾膜進(jìn)行過(guò)濾得基質(zhì)液，用于還原糖測(cè)定。

1.4.3 指標(biāo)測(cè)定

纖維素、木質(zhì)素及半纖維素測(cè)定：范氏Van Soest纖維素測(cè)定法[19](ANKOM220型半自動(dòng)纖維素分析儀)；還原糖含量測(cè)定：DNS(3，5-二硝基水楊酸)比色法[20]；干物質(zhì)含量(TS含量)測(cè)定：烘干法(電熱恒溫鼓風(fēng)干燥機(jī)，102℃±3℃，4 h)；揮發(fā)性固體含量(VS含量)測(cè)定：烘干法(馬弗爐，600℃，2 h)；氣體成分產(chǎn)氣量：島津氣相色譜儀。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

2.1 初始料液比對(duì)木霉預(yù)處理玉米秸稈還原糖含量的影響

初始料液比決定玉米秸稈基質(zhì)中水分的含量，張玉輝[21]等的研究表明基質(zhì)中水分含量過(guò)高，會(huì)導(dǎo)致基質(zhì)透氣性下降，氧氣供給不足，使菌體生長(zhǎng)不良，產(chǎn)酶能力下降，還原糖得率下降；水分含量過(guò)低，木霉菌產(chǎn)生的纖維素酶不能進(jìn)行有效傳質(zhì)作用于基質(zhì)表面。從圖3可知，還原糖含量隨著初始料液比的升高呈下降趨勢(shì)，當(dāng)初始料液比為1∶6時(shí)，木霉預(yù)處理所產(chǎn)還原糖含量最低為0.44 mg·g-1，此時(shí)基質(zhì)中水分含量過(guò)高，抑制了木霉菌在基質(zhì)中的生長(zhǎng)繁殖，不能產(chǎn)生纖維素酶對(duì)玉米秸稈進(jìn)行降解。當(dāng)料液比為1∶2時(shí)，還原糖含量最高為10.34 mg·g-1，表明在該料液比條件下木霉菌生長(zhǎng)活性旺盛，產(chǎn)生的纖維素酶可對(duì)玉米基質(zhì)進(jìn)行有效降解，轉(zhuǎn)化還原糖的能力提高。

圖3 初始料液比對(duì)預(yù)處理后秸稈還原糖含量的影響

2.2 溫度對(duì)木霉預(yù)處理玉米秸稈還原糖含量的影響

纖維素酶活性和木霉生長(zhǎng)活性與預(yù)處理溫度關(guān)系密切。越靠近最適酶活溫度，纖維素酶的吸附和纖維素糖化效果越好[22]；越靠近最適生長(zhǎng)溫度條件，木霉生長(zhǎng)繁殖對(duì)還原糖消耗越大。圖4表明，木霉預(yù)處理玉米秸稈還原糖含量隨溫度增加而呈上升的趨勢(shì)，當(dāng)預(yù)處理溫度為38℃時(shí)，還原糖含量最高為17.78 mg·g-1。在該溫度條件下，纖維素酶活性增大，對(duì)玉米秸稈基質(zhì)降解效果增強(qiáng)，因此還原糖含量明顯增加。當(dāng)預(yù)處理溫度為23℃時(shí)，木霉預(yù)處理玉米秸稈還原糖含量出現(xiàn)最低值0.91 mg·g-1，其原因可能是該預(yù)處理溫度適宜木霉生長(zhǎng)而不適宜纖維素酶的產(chǎn)生，木霉菌的生長(zhǎng)繁殖對(duì)原基質(zhì)中的還原糖和酶降解產(chǎn)生的少量還原糖進(jìn)行消耗，導(dǎo)致還原糖含量降低。趙爽[23]關(guān)于兩種不同來(lái)源綠色木霉固態(tài)發(fā)酵及甘草藥渣對(duì)玉米生長(zhǎng)效應(yīng)的研究同樣表明纖維素酶最佳反應(yīng)溫度高于木霉最適生長(zhǎng)溫度。

圖4 溫度對(duì)預(yù)處理后秸稈還原糖含量的影響

2.3 預(yù)處理時(shí)間對(duì)木霉預(yù)處理玉米秸稈還原糖含量的影響

木霉預(yù)處理玉米秸稈時(shí)間越長(zhǎng)，微生物對(duì)還原糖的消耗越多。從圖5可看出，當(dāng)預(yù)處理時(shí)間為2 d時(shí)，還原糖含量最高為6.27 mg·g-1，當(dāng)預(yù)處理時(shí)間為10 d時(shí)，還原糖含量最低為0.95 mg·g-1。該結(jié)果與趙爽[24]等人的研究結(jié)果相同，其原因是預(yù)處理時(shí)間越長(zhǎng)，木霉菌繁殖數(shù)量增多，對(duì)基質(zhì)中原有的還原糖及纖維素酶降解產(chǎn)生的還原糖消耗越大，因而累計(jì)還原糖含量減少。

圖5 時(shí)間對(duì)預(yù)處理后秸稈還原糖含量的影響

2.4 木霉預(yù)處理?xiàng)l件優(yōu)化

根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果設(shè)計(jì)三因素三水平正交試驗(yàn)，采用L9(33)正交表考察各因素之間的相互作用，得到9個(gè)正交試驗(yàn)組，結(jié)果見(jiàn)表4。

從表4可以看出，最佳木霉預(yù)處理?xiàng)l件為溫度36℃，處理時(shí)間為2 d，初始料液比為1∶1。3個(gè)因素對(duì)木霉預(yù)處理影響順序?yàn)镽A、RC、RB，即溫度>初始料液比>處理時(shí)間。對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行方差檢驗(yàn)數(shù)據(jù)結(jié)果如表5，可看出溫度對(duì)實(shí)驗(yàn)影響顯著(p<0.05)。以溫度36℃、處理時(shí)間2 d、初始料液比1∶1進(jìn)行驗(yàn)證性試驗(yàn)，還原糖含量為27.66 mg·g-1，高于正交表中所有試驗(yàn)。

表4 木霉預(yù)處理玉米秸稈正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

表5 正交試驗(yàn)方差分析表

2.5 木霉預(yù)處理對(duì)厭氧發(fā)酵產(chǎn)甲烷的影響

對(duì)木霉預(yù)處理的玉米秸稈進(jìn)行厭氧發(fā)酵產(chǎn)甲烷實(shí)驗(yàn)及外源加氫產(chǎn)甲烷實(shí)驗(yàn)，分析木霉預(yù)處理玉米秸稈的產(chǎn)甲烷性能。從圖6可知，木霉預(yù)處理玉米秸稈產(chǎn)甲烷效果顯著，與未經(jīng)預(yù)處理的實(shí)驗(yàn)組相比，木霉預(yù)處理組產(chǎn)甲烷高峰出現(xiàn)在第4天，產(chǎn)甲烷高峰稍有滯后。自第4天起，木霉預(yù)處理組日產(chǎn)甲烷量均高于未預(yù)處理實(shí)驗(yàn)組，其原因可能是在厭氧發(fā)酵過(guò)程中，預(yù)處理組揮發(fā)性脂肪酸的產(chǎn)生速度大于其消耗速度，導(dǎo)致?lián)]發(fā)性脂肪酸累積，從而影響了原料的產(chǎn)甲烷效果，之后隨著揮發(fā)性脂肪酸的消耗，解除了其所產(chǎn)生的抑制，復(fù)雜有機(jī)物逐漸被厭氧菌群消化，產(chǎn)甲烷能力恢復(fù)，產(chǎn)甲烷量升高[25]。比較木霉加氫組可看出，外源氫氣對(duì)預(yù)處理后玉米秸稈厭氧發(fā)酵產(chǎn)甲烷效果提升顯著，日產(chǎn)甲烷量均高于木霉預(yù)處理未加氫組和未預(yù)處理組。其原因是外源氫氣的加入促進(jìn)了嗜氫產(chǎn)甲烷菌對(duì)氫氣和二氧化碳的轉(zhuǎn)化，從而實(shí)現(xiàn)了甲烷產(chǎn)量的提升。喬瑋[26]等人的研究表明氫氣通入對(duì)嗜氫厭氧途徑有促進(jìn)作用。木霉預(yù)處理組最大日產(chǎn)甲烷量為22.20 mL·g-1d-1，較未預(yù)處理組提高了56.8%。木霉加氫組最大日產(chǎn)甲烷量為34.57mL·g-1d-1，較未加氫組提高了55.7%。表明木霉預(yù)處理可有效提高玉米秸稈降解能力，提升產(chǎn)甲烷潛力，外源加氫對(duì)厭氧發(fā)酵產(chǎn)甲烷有顯著促進(jìn)作用。

圖6 木霉預(yù)處理對(duì)日產(chǎn)甲烷量的影響

由圖7可知，木霉預(yù)處理組、木霉加氫組與未預(yù)處理組累積產(chǎn)氣量的變化趨勢(shì)一致，都是先快速增長(zhǎng)后趨于平穩(wěn)。在第4天之前，未預(yù)處理組累積產(chǎn)氣量高于木霉預(yù)處理組，而第4天之后，木霉預(yù)處理組累積產(chǎn)氣量超過(guò)干秸稈組。木霉預(yù)處理組累積產(chǎn)氣量為65.96 mL·g-1TS，未預(yù)處理組累積產(chǎn)氣量為47.46 mL·g-1TS，產(chǎn)氣量提高39.0%。黃文博[27]等利用白腐菌對(duì)玉米秸稈進(jìn)行前期預(yù)處理以提高沼氣產(chǎn)氣量研究中，經(jīng)過(guò)白腐菌處理后的玉米秸稈在厭氧發(fā)酵試驗(yàn)中的累積產(chǎn)氣量較未經(jīng)處理的空白對(duì)照組提高了12.32%；趙肖玲[28]等利用黑曲霉與木霉復(fù)合菌劑處理秸稈提高產(chǎn)甲烷性能研究中發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過(guò)微生物處理后的玉米秸稈在厭氧發(fā)酵中的累積產(chǎn)氣量較未經(jīng)微生物處理的對(duì)照組提高了10.06%。李靖[29]等復(fù)合微生物菌劑對(duì)玉米秸稈的預(yù)處理與厭氧產(chǎn)氣性能的研究中，經(jīng)過(guò)復(fù)合微生物菌劑CM-2預(yù)處理后的玉米秸稈在厭氧發(fā)酵中的累積產(chǎn)氣量與未經(jīng)預(yù)處理的對(duì)照組相比提高了30.18%。由此可見(jiàn)，木霉預(yù)處理可有效提升玉米秸稈的累積產(chǎn)甲烷量。比較圖7中甲烷累計(jì)產(chǎn)氣量變化趨勢(shì)，木霉加氫組均高于木霉預(yù)處理未加氫組和未預(yù)處理組，木霉加氫組甲烷累積產(chǎn)氣量為173.77 mL·g-1TS，為木霉預(yù)處理組的2.6倍，表明外源加入氫氣可有效提升厭氧發(fā)酵甲烷產(chǎn)量。

圖7 木霉預(yù)處理對(duì)甲烷累積產(chǎn)氣量的影響

3 結(jié)論

本文研究了綠色木霉預(yù)處理及外源氫氣對(duì)玉米秸稈厭氧發(fā)酵產(chǎn)甲烷性能的影響，通過(guò)分析還原糖產(chǎn)量和產(chǎn)甲烷量，優(yōu)化了預(yù)處理?xiàng)l件，得到綠色木霉最佳預(yù)處理?xiàng)l件為：預(yù)處理溫度36℃，初始料液比1∶1，預(yù)處理時(shí)間2 d，在此預(yù)處理?xiàng)l件下，還原糖產(chǎn)量為27.66 mg·g-1，綠色木霉預(yù)處理組最大日產(chǎn)甲烷量為22.20 mL·g-1d-1，較未預(yù)處理組提高了56.8%，累積產(chǎn)甲烷量為65.96 mL·g-1TS，較未預(yù)處組提高了39.0%，綠色木霉加氫組最大日產(chǎn)甲烷量為34.57mL·g-1d-1，較綠色木霉預(yù)處理組提高了55.72%，累積產(chǎn)甲烷量為173.77 mL·g-1TS，為綠色木霉預(yù)處組的2.6倍。上述結(jié)果表明，綠色木霉預(yù)處理可有效提升秸稈厭氧發(fā)酵產(chǎn)甲烷潛力，外源氫氣對(duì)厭氧發(fā)酵產(chǎn)甲烷有顯著促進(jìn)作用，可為秸稈類(lèi)生物質(zhì)厭氧發(fā)酵產(chǎn)甲烷提供理論支持。