朱發(fā)偉，葉 合，樓招歡，李 靜，韓麗萍，黃建波，鄧張亦婷，吳瑾瑾

1.臺(tái)州市立醫(yī)院藥劑科（浙江 臺(tái)州 318000）；2.浙江醫(yī)院藥劑科（浙江 杭州 310013）；3.浙江中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院（浙江 杭州 311402）；4.浙江中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院（浙江 杭州 310053）

心腦血管疾病是當(dāng)前威脅人類健康最嚴(yán)重的疾病之一，其發(fā)病率和病死率不斷增高。以高脂血癥（hyperlipidaemia，HLP）為代表的脂質(zhì)代謝異常是心腦血管疾病的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。近年來，隨著人們生活水平的提高和飲食結(jié)構(gòu)的改變，HLP的患病率呈逐年遞增趨勢，已成為全球性公共衛(wèi)生事件之一［1］。據(jù)其臨床表現(xiàn)、體征和舌脈等特點(diǎn)，本病可歸屬于中醫(yī)學(xué)“痰濁”“濕熱”范疇，《黃帝內(nèi)經(jīng)》的“膏脂學(xué)說”是其理論依據(jù)，若膏脂輸化障礙，生成過剩，膏脂內(nèi)蓄則易形成病理性脂濁［2］。膏脂的輸化障礙主要責(zé)之于脾、肝、腎三臟，因脾失健運(yùn)、肝失疏泄、腎失氣化而發(fā)病，其中脾臟最為關(guān)鍵［3］。脾是水液代謝的樞紐，具有調(diào)節(jié)津液輸布和水液代謝的功能?，F(xiàn)代研究［4-5］發(fā)現(xiàn)，廣布于人體泌尿、消化、呼吸系統(tǒng)的水通道蛋白（AQPs）在人體水液轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝中起關(guān)鍵作用，脾主運(yùn)化水津功能與AQPs的表達(dá)呈正相關(guān)，調(diào)節(jié)AQPs的表達(dá)有助于促進(jìn)水液和脂質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝，減少“痰濕”和“脂濁”的形成，進(jìn)而阻斷高脂血癥的發(fā)生發(fā)展。

現(xiàn)有研究［6］表明，中醫(yī)藥在調(diào)節(jié)血脂、防治高脂血癥及相關(guān)疾病方面具有獨(dú)特的優(yōu)勢和巨大的應(yīng)用前景。荷葉（Nelumbinis Folium）為睡蓮科蓮屬多年生草本挺水植物蓮荷的葉，其味苦，歸肝、脾、胃經(jīng)，可清暑化濕，改善高脂血癥“痰濕”狀態(tài)，恢復(fù)脾的運(yùn)化功能，阻斷脂濁的形成和發(fā)展，是濕熱蘊(yùn)結(jié)型高脂血癥的常用中藥之一［7］。有研究［8］報(bào)道，荷葉水提物（LLE）能顯著降低昆明小鼠的三酰甘油（TG）水平。本課題組研究［9-10］發(fā)現(xiàn)，荷葉具有通過改善脂質(zhì)代謝拮抗非酒精性脂肪肝的作用，并可有效保護(hù)肝臟免受脂質(zhì)浸潤。本研究旨在進(jìn)一步觀察LLE對(duì)高脂飲食誘導(dǎo)的HLP大鼠模型TG以及AQPs的影響，闡釋荷葉升清降濁祛濕改善“痰濕”、防治高脂血癥的現(xiàn)代科學(xué)內(nèi)涵，以期拓展荷葉的臨床應(yīng)用，為心腦血管疾病的防治提供新思路，促進(jìn)相關(guān)產(chǎn)品研發(fā)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物 雄性SD大鼠，28只，體質(zhì)量（250±20）g，由上海西普爾-必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供。動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（浙）2018-0006。動(dòng)物飼養(yǎng)于浙江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。按照實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例，于室溫（23±2）℃、相對(duì)濕度45%～55%條件下飼養(yǎng)；人工光照，明、暗各12 h，自由進(jìn)食飲水。動(dòng)物于實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d。本動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方案經(jīng)浙江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物管理與倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（倫理批準(zhǔn)號(hào)：IACUC-20210726-07）。

1.1.2 藥物與試劑 荷葉飲片（Nelumbinis Folium），由浙江中醫(yī)藥大學(xué)中藥飲片有限公司提供（批號(hào)：210401），浙江中醫(yī)藥大學(xué)陳孔榮副教授鑒定為蓮Nelumbo nucifera Gaertn.的干燥葉。LLE：取適量荷葉藥材，加相當(dāng)于藥材質(zhì)量10倍的水，100 ℃回流提取1 h，重復(fù)兩次，過濾，合并濾液，減壓濃縮至1 g/mL，4 ℃貯存?zhèn)溆谩?/p>

依折麥布片（Ezetimibe，10 mg/片），杭州默沙東制藥有限公司生產(chǎn)（批號(hào)：J20171023），臨用前用純水配制成0.1 g/L的混懸液。

TG試劑盒，寧波美康生物科技有限公司（批號(hào)：190419101）；胃泌素（GAS）、胃動(dòng)素（MTL）試劑盒，江蘇科特生物科技有限公司（批號(hào)：09112784R、09112791R）。TRIzol試劑，美國Invitrogen公司（批號(hào)：15596018）；AQP3、AQP8、AQP9，美國Gene Tex公司（批號(hào)：GTX64481、GTX47929、GTX37783）；甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH），華安生物技術(shù)有限公司（批號(hào)：HG0718）。

高脂飼料，購自南通特洛菲飼料科技有限公司。

1.1.3 儀器 全自動(dòng)生化分析儀，日本Sysmex株式會(huì)社（型號(hào)：日立3100）；超微量核酸蛋白測定儀，德國耶拿公司（型號(hào)：scandrop100）；熒光定量PCR儀，德國耶拿公司（型號(hào)：qTOWER2.2）；高速冷凍離心機(jī)，美國Thermo Fisher Scientific公司（型號(hào)：Biofuge Stratos）。

1.2 分組與造模 SD大鼠常規(guī)飼養(yǎng)7 d后，稱定體質(zhì)量，大鼠隨機(jī)分4組，即正常組、模型組、依折麥布組、荷葉組，每組7只。除正常組外，其余各組給予高脂飼料，建立高脂血癥動(dòng)物模型［11-12］。

1.3 干預(yù) 依折麥布按人推薦日用量10 mg/d等效劑量換算；荷葉按《中華人民共和國藥典（2020年版）》［13］用量為3～10 g，結(jié)合前期實(shí)驗(yàn)取10 g/d等效劑量換算。在造模的同時(shí)給藥，正常組和模型組大鼠按10 mL/kg體質(zhì)量灌胃純水，其余兩組分別灌胃給予1.0×10-3g/kg依折麥布水溶液及1.0 g/kg 的LLE，每日1次，連續(xù)6周。實(shí)驗(yàn)期末，心臟采血，解剖，分取結(jié)腸組織備用。

1.4 檢測指標(biāo)與方法

1.4.1 血清TG水平 給藥6周后眼眶后靜脈叢采血約1 mL，置于1.5 mL離心管中，采血前禁食不禁水12 h。靜置1 h，4 ℃下，3 000 r/min，離心10 min，取上清液即血清。全自動(dòng)生化分析儀檢測大鼠血清血脂TG水平。

1.4.2 血清GAS、MTL水平 給藥6周后眼眶后靜脈叢采血約1 mL，置于1.5 mL離心管中，4 ℃ 5 000 r/min，離心15 min，取上清液。ELISA法檢測各樣本中GAS、MTL水平。

1.4.3 結(jié)腸中Na+-K+-ATP酶含量 給藥6周后，取適量結(jié)腸組織，置于預(yù)冷凍存管內(nèi)，加入無水乙醇，冰浴上勻漿1 min，轉(zhuǎn)移置預(yù)冷EP管中。4 ℃ 5 000 r/min離心15 min，取上清液。ELISA法檢測各樣本中Na+-K+-ATP酶含量。

1.4.4 結(jié)腸組織AQP3、AQP8、AQP9 mRNA表達(dá)水平采用RT-qPCR法檢測結(jié)腸組織AQP3、AQP8、AQP9 mRNA表達(dá)水平。取-80 ℃凍存的大鼠結(jié)腸組織，以TRIzol試劑提取結(jié)腸組織總RNA，逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系為20 μL，根據(jù)試劑說明書操作，按條件進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，反應(yīng)條件40 ℃，30～60 min；95 ℃，5 min。擴(kuò)增引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，引物序列見表1。PCR 反應(yīng)條件：95 ℃、5 min，95 ℃、15 s，60 ℃、30 s，40個(gè)循環(huán)。采用Melt曲線分析，以甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）的表達(dá)為內(nèi)參。每個(gè)樣品重復(fù)3次，擴(kuò)增結(jié)束，記錄Ct值，按照2-ΔΔCt公式計(jì)算目的基因mRNA的相對(duì)表達(dá)量。

表1 引物序列

1.4.5 肝組織病理學(xué)及脂質(zhì)沉積情況觀察 取各組大鼠肝臟左葉相同部位，部分置于液氮中，固定，冷凍切片機(jī)切片，油紅O染色后封片。部分肝臟置于4%多聚甲醛中固定，梯度乙醇脫水，石蠟包埋，切片，HE染色，光鏡下觀察肝臟脂質(zhì)沉積情況。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件分析。計(jì)量資料以±s表示，多重比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA），組間比較方差齊性用LSD方法檢驗(yàn)，方差不齊用Dunnett檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 對(duì)HLP模型大鼠血清TG的影響 與正常組比較，模型組SD大鼠血清TG水平升高，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。與模型組比較，依折麥布組、荷葉組能夠降低SD大鼠血清TG水平，但各組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。荷葉組降低TG水平的作用與依折麥布組相當(dāng)，兩組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見圖1。

圖1 各組大鼠血清TG水平比較

2.2 對(duì)HLP模型大鼠血清GAS、MTL水平的影響 與正常組比較，模型組大鼠血清GAS水平降低（P<0.05），MTL水平升高（P<0.05）。與模型組比較，荷葉組、依折麥布組能升高GAS水平（P<0.05），且能降低MTL水平（P<0.05）。與依折麥布組比較，荷葉組GAS相對(duì)較高，MTL水平相對(duì)較低，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見圖2。

圖2 各組大鼠血清GAS、MTL水平比較

2.3 對(duì)HLP模型大鼠Na+-K+-ATP酶含量的影響 與正常組比較，模型組大鼠Na+-K+-ATP酶含量降低（P<0.05）。與模型組比較，荷葉組、依折麥布組Na+-K+-ATP酶含量升高（P<0.05）。與依折麥布組比較，荷葉組Na+-K+-ATP酶含量相對(duì)較高，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見圖3。

圖3 各組大鼠Na+?K+?ATP酶含量比較

2.4 對(duì)HLP模型大鼠結(jié)腸組織AQP3、AQP8、AQP9 mRNA表達(dá)的影響 與正常組比較，模型組大鼠結(jié)腸組織AQP8、AQP9 mRNA表達(dá)增加（P<0.05），AQP3 mRNA表達(dá)水平有增加趨勢，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。與模型組比較，荷葉組、依折麥布組大鼠結(jié)腸組織AQP8、AQP9 mRNA表達(dá)顯著減少（P<0.05），AQP3 mRNA表達(dá)水平有降低趨勢，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。與依折麥布組比較，荷葉組AQP3、AQP8 mRNA表達(dá)相對(duì)較高（P<0.05）。見圖4。

圖4 各組大鼠AQP3、AQP8、AQP9 mRNA表達(dá)情況比較

2.5 對(duì)HLP模型大鼠肝臟脂質(zhì)沉積的影響 肝臟組織HE染色結(jié)果顯示：正常組大鼠肝細(xì)胞形態(tài)正常，以中央靜脈為中心呈放射狀排列；模型組大鼠肝臟中央靜脈周圍細(xì)胞呈空泡性改變，伴較多炎癥細(xì)胞浸潤；依折麥布組空泡樣變性及炎性浸潤較少；荷葉組大鼠肝細(xì)胞脂質(zhì)沉積和炎性浸潤有效改善。見圖5-Ⅰ。

油紅O染色結(jié)果：正常組大鼠肝細(xì)胞核藍(lán)染，未見橘紅色脂滴；模型組大鼠肝細(xì)胞脂滴明顯增多；依折麥布組及荷葉組大鼠肝細(xì)胞脂滴數(shù)量較模型組明顯減少。見圖5-Ⅱ。

圖5 各組大鼠肝組織病理情況

3 討論

本實(shí)驗(yàn)采用高脂飼料飼養(yǎng)復(fù)制HLP大鼠模型，在實(shí)驗(yàn)周期末，模型組大鼠血清TG水平明顯高于正常組，提示模型大鼠存在血脂代謝異?，F(xiàn)象；予以荷葉提取物干預(yù)后，模型大鼠血清TG水平降低，表明荷葉對(duì)高脂飲食誘導(dǎo)的高脂血癥具有一定的改善作用，該作用與依折麥布相當(dāng)。

高脂血癥在中醫(yī)學(xué)中歸屬于“痰濁”的范疇。痰是人體水液代謝紊亂所形成的病理產(chǎn)物?！豆沤襻t(yī)鑒》言：“痰屬濕，乃津液所化?！庇袑W(xué)者認(rèn)為，痰生百病，高脂血癥的形成亦與痰密切相關(guān)?！睹麽t(yī)雜著·風(fēng)癥》載：“故云痰遍身上下無處不到，蓋即津液之在周身者。津液生于脾胃，水谷所乘，濁則為痰，故痰生于脾土也。”現(xiàn)代人不遵四時(shí)，食飲無度，不忌生冷、油膩之物，導(dǎo)致痰濕內(nèi)生，中陽被遏，脾失健運(yùn)，水液停聚，聚而成痰飲，痰飲積聚，體內(nèi)精微物質(zhì)運(yùn)化失司，日久積聚脈道，遂為血濁，發(fā)為高脂血癥。高脂血癥外因多為飲食、六淫，病位主要在脾胃，病理產(chǎn)物為痰濕，臨床多從痰濕論治［14-15］。《素問·至真要大論》載：“諸濕腫滿，皆屬于脾?！薄端貑枴そ?jīng)脈別論》載：“脾氣散精，上歸于肺，通調(diào)水道，下輸膀胱，水精四布。”上述表明脾具有調(diào)節(jié)津液輸布和水液代謝的功能。

現(xiàn)代研究［15-16］發(fā)現(xiàn)，廣布于人體泌尿、消化、呼吸系統(tǒng)的AQPs在人體水液轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝中起關(guān)鍵作用，脾主運(yùn)化水津功能與AQPs的表達(dá)呈正相關(guān)，AQPs的正常表達(dá)是保障中醫(yī)脾主運(yùn)化功能的前提。AQPs是一類小分子、非親水、完整跨膜蛋白，包括AQP0-2、AQP4-6和AQP8等只滲透水的經(jīng)典水通道蛋白和AQP3、AQP7、AQP9-10等轉(zhuǎn)運(yùn)水、甘油及尿素等小分子的水-甘油通道蛋白［4-5］。AQP4、AQP8等經(jīng)典AQPs介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)水分子的轉(zhuǎn)運(yùn)，參與腸道水液代謝，其表達(dá)異?？芍履c道濕濁瘀滯，影響脾的運(yùn)化功能［16］；AQP9調(diào)節(jié)肝臟水和甘油的攝取，參與膽汁代謝及肝細(xì)胞內(nèi)TG和糖原的合成［17-18］；AQPs的異常表達(dá)可影響脂質(zhì)代謝異常，介導(dǎo)高脂血癥、脂肪肝等的形成［19］。研究［20-21］表明，下調(diào)高脂血癥大鼠結(jié)腸組織中AQP3、AQP8等mRNA的表達(dá)，能有效改善結(jié)腸因過度重吸收水液導(dǎo)致的水液停聚，減少痰濕的生成，消除高脂血癥的病因，阻斷高脂血癥的進(jìn)一步發(fā)展。荷葉具有升清降濁、祛濕利尿功效，文獻(xiàn)報(bào)道［8］及課題組前期研究［9］證實(shí)LLE具有調(diào)節(jié)血脂、改善脂肪肝的作用。本研究結(jié)果顯示，LLE能夠下調(diào)模型大鼠結(jié)腸組織AQP8、AQP9 mRNA表達(dá)，改善肝組織脂質(zhì)沉積，提示LLE可能通過調(diào)節(jié)腸道AQPs表達(dá)，改善水液代謝及濕濁形成，進(jìn)而阻斷高脂血癥的發(fā)生發(fā)展。

GAS是一種胃腸黏膜細(xì)胞分泌的胃腸激素，能促進(jìn)食道括約肌收縮，抑制小腸對(duì)水、鹽的吸收。MTL是消化道激素之一，可以刺激胃運(yùn)動(dòng)，促進(jìn)胃排空。有研究［22］表明，GAS和MTL分泌異常與脾虛證關(guān)系密切，調(diào)節(jié)GAS的正常分泌可以恢復(fù)中醫(yī)理論所講的脾主運(yùn)化、升清降濁的功能。血清GAS、MTL可以作為衡量健脾作用的藥理指標(biāo)［23］。本研究結(jié)果表明，高脂血癥模型大鼠GAS、MTL水平出現(xiàn)異常表達(dá)，說明高脂飲食可導(dǎo)致大鼠脾虛。LLE干預(yù)能有效恢復(fù)上述胃腸激素水平，提示LLE具有改善模型大鼠脾虛的功能。

Na+-K+-ATP酶為鑲嵌在腸道細(xì)胞質(zhì)磷脂雙分子層之間的一種調(diào)控Na+-K+跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)的蛋白質(zhì)，其在機(jī)體水液代謝、物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)、能量轉(zhuǎn)換等生理過程中發(fā)揮著重要作用。通過分解ATP獲得能量轉(zhuǎn)運(yùn)Na+、K+，促進(jìn)水液轉(zhuǎn)運(yùn)，維持胞內(nèi)外Na+、K+濃度梯度和水液平衡。研究［24］發(fā)現(xiàn)，脾虛狀態(tài)時(shí)，Na+-K+-ATP酶活性降低，使細(xì)胞內(nèi)外水液轉(zhuǎn)運(yùn)失衡，導(dǎo)致水濕停聚，促進(jìn)機(jī)體痰濕形成，進(jìn)而介導(dǎo)高脂血癥的發(fā)生發(fā)展。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，LLE能顯著升高模型大鼠Na+-K+-ATP酶活性，改善大鼠便溏現(xiàn)象，提示LLE可能通過調(diào)節(jié)Na+-K+-ATP酶介導(dǎo)的細(xì)胞水液代謝，改善高脂血癥痰濕狀態(tài)。LLE對(duì)GAS等胃腸激素水平及Na+-K+-ATP含量等脾主運(yùn)化相關(guān)指標(biāo)的改善作用整體趨勢上高于依折麥布，該作用可能為其優(yōu)勢特色之處。

綜上，LLE可能通過調(diào)節(jié)腸道AQPs表達(dá)水平及GAS、MTL、Na+-K+-ATP酶含量，改善水液和脂質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝，恢復(fù)高脂血癥模型大鼠脾主運(yùn)化功能，改善高脂血癥“痰濕”狀態(tài)，進(jìn)而減緩高脂血癥脂濁的形成和發(fā)展。