于秋瑩 郭苗苗 許岢昕 劉建斌 王聰 鄭健 張克中 張炎

(北京農(nóng)學(xué)院，北京，102206)

The inflorescences and inflorescence axial of Syringa vulgaris as explants were used to study the effects of explant types, basic culture medium types, plant hormone types and concentration to the callus induction rate of S. vulgaris, and design orthogonal experiment was used to explore the effects of erlenmeyerflask volume, initial culture medium volume, retention of old medium, inoculum quality and the content of antioxidants to the callus proliferaton result of suspension culture. The optimal callus induction of inflorescence axis medium was modified as Blaydes+TDZ 0.10 mg/L+2,4-D 1 mg/L, the optimal inflorescence induction medium was MS+TDZ 0.10 mg/L+2,4-D 1 mg/L, the induction rate was up to 100%. The concentration of 2,4-D had significant effect the callus rate of inflorescence and inflorescence axis (p<0.05). The combination of TDZ and 2,4-D significantly affected the inflorescence axial callus rate (p<0.05). The optimal combination of suspension culture was using the volume of 250 mL erlenmeyer flask, and supplemented with 150 mL of initial culture mediumaccompanied by 4.5 g of calli, andafter 15 d, retained of 1/4 old medium for next stage, initial inoculumed 7 g, PVP concentration 100 mg/L, Vc concentration 75 mg/L. This is the first time to report callus induction and start cell suspension culture of inflorescence and inflorescence axis of S. vulgariswith successful results, which would be used for factory breeding and genetic transformation in the future.

歐洲丁香(Syringavulgaris)是木樨科(Oleaceae)丁香屬(Syringaspp.)知名的觀花灌木或小喬木[1]，具有觀賞、經(jīng)濟(jì)[2]、生態(tài)[3]等多種價(jià)值，是目前應(yīng)用最為廣泛的丁香屬樹種。隨著歐洲丁香需求量不斷增大，如何提高其繁殖效率受到廣泛關(guān)注。目前對于繁殖木本優(yōu)良品種，只能采用無性繁殖的方法，其中，組織培養(yǎng)技術(shù)較其他傳統(tǒng)的無性繁殖技術(shù)具有繁殖系數(shù)大、繁殖速度快、不受季節(jié)影響等優(yōu)點(diǎn)[1]，并且被逐漸應(yīng)用于丁香。國內(nèi)外已經(jīng)對紫丁香(SyringaoblataLindl.)[4]、暴馬丁香(Syringareticulatavaramurensis)[5]、歐洲丁香[6]等多種丁香的組培方法進(jìn)行研究，主要開展了離體胚培養(yǎng)[7]、腋芽增殖培養(yǎng)[6]、愈傷組織誘導(dǎo)[8]、體細(xì)胞胚胎發(fā)生[9]等研究。愈傷組織的誘導(dǎo)是離體再生的關(guān)鍵一環(huán)，影響愈傷組織誘導(dǎo)的因素有外植體類型[10]、培養(yǎng)基種類[11]、激素種類及濃度[12]等，其中外植體類型的影響很大，目前在丁香屬植物愈傷組織誘導(dǎo)中，多使用葉片、莖段、上胚軸等營養(yǎng)器官作為外植體[12-14]，尚未見采用花序及花序軸等生殖器官進(jìn)行誘導(dǎo)的報(bào)道。有研究表明，花序及花序軸作為生殖器官較營養(yǎng)器官更容易產(chǎn)生體細(xì)胞愈傷組織和體細(xì)胞胚胎[15-16]。愈傷組織具有多種用途，可以作為建立離體再生、遺傳轉(zhuǎn)化體系和提取次生代謝產(chǎn)物的材料[17-19]。與傳統(tǒng)的固體培養(yǎng)基培養(yǎng)相比，液體懸浮震蕩培養(yǎng)是一種高效的愈傷組織增殖培養(yǎng)方法[20]。由于愈傷組織在液體中與營養(yǎng)物質(zhì)的接觸面更大，且震蕩使其分離成單細(xì)胞，更易分離和生長，從而提高愈傷組織增殖速率[21]。并且，由于愈傷組織可以直接用于細(xì)胞培養(yǎng)與雜交、基因轉(zhuǎn)移、生產(chǎn)次生代謝產(chǎn)物、突變體篩選等，懸浮細(xì)胞培養(yǎng)已成為重要的植物生物技術(shù)手段[22-23]。但是木本植物懸浮培養(yǎng)體系的建立尚有難度，目前已建立完善的懸浮細(xì)胞培養(yǎng)體系的木本植物主要有刺槐(Robiniapseudoacacia)、紅豆杉(Taxuschinensis)、北美楓香(Liquidambarstyraciflua)等，關(guān)于歐洲丁香懸浮培養(yǎng)的研究未見報(bào)道[24-26]。因此建立高效的歐洲丁香愈傷組織誘導(dǎo)和懸浮培養(yǎng)體系，可為后續(xù)開展工廠化育苗和遺傳轉(zhuǎn)化提供參考。

1 材料和方法

試驗(yàn)材料：試驗(yàn)材料為歐洲丁香品種‘Downfield’(S.vulgaris‘Downfield’)。選擇該品種成年大樹的膨大花芽進(jìn)行解剖，取材于2021年3月，采自北京農(nóng)學(xué)院園林苗圃。

誘導(dǎo)培養(yǎng)：將水培膨大但未開放的花芽從枝條上剪下(圖1a)，用洗衣粉充分洗滌后在流水下沖洗1 h。隨后在超凈工作臺上用體積分?jǐn)?shù)75%的乙醇溶液浸泡1 min，用體積分?jǐn)?shù)為2%的新潔爾滅溶液浸泡2 min，無菌水沖洗1次，84溶液(有效氯質(zhì)量分?jǐn)?shù)為6%)浸泡18 min，無菌水沖洗3次。生物學(xué)重復(fù)3次，每次重復(fù)包括12個(gè)外植體材料。將獲得的無菌花芽在無菌條件下剝?nèi)パ亏[，縱切解剖出花序軸后將花序軸切割成2～3 mm的小塊(圖1b、圖1c)，接種到以MS、改良型Blaydes、木本植物用培養(yǎng)基(WPM)作為基本培養(yǎng)基，分別加入苯基噻二唑基脲(TDZ，質(zhì)量濃度分別為0、0.05、0.10 mg/L)和2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D，質(zhì)量濃度分別為0、1、2 mg/L)的27種愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，添加蔗糖40 g/L、酶水解酪蛋白1 g/L、植物凝膠3.3 g/L、肌醇0.1 g/L。每個(gè)培養(yǎng)皿接種4個(gè)花序軸、10個(gè)花序(圖1d)，3次重復(fù)，在黑暗環(huán)境下培養(yǎng)。17 d后觀察愈傷組織的生長分化情況并統(tǒng)計(jì)愈傷組織誘導(dǎo)率，直尺測量愈傷組織直徑，顯微鏡下觀察并記錄愈傷組織狀態(tài)。外植體接種后60 d對初始愈傷組織進(jìn)行繼代培養(yǎng)，之后每30 d為一周期，對愈傷組織進(jìn)行繼代培養(yǎng)。

愈傷組織誘導(dǎo)率=(誘導(dǎo)出愈傷組織的外植體個(gè)數(shù)/接種外植體的總數(shù))×100%。

愈傷組織懸浮培養(yǎng)：以花序及花序軸誘導(dǎo)出的愈傷組織為材料，以錐形瓶容積、初始液體培養(yǎng)基體積、舊培養(yǎng)基保留比例、接種質(zhì)量為4因素，設(shè)計(jì)了L9(34)的正交試驗(yàn)(表1)。從上述愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基中分別挑選出適合花序和花序軸的最優(yōu)配方，調(diào)節(jié)pH至5.8，在轉(zhuǎn)速120 r/min條件下黑暗培養(yǎng)，共設(shè)9個(gè)處理，分別編號為c1～c9，每個(gè)處理重復(fù)3次。每15 d繼代1次，至30 d共統(tǒng)計(jì)2次，計(jì)算愈傷組織增殖質(zhì)量。

a為歐洲丁香膨大花芽；b為縱解剖花芽；c為解剖的花序軸；d為花序及花序軸愈傷組織誘導(dǎo)初始狀態(tài)；e為花序愈傷組織誘導(dǎo)初始狀態(tài)。

表1 懸浮培養(yǎng)正交試驗(yàn)時(shí)培養(yǎng)基各組分構(gòu)成的梯度設(shè)計(jì)

優(yōu)化愈傷組織懸浮培養(yǎng)：對初始懸浮培養(yǎng)進(jìn)行優(yōu)化，以聚乙烯吡咯烷酮(PVP)質(zhì)量濃度、初始液體培養(yǎng)基體積、維生素C(Vc)質(zhì)量濃度、接種質(zhì)量為4因素，設(shè)計(jì)了L9(34)的正交試驗(yàn)(表2)。其他條件不變，共設(shè)9個(gè)處理，每個(gè)處理重復(fù)3次。每15 d繼代1次，至30 d共統(tǒng)計(jì)2次，計(jì)算愈傷組織增殖質(zhì)量。

表2 優(yōu)化懸浮培養(yǎng)正交試驗(yàn)時(shí)培養(yǎng)基各組分構(gòu)成的梯度設(shè)計(jì)

數(shù)據(jù)處理：用數(shù)據(jù)分析軟件IBM SPSS Statistics 26.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。用反正弦轉(zhuǎn)換法對百分?jǐn)?shù)進(jìn)行轉(zhuǎn)化。通過方差齊次性檢驗(yàn)后，用鄧肯多重檢驗(yàn)對不同處理進(jìn)行顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 培養(yǎng)基類型和激素添加質(zhì)量濃度對花序和花序軸愈傷組織誘導(dǎo)率的影響

由表3可知，花序軸愈傷組織在改良型Blaydes培養(yǎng)基的平均誘導(dǎo)率最高，花序愈傷組織在MS培養(yǎng)基的平均誘導(dǎo)率最高，但3種基本培養(yǎng)基平均誘導(dǎo)率相差不大?；ㄐ蚣盎ㄐ蜉S添加TDZ或2,4-D較空白培養(yǎng)基能提高誘導(dǎo)率，其趨勢表現(xiàn)為隨TDZ質(zhì)量濃度升高誘導(dǎo)率下降，隨2,4-D質(zhì)量濃度增加誘導(dǎo)率隨之增加。

表3 不同培養(yǎng)基類型和激素添加質(zhì)量濃度下花序和花序軸愈傷組織誘導(dǎo)情況

花序與花序軸結(jié)果一致，在單獨(dú)添加2,4-D的組合中，添加2 mg/L 2,4-D誘導(dǎo)率最高可達(dá)100%。花序軸在單獨(dú)使用TDZ的組合中，添加0.05 mg/L TDZ其誘導(dǎo)率最高也達(dá)100%。TDZ與2,4-D聯(lián)合作用時(shí)，花序與花序軸誘導(dǎo)率最高的組合為TDZ 0.10 mg/L+2,4-D 1 mg/L，花序在編號6組合下、花序軸在編號6和15組合下，平均誘導(dǎo)率均達(dá)到100%(圖2a、b、c)，誘導(dǎo)的愈傷組織呈顆粒狀，質(zhì)地疏松(圖2d)，愈傷組織直徑也處于較高水平(表3)。因此，最優(yōu)花序軸愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基為改良型Blaydes+TDZ 0.10 mg/L+2,4-D 1 mg/L，最優(yōu)花序愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS+TDZ 0.10 mg/L+2,4-D 1 mg/L。2,4-D顯著影響誘導(dǎo)率(p<0.05)，TDZ與2,4-D聯(lián)合作用顯著影響花序軸誘導(dǎo)率(p<0.05，表4)。

a為花序及花序軸接種7 d后愈傷組織狀態(tài)；b為花序及花序軸接種30 d后愈傷組織狀態(tài)；c為花序及花序軸接種60 d后愈傷組織狀態(tài)；d為愈傷組織疏松結(jié)構(gòu)；e為愈傷組織褐化狀態(tài)；f為未啟動狀態(tài)。

表4 花序與花序軸誘導(dǎo)率與TDZ、2,4-D質(zhì)量濃度的方差分析結(jié)果

2.2 愈傷組織懸浮培養(yǎng)體系的建立

如表5所示，9組中c8效果最好，培養(yǎng)15 d平均增殖質(zhì)量1.67 g，培養(yǎng)30 d平均增殖質(zhì)量2.33 g。極差分析(表6)表明最優(yōu)組合條件為錐形瓶容積250 mL、初始液體培養(yǎng)基體積150 mL、舊培養(yǎng)基保留1/4、接種質(zhì)量4.5 g。4因素對增殖效率的影響從大到小排序依次為接種質(zhì)量、錐形瓶容積、初始液體培養(yǎng)基體積、舊培養(yǎng)基保留比例，接種質(zhì)量對其影響最大。但培養(yǎng)過程中出現(xiàn)褐化情況(圖3a)，導(dǎo)致增殖質(zhì)量低，需要添加抗氧化劑進(jìn)行優(yōu)化。

表5 愈傷組織增殖正交試驗(yàn)結(jié)果

表6 愈傷組織增殖正交試驗(yàn)結(jié)果極差分析結(jié)果

2.3 愈傷組織懸浮培養(yǎng)體系的優(yōu)化

如表7所示，9組中c1效果最好，培養(yǎng)15 d平均增殖質(zhì)量5.27 g，培養(yǎng)30 d平均增殖質(zhì)量17.90 g。極差分析(表8)表明優(yōu)化培養(yǎng)體系最優(yōu)組合條件為PVP質(zhì)量濃度為100 mg/L、初始液體培養(yǎng)基體積為150 mL、Vc質(zhì)量濃度為75 mg/L、接種質(zhì)量為7.0 g。培養(yǎng)15 d時(shí)接種質(zhì)量對增殖質(zhì)量影響最大，培養(yǎng)30 d時(shí)PVP質(zhì)量濃度對增殖質(zhì)量影響最大。優(yōu)化后顯著改善了褐化情況(圖3b)，增殖質(zhì)量較未優(yōu)化前大大增加(圖3c)，最優(yōu)組合培養(yǎng)30 d增殖系數(shù)達(dá)到3.98，低質(zhì)量濃度的Vc和PVP有助于細(xì)胞增殖。

表7 愈傷組織增殖優(yōu)化正交試驗(yàn)結(jié)果

表8 愈傷組織增殖優(yōu)化正交試驗(yàn)結(jié)果極差分析結(jié)果

3 討論

初代愈傷組織的出愈效果與外植體類型及質(zhì)量有關(guān)，有研究表明花部外植體較葉部外植體產(chǎn)生胚性愈傷組織的效率更高[16]。在北美楓香[26](Liquidambarstyraciflua)、海濱雀稗[27](Paspalumvaginatum)、椰子[28](Cocosnucifera)中也有采用花序作為外植體進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo)的報(bào)道。此外，由于歐洲丁香的花序及花序軸位于花芽內(nèi)部，花芽未開放時(shí)芽鱗閉合緊密，不易受到外界環(huán)境的污染，且由于芽鱗的保護(hù)，消毒液對內(nèi)部的花序及花序軸損害程度低，因此花序及花序軸與葉片、莖段、胚軸等外植體相比，消毒后壞死率更低。本研究以歐洲丁香花序及花序軸作為外植體，誘導(dǎo)出的愈傷組織質(zhì)地松軟，呈顆粒狀，長勢良好，因此認(rèn)為花序及花序軸是誘導(dǎo)歐洲丁香愈傷組織的理想試驗(yàn)材料。

a為初始懸浮培養(yǎng)狀態(tài)；b為優(yōu)化懸浮培養(yǎng)狀態(tài)；c為懸浮培養(yǎng)增殖量。

激素的種類、質(zhì)量濃度、比例對愈傷組織的誘導(dǎo)極其重要[29]。2,4-D主要誘導(dǎo)核仁產(chǎn)生各種RNA，從而增強(qiáng)蛋白質(zhì)的合成，加強(qiáng)酶的活性，啟動細(xì)胞分裂，由此完成脫分化過程[15]。在木瓜[29](Chaenomelessinensis)、卡菲爾酸橙[30](Citrushystrix)、阿育魏實(shí)[31](Trachyspermumammi)等物種中均存在低質(zhì)量濃度2,4-D對于誘導(dǎo)愈傷組織效果更佳的報(bào)道。有研究表明，高質(zhì)量濃度2,4-D對許多植物具有遺傳毒性，高質(zhì)量濃度的2,4-D會減少棗椰樹(Phoenixdactylifera)新鮮愈傷組織質(zhì)量、減少總可溶性蛋白、游離氨基酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)，增加脯氨酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)及酚類化合物與過氧化物酶活性[32]。本研究也發(fā)現(xiàn)較低質(zhì)量濃度的2,4-D可以顯著提高愈傷組織誘導(dǎo)率。雖然僅添加2,4-D就能夠誘導(dǎo)出愈傷組織，但是加入細(xì)胞分裂素類物質(zhì)能促進(jìn)細(xì)胞的分裂及分化，對誘導(dǎo)產(chǎn)生胚狀體和不定芽有一定幫助[33]。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，低質(zhì)量濃度的TDZ對花序軸愈傷組織誘導(dǎo)具有促進(jìn)作用，誘導(dǎo)出的愈傷組織呈淡黃色、顆粒狀、長勢旺盛，但提高TDZ質(zhì)量濃度反而會抑制其生長。同樣在以橡膠樹花藥為外植體時(shí)發(fā)現(xiàn)隨著TDZ質(zhì)量濃度的提高，愈傷組織的誘導(dǎo)率反而下降[34]。

接種質(zhì)量是影響愈傷懸浮培養(yǎng)增殖的重要因素[35]。本試驗(yàn)在初次懸浮培養(yǎng)中發(fā)現(xiàn)，在歐洲丁香細(xì)胞懸浮培養(yǎng)中對增殖率影響最大的因素是接種質(zhì)量。已有研究表明，接種質(zhì)量過低，無法達(dá)到臨界分裂濃度，會造成細(xì)胞無法分裂，接種質(zhì)量過高，則會使細(xì)胞在有限的生存空間內(nèi)爭奪營養(yǎng)物，限制組織的增殖[23]。接種質(zhì)量為影響15 d細(xì)胞增殖的首要因素，但在懸浮培養(yǎng)體系建立試驗(yàn)中，愈傷組織增殖效果并不理想且出現(xiàn)嚴(yán)重的褐化現(xiàn)象，因此猜測是褐化抑制了愈傷組織增殖，在優(yōu)化試驗(yàn)中添加抗氧化劑的確會抑制褐化并且提高增殖效率，且PVP質(zhì)量濃度是培養(yǎng)30 d影響愈傷組織增殖最大的因素。PVP常作為抗褐化劑應(yīng)用于組織培養(yǎng)中，褐化現(xiàn)象的主要成因可能是酚類化合物和多酚氧化酶物質(zhì)在氧氣的作用下生成單醌類化合物，單醌類進(jìn)一步積聚成為褐色的多醌類物質(zhì)[36]。Vc作為抗氧化劑、PVP作為吸附劑在多物種中被報(bào)道可以有效的緩解褐化[36-38]。但由于PVP良好的吸附性，在吸附酚類物質(zhì)的同時(shí)也會吸附一些激素，導(dǎo)致細(xì)胞可利用的激素質(zhì)量濃度降低，導(dǎo)致生長減緩[34]。在本試驗(yàn)中添加低質(zhì)量濃度的PVP細(xì)胞增殖效果較好。同樣，抗氧化劑Vc的加入能避免酚類物質(zhì)被氧化成有毒的多醌類物質(zhì)，保證細(xì)胞能夠正常利用，以達(dá)到增加產(chǎn)量的目的，但高質(zhì)量濃度的Vc也會對細(xì)胞有毒害作用，在本研究中較低質(zhì)量濃度的Vc對細(xì)胞增殖效果最佳[38]。在優(yōu)化懸浮試驗(yàn)中加入PVP與Vc，增殖質(zhì)量大幅提升，通過2次懸浮試驗(yàn)的對比，我們認(rèn)為抵抗褐化對歐洲丁香細(xì)胞懸浮培養(yǎng)是十分重要的。本試驗(yàn)利用歐洲丁香花序及花序軸建立了穩(wěn)定的愈傷組織誘導(dǎo)體系及懸浮培養(yǎng)體系，為開展再生體系及遺傳改良研究提供參考，為實(shí)現(xiàn)后續(xù)良種快繁及工廠化育苗打下基礎(chǔ)。