俞曉菡，余上海，惠夢雨，高 悅，劉 平，李 艦，張 華

1.上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院，上海市中醫(yī)藥研究院肝病研究所，肝腎疾病病證教育部重點實驗室，上海市中醫(yī)臨床重點實驗室（上海 201203）；2.上海中醫(yī)藥大學(xué)交叉科學(xué)研究院（上海 201203）；3.江西中科九峰智慧醫(yī)療科技有限公司（江西 南昌 330095）

目診為中醫(yī)望診的重要組成部分，是通過觀察目的神、色、形、態(tài)以診察疾病的方法，為診法之首要。當今，人們將眼的胚胎發(fā)育、五輪學(xué)說及生物全息論相結(jié)合，認為眼的各個部位可以對應(yīng)臟腑生物學(xué)特征進行劃分［1］。這是整體與局部關(guān)系的本質(zhì)體現(xiàn)，體現(xiàn)了中醫(yī)學(xué)的“統(tǒng)一整體觀”。傳統(tǒng)望目無法直接觀察眼底血管情況，借助眼底照相機眼科專用設(shè)備，結(jié)合計算機視覺、機器學(xué)習(xí)等人工智能技術(shù)，可以獲得更加精準、客觀的眼底血管信息。隨著機器學(xué)習(xí)在醫(yī)學(xué)圖像分割方面研究水平的不斷突破，大型深層卷積神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型在眼底視網(wǎng)膜圖像數(shù)據(jù)集方面實現(xiàn)了自動評級，并在公共數(shù)據(jù)集EIARG1上得到了驗證［2］，故可將其引入中醫(yī)證候與眼底圖像變化關(guān)系的探索研究。

非酒精性脂肪性肝?。╪on-alcoholic fatty liver disease，NAFLD）是一種慢性進行性疾病，與肝硬化、肝細胞癌的發(fā)生有關(guān)，其發(fā)病率逐年上升［3-4］。中醫(yī)藥在辨證治療NAFLD方面具有一定的優(yōu)勢，但其證候辨識缺少客觀標準，不同醫(yī)家辨證論治思路不同，因此限制了療效的發(fā)揮。濕熱內(nèi)蘊證、肝郁脾虛證為NAFLD患者臨床常見的中醫(yī)證型［5-8］，基于“目為肝之竅”的中醫(yī)理論及機器學(xué)習(xí)技術(shù)，本研究擬以濕熱內(nèi)蘊證及肝郁脾虛證為切入點，以無典型證者作為對照，運用計算機視覺技術(shù)提取眼底圖像特征并進行比較分析，進而探討與NAFLD病、證相關(guān)的眼底血管特異性改變，以期豐富中醫(yī)目診理論并為NAFLD的中醫(yī)證候分類提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 研究對象選擇

1.1.1 納入標準 NAFLD患者：①符合《非酒精性脂肪性肝病與相關(guān)代謝紊亂診療共識（第二版）》［9］中的疾病診斷標準；②中醫(yī)辨證為濕熱內(nèi)蘊證、肝郁脾虛證或無典型證［10］；③年齡18～70周歲；④簽訂知情同意書。

健康人群：選擇與NAFLD患者性別、年齡相匹配的健康志愿者，實驗室及腹部彩超、肝臟超聲瞬時彈性成像及核磁共振檢查未見異常。

1.1.2 排除標準 ①合并2型糖尿病或3級以上高血壓者；②合并結(jié)膜炎、結(jié)膜出血、重度眼部外傷、感染性眼病，或有眼部手術(shù)史者；③有深、淺感覺障礙及眼瞼發(fā)硬不易撥開者；④妊娠或哺乳期女性，過敏體質(zhì)者；⑤既往有精神類疾病或伴有嚴重的意識障礙影響溝通者。

1.2 研究對象來源 本研究涉及的NAFLD病例均來源于2020年9月至2022年1月上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院，健康人群來源于同期上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院體檢中心。本研究方案經(jīng)上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準（倫理批號：2018-616-45-01），并在中國臨床試驗注冊中心注冊（注冊號：ChiCTR2000037664）。

1.3 研究內(nèi)容與方法

1.3.1 臨床信息 采用課題組制定的《肝腎疾病病證教育部重點實驗室臨床信息采集表》［11］收集臨床信息，包括一般資料（性別、年齡、家族史等）、體格檢查及肝腎功能、血脂、血常規(guī)、腹部影像等理化檢查資料。

采用《中醫(yī)證候評定量表》［11］收集中醫(yī)四診信息，并將臨床癥狀進行5級賦值量化［10］。自覺癥狀分為嚴重程度和出現(xiàn)頻次兩部分，有者計為1～4分，無者計為0分；體征及舌脈象則依據(jù)有或無進行分類，并據(jù)此賦予分值，有者計為1分，無者計為0分。由3名專家根據(jù)數(shù)據(jù)庫中的四診信息進行辨證。

1.3.2 眼底圖像 由專業(yè)人員借助數(shù)字眼底照相機（APS-AER型，重慶康華瑞明科技股份有限公司）統(tǒng)一采集研究對象的眼底照片，將眼底圖像輪廓清晰、前景和背景區(qū)分明顯、血管脈絡(luò)分明的圖片納入分析。選定照片后用兩種儲存模式儲存圖像數(shù)據(jù)，一種是原始分辨率，用于人工復(fù)核及診斷，另一種是機器學(xué)習(xí)所使用的數(shù)字化矩陣，按照512×512×3的分辨率進行儲存，供模型調(diào)用。

1.3.3 疾病診斷模型 （1）眼底圖像分割。運用R語言和機器學(xué)習(xí)框架TensorFlow，通過訓(xùn)練得到改進的U-Net模型?；谠撃Ｐ蛯Σ杉降难鄣渍掌M行預(yù)測，預(yù)測結(jié)果以黑白模式顯示，白色區(qū)域代表機器分割出來的血管，黑色區(qū)域為其他背景部分。見圖1。

圖1 改進的U-Net模型進行血管分割示例

（2）眼底圖像特征提取。因直接運用機器學(xué)習(xí)方法建立分類模型不能描述疾病與圖像特征之間的關(guān)系，故本研究在眼底血管分割之后，采用傳統(tǒng)的特征提取方式提取特征，包括血管形態(tài)和顏色特征、血管紋理特征。

血管形態(tài)和顏色特征：在分割的圖像結(jié)果中，每幅圖片中的血管都被分成了很多段，并提取血管總面積（area）、血管平均寬度（width）、血管細小分支比例（smallrate）、血管彎曲程度（curved）、血管細小分支彎曲程度（smallcurved）及血管顏色特征（包括顏色強度均值（b mean）和方差（b standard deviation，bsd）等特征。

血管紋理特征：引入Haralick定義的GLCM［11］來描述血管紋理特征，包括同質(zhì)度［也稱逆差距（inverse difference moment，idm）］、對比度（contrast，con）、熵（entropy，ent）、角二階矩（angular second moment，asm）、相關(guān)性（correlation，cor）、方差（variance，var）、和平均值（sum average，sav）、和方差（sum variance，sva）、差分方差（difference variance，dva）、和熵（sum entropy，sen）、差分熵（difference entropy，den）、信息度量f12、信息度量f13。

（3）基于眼底血管特征診斷NAFLD模型的建立及評價。以健康人為對照，運用決策樹模型（R語言rpart包實現(xiàn)）建立分類模型。模型判識NAFLD的準確率為0.972，靈敏度為0.970，特異性為0.975，受試者工作特征曲線（ROC）下面積（AUC）為0.995（見圖2）。上述表明該模型可有效用于對不同證候NAFLD患者眼底血管圖像特征的提取與分析。

圖2 決策樹模型受試者工作特征曲線（ROC）下面積（AUC）

1.3.4 NAFLD患者常見癥狀篩選 為分析NAFLD有代表性的癥狀與眼底特征間的相關(guān)性，故對所采集的癥狀進行篩選。首先，刪除在肝郁脾虛證、濕熱內(nèi)蘊證NAFLD患者中出現(xiàn)頻率≤5%的少見癥狀；其次，將反映每一癥狀的頻次與程度兩個維度得分相加，選取二者之和>3分，且出現(xiàn)頻率>25%的癥狀作為常見癥狀，并與眼底特征進行相關(guān)性分析。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 本研究數(shù)據(jù)采用SPSS 26.0軟件進行處理與分析。符合正態(tài)分布和方差齊性的計量資料，用±s描述，組間比較采用兩獨立樣本t檢驗或單因素方差分析。不符合正態(tài)分布或方差不齊的計量資料，用M（P25，P75）描述，組間比較采用Mann-Whitney U或Kruskal-Wallis H秩和檢驗。使用R語言psych包進行Spearman相關(guān)性分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般資料 本研究共納入NAFLD患者126例，設(shè)為NAFLD組，其中濕熱內(nèi)蘊證61例、肝郁脾虛證44例、無典型證21例，分別設(shè)為濕熱內(nèi)蘊組、肝郁脾虛組、無典型證組；納入健康人110例，設(shè)為健康組。NAFLD組與健康組性別、年齡比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），NAFLD 組體質(zhì)量指數(shù)（BMI）高于健康組（P<0.05）。NAFLD組各中醫(yī)證型患者性別、年齡比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），NAFLD濕熱內(nèi)蘊證患者BMI高于肝郁脾虛證及無典型證者（P<0.05）。見表1、表2。

表1 一般資料比較（NAFLD與健康人）（±s）

表1 一般資料比較（NAFLD與健康人）（±s）

注：NAFLD為非酒精性脂肪性肝病，BMI為體質(zhì)量指數(shù)。與健康組比較，*P<0.05。

BMI/（kg·m-2）28.08±3.69*23.43±2.72 n女組別NAFLD組健康組126 110性別/例男96 83 30 27年齡/歲38.41±10.00 38.45±9.63

表2 一般資料比較（NAFLD各中醫(yī)證型）（±s）

表2 一般資料比較（NAFLD各中醫(yī)證型）（±s）

注：NAFLD為非酒精性脂肪性肝病，BMI為體質(zhì)量指數(shù)。與無典型證組比較，*P<0.05；與肝郁脾虛組比較，# P<0.05。

組別n 年齡/歲BMI/（kg·m-2）無典型證組肝郁脾虛組濕熱內(nèi)蘊組21 44 61性別/例男16 34 46女 5 1 0 15 39.67±6.18 39.09±12.08 37.49±9.46 25.98±2.45 27.57±3.60 29.17±3.77*#

2.2 眼底血管特征比較 血管形態(tài)和顏色特征：經(jīng)Kruskal Wallis H檢驗，與無典型證組相比，濕熱內(nèi)蘊組及肝郁脾虛組area降低，smallrate、curved、smallcurved升高（P<0.05）；與肝郁脾虛組比較，濕熱內(nèi)蘊組眼底血管形態(tài)和顏色特征相關(guān)指標未見明顯差異（P>0.05）。見表3。

血管紋理特征：經(jīng)Mann-Whitney U檢驗，與無典型證組相比，濕熱內(nèi)蘊組asm升高、den降低（P<0.05），肝郁脾虛組con、dva、den降低，idm升高（P<0.05）；與肝郁脾虛組比較，濕熱內(nèi)蘊組眼底血管紋理特征相關(guān)指標未見明顯差異（P>0.05）。見表3。

表3 非酒精性脂肪性肝病各中醫(yī)證型患者眼底血管特征值比較［M（P25，P75）］

2.3 NAFLD患者眼底血管特征改變的影響因素分析

2.3.1 年齡、性別 NAFLD患者年齡與特征值asm、curved及idm呈正相關(guān)（P<0.05），與area、width、bsd、den、cor、ent、sen及信息度量f13呈負相關(guān)（P<0.05），性別與smallcurved呈負相關(guān)（P<0.05）。見圖3。

圖3 非酒精性脂肪性肝病患者年齡、性別與眼底血管特征值的相關(guān)性分析結(jié)果

2.3.2 濕熱內(nèi)蘊證、肝郁脾虛證NAFLD患者常見癥狀 105例辨證為濕熱內(nèi)蘊證及肝郁脾虛證的NAFLD患者中，癥狀出現(xiàn)頻率≤5%的癥狀3種，分別為厭食油膩食品、惡心及下肢浮腫，不納入后續(xù)篩選；頻次與程度積分之和>3分，且出現(xiàn)頻率>25%的常見癥狀為乏力、口干、夜間睡眠不足、大便稀薄不成形、眼睛干澀及白天困倦欲睡，共6個。見表4。

表4 105例非酒精性脂肪性肝病患者常見癥狀篩選結(jié)果

NAFLD常見癥狀中，眼睛干澀與area、width及信息度量f13呈負相關(guān)（P<0.05）；大便稀薄不成形與curved、con及dva呈正相關(guān)（P<0.05），與idm呈負相關(guān)（P<0.05）。見圖4。

圖4 非酒精性脂肪性肝病患者常見癥狀與眼底血管特征值的相關(guān)性分析結(jié)果

3 討論

當下，NAFLD已成為我國最常見的慢性肝臟疾病，其與代謝綜合征、肥胖癥、2型糖尿病密切相關(guān)［12］。本病可歸屬于中醫(yī)學(xué)的“肝癖”“肝痞”“積聚”等范疇，情志不遂、飲食不節(jié)，導(dǎo)致脾胃功能受損、三焦氣化不利，痰、濕、濁、瘀、熱蘊結(jié)肝體，故而發(fā)?。?3-15］。其病位在肝，又常累及脾、腎，運用中醫(yī)藥辨證治療具有明顯優(yōu)勢。

人類疾病的許多特征都可反映于眼部，眼表鞏膜（血管、斑塊）、眼底視網(wǎng)膜、血管等表現(xiàn)出的生物特征都可以視作某種疾病在眼部生物特征的反射。隨著計算機視覺及深度學(xué)習(xí)技術(shù)的進步，目前已有將眼底圖像作為疾病診斷和證候辨識依據(jù)的相關(guān)報道，AI算法可以成功識別 NAFLD［16-19］。課題組前期研究［20］發(fā)現(xiàn)，肝硬化患者有眼底動靜脈比例失調(diào)、血管壁銅絲樣改變、血管扭曲及眼底滲出等表現(xiàn)，且不同肝功能分級、是否伴門脈高壓、不同中醫(yī)證候（肝腎陰虛、肝膽濕熱、肝郁脾虛）患者的眼底血管改變存在明顯差異。本研究在前期研究的基礎(chǔ)上，以濕熱內(nèi)蘊證、肝郁脾虛證NAFLD為切入點，運用計算機視覺技術(shù)提取眼底圖像特征，并據(jù)此分析NAFLD病、證相關(guān)的眼底血管特異性改變。

既往研究［21］表明，體質(zhì)為痰濕質(zhì)、濕熱質(zhì)的NAFLD患者BMI升高，體質(zhì)量超標，肥胖者患病風(fēng)險增加，且以男性為多。本研究結(jié)果顯示，濕熱內(nèi)蘊組NAFLD患者BMI高于肝郁脾虛組及無典型證組（P<0.05）。隨著年齡的增長，血管彈性降低、硬度增加，心腦血管疾病的發(fā)生率隨之升高，NAFLD是心腦血管疾病的獨立危險因素［22］。因此，我們分析了NAFLD患者年齡、性別與眼底血管間的關(guān)系，結(jié)果顯示NAFLD患者年齡與特征值asm、curved及idm呈正相關(guān)（P<0.05），與area、width、bsd、den、cor、ent、sen及信息度量f13呈負相關(guān)（P<0.05），性別與smallcurved呈負相關(guān)（P<0.05）。

在血管形態(tài)和顏色特征方面，與無典型證組相比，濕熱內(nèi)蘊組、肝郁脾虛組area降低（P<0.05），smallrate、curved、smallcurved升高（P<0.05），可見有典型臨床癥狀患者的眼底血管發(fā)生變化較無癥狀或癥狀輕微者更明顯。因此，本研究進一步篩選了105例有明顯癥狀的NAFLD患者的常見癥狀，并分析了常見癥狀與眼底血管改變的相關(guān)性，結(jié)果顯示眼睛干澀與area、width及信息度量f13呈負相關(guān)（P<0.05），大便稀薄不成形與curved、con及dva呈正相關(guān)（P<0.05），與idm呈負相關(guān)（P<0.05）。

Haralick特征在醫(yī)學(xué)圖像識別領(lǐng)域應(yīng)用十分廣泛，比如眼底血管紋理特征可以用于糖尿病的診斷［23］，又如肝臟核磁共振圖像的紋理特征可以用于診斷輕、中度肝纖維化［24］。Haralick特征包含13個特征指標，主要用來描述圖像的紋理。圖像紋理是指圖像中大量的規(guī)律性很強或者很弱的相似結(jié)構(gòu)或圖形結(jié)構(gòu)，即影像灰度在空間上的變化與重復(fù)，可以在眼底血管圖像中體現(xiàn)NAFLD的病變規(guī)律。本研究引入這13個特征指標，用于對不同證候NAFLD患者眼底血管圖像進行描述。與無典型證者相比，濕熱內(nèi)蘊證者特征值asm升高、den降低（P<0.05），提示濕熱內(nèi)蘊證者眼底血管紋理增粗，但復(fù)雜程度降低；肝郁脾虛證組的con、dva、den降低、idm升高（P<0.05），提示肝郁脾虛證者血管紋理溝紋變淺，局部變化小，圖像均勻。但濕熱內(nèi)蘊與肝郁脾虛兩種證候間的Haralick特征比較，尚未發(fā)現(xiàn)顯著性差異，這可能與樣本量及納入患者的證候典型程度有關(guān)；除此之外，濕熱內(nèi)蘊證與肝郁脾虛證在NAFLD疾病進程中有遞進關(guān)系，二者相互交織［25］，因此對眼底血管的影響較為相似，有待進一步探索驗證。

綜上，本研究采用機器學(xué)習(xí)方法觀察了NAFLD不同中醫(yī)證型患者的眼底血管圖像，發(fā)現(xiàn)與無典型證者相比，濕熱內(nèi)蘊證及肝郁脾虛證患者眼底的血管紋理存在特異性改變，具體表現(xiàn)為濕熱內(nèi)蘊證患者眼底血管紋理增粗，肝郁脾虛證患者血管紋理變淺。受時間及條件所限，本研究未對眼底視神經(jīng)乳頭、視網(wǎng)膜等眼底常見結(jié)構(gòu)變化進行分析，且樣本量較小，無法對年齡進行分層分析。今后，我們會提高模型算法并擴大樣本量，采用病證結(jié)合的方法進行深入研究，以期為發(fā)展中醫(yī)目診及中醫(yī)肝病證候客觀化研究提供數(shù)據(jù)支撐。