周 娟，王 楊，嚴 驊

上海中醫(yī)藥大學附屬曙光醫(yī)院生殖醫(yī)學中心（上海 200120）

多囊卵巢綜合征（polycystic ovarian syndrome，PCOS）起病于青春期，對5%～15%育齡期女性產生影響［1］。在 PCOS病理過程中，胰島素抵抗（insulin resistance，IR）的易感性顯著增加［2］。腸道菌群是指居住在胃腸道的復雜細菌群落，其與人類宿主共同進化形成一種共生關系且相互作用，在不同程度上影響人體的健康［3］?，F代醫(yī)學研究［4］表明，腸道中的許多微生物參與了人體內營養(yǎng)物質的消化與吸收，若腸道內的菌群結構失衡，則會出現腹瀉、腹痛、腸鳴、便秘等胃腸道功能紊亂癥狀，這與中醫(yī)所說的“脾虛證”癥狀相似。同時腸道菌群平衡與中醫(yī)“正氣”密切相關。腸道中微生態(tài)保持平衡，則“正氣存內，邪不可干”；若正氣不足，則腸道微生態(tài)與免疫功能容易失衡［5］。

近年來，以腸道菌群為靶點尋找治療代謝性疾病的中藥復方已成為新的熱點研究話題。本實驗采用來曲唑聯合高脂飼料建立多囊卵巢綜合征伴胰島素抵抗（polycystic ovary syndrome and insulin resistance，PCOSIR）大鼠模型，觀察經培補清利方干預后腸道菌群變化等相關指標，進而以腸道菌群為靶點尋找改善PCOS-IR各項指標的中藥復方，旨在從腸道菌群調節(jié)的角度為PCOS-IR的治療提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 SPF級SD大鼠26只，雌性，3周齡，體質量60～70 g，購于上海維通利華實驗動物有限責任公司。動物生產許可證號：SCXK（滬）2017-0011。實驗大鼠飼養(yǎng)于上海中醫(yī)藥大學實驗動物中心SPF級動物室，分籠飼養(yǎng)，22 ℃恒溫條件，相對濕度（55±5）%，光照周期12 h光照、12 h黑暗。動物使用許可證號：SCXK201036。本實驗經上海中醫(yī)藥大學實驗動物倫理委員會批準（倫理批準號：PZSFUTCM9060901）。

1.1.2 藥物與試劑 培補清利方（黃芪20 g、熟地黃12 g、蒲黃10 g、丹參15 g、黃連9 g、香附12 g、半夏9 g、茯苓12 g、陳皮9 g、甘草6 g）購于上海中醫(yī)藥大學附屬曙光醫(yī)院。根據人與實驗動物用藥劑量換算［6］，濃縮至生藥量為2.1 g/mL培補清利方中藥藥液，保存待用。

來曲唑，江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司（批號：15011956）；羧甲基纖維素鈉（CMC），河南潤發(fā)生物科技有限公司（批號：GB276031）；羅氏血糖儀及血糖試紙，美國Roche公司（批號：20182400044）；革蘭氏染色液，杭州西素生物科技有限公司（批號：20214206）；大鼠胰島素ELISA試劑盒，上海司鼎生物科技有限公司（批號：20210034）；糞便基因組DNA提取試劑盒，美國MP Biomedicals公司（批號：116560200）。

高脂飼料供能比：蛋白20%，碳水化合物20%，脂肪45%，其他15%；由深圳睿迪生物科技公司提供（D12451）。

普通飼料供能比：蛋白20%，碳水化合物70%，脂肪10%；由上海中醫(yī)藥大學實驗動物中心提供。

1.1.3 儀器 電子天平，賽多利斯科學儀器有限公司（型號：YG21032）；光學顯微鏡，南京光電股份有限公司（型號：DM6000）；全自動生化分析儀，上海濟生醫(yī)療器械有限公司（型號：IN-53090）；PCR 儀，美國Bio-Rad 公司（型號：YMA-2000）；高速離心機，美國Thermo Fisher公司（型號：SIGMA3-18K）；基因測序儀（MiSeq），美國Illumina公司。

1.2 分組與造模 參考文獻［7］方法，將大鼠隨機分為對照組（8只）和模型組（18只）。模型組予高脂飼料喂養(yǎng)3周，對照組予普通飼料喂養(yǎng)3周。第6周齡時，模型組大鼠持續(xù)予高脂喂養(yǎng)，并每日按照1 mg/kg標準灌胃來曲唑-CMC混懸液。對照組每日予CMC 1 mg·kg-1·d-1，并以普通飼料喂養(yǎng)。兩組均連續(xù)灌胃13周。以模型組大鼠體質量高于對照組大鼠體質量平均值20%以上、穩(wěn)態(tài)模型胰島素抵抗指數（HOMA-IR）低于對照組大鼠HOMA-IR平均值基準線20%以上、大鼠的動情周期處于持續(xù)的無排卵狀態(tài)為造模成功。造模結束后，將造模成功的15只大鼠按照體質量采用完全隨機法分為模型組（7只）和治療組（8只）。

1.3 干預 對照組：上午予以1 mg/kg的蒸餾水灌胃，下午予以0.025 mL·g-1·d-1的蒸餾水灌胃。模型組：上午予以1 mg/kg標準來曲唑-CMC混懸液灌胃，下午予以0.025 mL·g-1·d-1的蒸餾水灌胃。治療組：上午予以1 mg/kg標準來曲唑-CMC混懸液灌胃，下午予以0.025 mL·g-1·d-1的培補清利方濃縮藥液灌胃。每3 d稱量1次體質量，根據體質量變化進行藥物劑量調整?？偗煶虨?2 d。

1.4 檢測指標與方法

1.4.1 大鼠體質量 每周稱量大鼠體質量，繪制體質量曲線圖，對比大鼠體質量的變化情況。

1.4.2 卵巢組織學形態(tài) 干預結束后，禁食12 h，取大鼠雙側卵巢組織，稱取卵巢質量，測量卵巢直徑。將卵巢放入4%多聚甲醛固定待HE染色制片，鏡下觀察卵巢形態(tài)學變化，并統計黃體和囊性卵泡數量。

1.4.3 口服葡萄糖耐量試驗（OGTT） 干預結束后，在空腹狀態(tài)下行大鼠OGTT，分別在0 min（空腹血糖，FBG）、30 min（餐后30 min血糖，PBG 30′）、60 min（餐后60 min血糖，PBG 60′）、90 min（餐后90 min血糖，PBG 90′）、120 min（餐后120 min血糖，PBG 120′）時測定血糖值。

1.4.4 血清空腹胰島素水平及胰島素抵抗指數 干預結束后，禁食12 h，采集大鼠腹主動脈血，靜置離心，于-20 ℃保存。采用酶聯免疫吸附試驗（ELISA）試劑盒檢測大鼠血清空腹胰島素（FINS）水平，觀察各組大鼠血清FINS變化。具體按說明書操作。計算胰島素抵抗指數。HOMA-IR=（FBG×FINS）/22.5。

1.4.5 腸道菌群檢測 干預結束后，待取材的前1日清晨采集大鼠糞便，放至無菌EP管內并置于-80 ℃低溫冰箱保存，便于后期16S rRNA檢測（圖1）。通過PICRUSt2軟件預測分析腸道微生物的代謝功能，并利用京都基因和基因組百科全書（KEGG）數據庫對腸道微生物的功能進行分析。

圖1 16S rRNA分析步驟

1.5 統計學方法 實驗數據采用SPSS 21.0 統計軟件進行分析。所有計量資料用±s表示，組間差異比較采用單因素方差分析；兩兩比較，方差齊時采用LSD檢驗，方差不齊時采用秩和檢驗。血糖OGTT試驗采用重復測量資料方差分析。使用QIIME軟件進行微生物相關分析。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 對大鼠體質量的影響 與對照組比較，模型組大鼠與治療組大鼠體質量差異有統計學意義（P<0.05）。與模型組比較，治療組大鼠體質量差異無統計學意義（P>0.05）。見圖2。

圖2 大鼠體質量折線圖

2.2 對大鼠卵巢組織形態(tài)學的影響 鏡下可見對照組大鼠卵巢內部構造清晰、結構完整，大部分卵泡的卵泡壁上包裹著多層結構完好的顆粒細胞。模型組大鼠卵巢呈病理性變化，出現多個囊性擴張卵泡，大小不等。與模型組相比，治療組大鼠卵巢組織內囊性卵泡數目減少（P<0.05），黃體數量出現增加趨向但差異不顯著（P>0.05）。各組大鼠卵巢質量差異有統計學意義（P<0.05）。與對照組比較，模型組大鼠卵巢直徑增加（P<0.05）。見圖3、圖4。

圖3 卵巢組織形態(tài)學分析（HE染色，×10）

圖4 各組卵巢囊性卵泡、黃體、卵巢質量及直徑比較

2.3 對大鼠血糖OGTT的影響 各組FBG差異無統計學意義（P>0.05）。PBG 30′時，與對照組比較，模型組、治療組大鼠血糖降低（P<0.05）。PBG 90′時，與對照組比較，模型組、治療組血糖升高（P<0.05）。PBG 120′時，治療組大鼠血糖值與對照組接近，低于模型組（P<0.05）。見表1。

表1 各組大鼠OGTT結果比較（n=6，±s，mmol·L-1）

表1 各組大鼠OGTT結果比較（n=6，±s，mmol·L-1）

注：OGTT為口服葡萄糖耐量試驗，FBG為空腹血糖，PBG為餐后血糖。與對照組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05。

PBG 120′6.65±0.80 8.65±0.90*7.02±0.60#組別對照組模型組治療組FBG 5.12±0.41 5.20±0.46 5.35±0.24 PBG 30′8.55±1.27 7.60±0.40*7.37±0.67*PBG 60′8.52±0.42 9.25±1.31 9.17±1.47 PBG 90′7.15±0.47 9.52±0.96*8.58±1.02*

2.4 對大鼠血清FINS、HOMA-IR的影響 與對照組比較，模型組FINS、HOMA-IR水平增加（P<0.05）。與模型組比較，治療組大鼠 FINS、HOMA-IR水平下降（P<0.05）。見圖5。

圖5 各組大鼠FINS、HOMA?IR 比較

2.5 對腸道菌群多樣性指數的影響 對腸道細菌群落進行整體分析的結果顯示，3組大鼠腸道微生物區(qū)系差異顯著。通過在OTUs＝0.03情況下得到chao指數、shannon指數來評估各組大鼠腸道微生物區(qū)系的豐富度、多樣性。發(fā)現與對照組相比，模型組與治療組（PCOS-IR大鼠）chao指數、shannon指數均下降（P<0.05），腸道微生物多樣性明顯減少。與模型組相比，經中藥干預后的大鼠chao指數上升（P<0.05），腸道微生物豐度增加。見圖6。

圖6 腸道菌群多樣性指數分析

2.6 對腸道菌群門水平的影響 各組大鼠腸道中的厚壁菌門（Firmicutes）、擬桿菌門（Bacteroidetes）相對豐度所占比例最高。與對照組相比，模型組大鼠腸道中厚壁菌門/擬桿菌門（Firmicutes/Bacteroidetes，F/B）比值發(fā)生改變，F/B比值升高（P<0.05），而經過干預后的大鼠逆轉了這一改變，F/B比值下降（P<0.05）。見圖7、圖8。

圖7 門（phylum）水平的物種分類分析

圖8 各組大鼠F/B比值比較

2.7 對腸道菌群屬水平的影響 與對照組相比，模型組大鼠腸道中擬桿菌屬（Bacteroides）、梭狀芽孢桿菌屬XⅧ（Clostridium XⅧ）、副擬桿菌（Parabacteroides）、霍爾德曼氏菌屬（Holdemania）、嗜膽菌屬（Bilophila）、螺桿菌（Helicobacter）等菌屬的相對豐度顯著增加（P<0.05），而普雷沃氏菌屬（Paraprevotella）、羅斯氏菌屬（Roseburia）、瘤胃球菌屬（Ruminococcus）、乳酸菌屬（Lactobacillus）等的相對豐度顯著降低（P<0.05）；而與模型組相比，治療組大鼠腸道中的Roseburia、Ruminococcus等的相對豐度增加（P<0.05），而Bacteroides、Clostridium XⅧ、毛螺旋菌屬（Lachnospira）、丁酸球菌屬（Butyricicoccus）、考拉桿菌屬（Phascolarctobacterium）、脫硫弧菌屬（Desulfovibrio）等的相對豐度降低（P<0.05）。見圖9。

圖9 腸道菌群屬（Genus）水平的差異分析

2.8 PICRUSt2預測結果 通過對比富集顯著的前50條KEGG通路發(fā)現，對照組與模型組之間共有18條通路存在富集差異（P<0.05），提示PCOS-IR大鼠腸道微生物異常與氨基糖代謝、檸檬酸循環(huán)、脂質代謝以及戊糖磷酸途徑等相關。治療組與模型組之間共有17條通路存在富集差異（P<0.05），經培補清利方干預后，大鼠的脂肪酸生物合成、檸檬酸循環(huán)、糖酵解等基因豐度下調。見圖10。

圖10 腸道微生物基因預測功能結果

3 討論

中醫(yī)治療PCOS-IR以補腎、健脾、清肝為主，佐以燥濕除痰、活血化瘀調經等，具有多靶點、多環(huán)節(jié)、多途徑、副作用小等優(yōu)勢［7］。培補清利方為《葉氏女科》中的蒼附導痰方化裁加減，其中的黃芪補氣養(yǎng)血；熟地黃入肝腎二經，既善補血滋陰，又能補精益髓；黃連清熱燥濕；蒲黃、丹參意在活血，使祛瘀活血而不傷正；陳皮、半夏健脾助運、燥濕化痰，調后天以資先天；香附疏通經絡、化解六郁，與補腎之品相配伍，使得補而不滯；甘草調和諸藥。諸藥合用，意在補腎健脾、化痰燥濕的同時活血通經。本研究中治療組大鼠卵巢組織明顯改善，囊性卵泡數目明顯減少，且卵巢質量明顯減輕，提示培補清利方可修復PCOS-IR大鼠卵巢組織的病理改變，主要表現在卵巢組織結構、形態(tài)、質量的改善。在PBG 120′后治療組大鼠血糖值與對照組接近，提示培補清利方可以使PCOS-IR大鼠的糖代謝異常表現得以改善。經培補清利方干預后的大鼠HOMA-IR、FINS水平下降，表明培補清利方能改善IR及PCOS相關表型。

近年來，腸道菌群作為一種新的生物學標志物在宿主新陳代謝中發(fā)揮至關重要的作用。腸道細菌如乳酸菌、羅伊氏乳桿菌通常被稱為有益菌，它們在防止致病性有害菌（腸球菌、螺門桿菌、變形桿菌）通過腸黏膜物理屏障進入全身循環(huán)進而危害機體中起著重要作用［8-10］。在PCOS疾病發(fā)生發(fā)展中以犧牲有益菌為代價而使有害菌的數量選擇性增加［11］。缺乏適當的菌群營養(yǎng)會使腸道相關菌群種類發(fā)生變化，導致內環(huán)境穩(wěn)態(tài)的改變［12］，進而對宿主產生有害影響。眾所周知，PCOS-IR與腸道菌群關系密切，PCOS-IR患者體內腸道微生物的結構明顯不同于正常女性［13-15］。有研究［16］表明，F/B比值與肥胖及炎癥因子呈正相關，F/B比值下降可能利于炎癥的改善。物種豐度和多樣性的變化可能導致PCOS腸道功能發(fā)生改變［17］。本研究發(fā)現，與對照組相比，模型組（PCOS-IR）大鼠腸道微生物區(qū)系差異顯著，在門水平上厚壁菌門、擬桿菌門數量發(fā)生改變，F/B比值升高。通過對腸道微生物群落的豐度和多樣性分析，發(fā)現經來曲唑誘導的PCOS-IR大鼠腸道微生物群落的總體豐度和多樣性明顯減少，而通過補充培補清利方可以改善這些變化，使腸道微生物豐度增加，F/B比值下降。本研究發(fā)現，PCOS-IR大鼠Bacteroides、Clostridium XⅧ、Bilophila等一些易引起炎癥、機會性感染的條件致病菌［18］的產量顯著增加，Roseburia、Lactobacillus、Butyricicoccus等一些增加黏蛋白、使腸上皮細胞免受炎癥損傷的保護性細菌［19］產量減少。上述提示腸道微生物失調與PCOS-IR關系密切，在PCOS-IR疾病發(fā)生過程中條件致病菌的數量增加，保護性細菌減少。隨著中藥復方培補清利方的干預，PCOS-IR大鼠的腸道微生物中Roseburia、Lactobacillus的相對豐度顯著增加，而Bacteroides、Lachnospira、Desulfovibrio的相對豐度顯著降低，故培補清利方可促成保護性細菌產量增加，削弱機會致病菌的產量，進而維持PCOS-IR大鼠腸道內菌群平衡。

腸道菌群從宿主發(fā)酵難消化的膳食成分中獲取營養(yǎng)，通過降解食物、分泌物質等產生如短鏈脂肪酸、色氨酸、膽汁酸等代謝產物，這些代謝產物通過不同途徑參與宿主體內細胞的基因表達、增殖、凋亡，在宿主新陳代謝過程中發(fā)揮至關重要的作用［20-21］。PCOS-IR與宿主體內腸道微生物的變化及代謝途徑的改變密切相關［22］。為了進一步探索培補清利方對PCOS-IR大鼠腸道菌群及代謝的影響，我們利用PICRUSt2預測腸道微生物群落功能。通過對比發(fā)現，PCOS-IR大鼠腸道微生物異常與氨基糖代謝、檸檬酸循環(huán)、脂質代謝以及戊糖磷酸途徑等相關。經培補清利方干預后，大鼠的脂肪酸生物合成、檸檬酸循環(huán)、糖酵解基因豐度下調。上述提示培補清利方可減少機會致病菌的數量，增加有益菌，改善異常的菌群結構，改善IR及PCOS表型，其機制可能與介導糖酵解途徑及三羧酸循環(huán)、降低脂質脂肪酸生物合成相關。