陶宇蝶孟丹晨黃美娟魏春梅趙秋燕周敏瞿素萍黃海泉

(1.西南林業(yè)大學(xué)園林園藝學(xué)院/國家林業(yè)和草原局西南風(fēng)景園林工程技術(shù)研究中心/云南省功能性花卉資源及產(chǎn)業(yè)化技術(shù)工程研究中心/西南林業(yè)大學(xué)園林園藝花卉研發(fā)中心，云南 昆明 650224；2.云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院花卉研究所，云南 昆明 650205)

花色是被子植物花器官的重要表型性狀之一，在提高植物抗逆性、吸引傳粉者、維持繁衍進(jìn)化基石等方面發(fā)揮著重要作用[1，2]。 花斑一般指在花瓣或花萼上位置、大小和形態(tài)基本固定的斑塊，是被子植物一個(gè)獨(dú)特的表型特征，是人工選擇創(chuàng)新、植物進(jìn)化和自然選擇的綜合結(jié)果，能極大地豐富植物的觀賞價(jià)值，是現(xiàn)代花卉業(yè)的重要研究領(lǐng)域[3]。 因此，揭示花斑形成的分子機(jī)理對花色改良具有重要意義[4，5]。

植物花斑的形成是由于花色素基因在花瓣或其他成花部位上差異表達(dá)，且調(diào)控基因可以調(diào)節(jié)花色素合成催化酶基因在不同區(qū)域的表達(dá)水平，進(jìn)而導(dǎo)致花斑的形成[6]。MYB基因作為植物中最龐大的一個(gè)基因家族，在花斑及色素形成、生長發(fā)育等過程中發(fā)揮著重要作用。 已在多種植物中發(fā)現(xiàn)調(diào)節(jié)花色素苷合成及與色斑形成相關(guān)的MYB 轉(zhuǎn)錄因子，且以R2R3 類型為主，也有單一R重復(fù)結(jié)構(gòu)的MYB 轉(zhuǎn)錄因子[7]。 如AtMYB75、At-MYB90、AtMYB113參與花青素的生物合成[8]；在蝴蝶蘭中，PeMYB2調(diào)控唇瓣的全紅著色，PeMYBI1調(diào)控唇瓣的紅色斑點(diǎn)，PeMYBI2調(diào)控唇瓣紋理的形成[9]；R2R3－MYB 轉(zhuǎn)錄因子LhMYB6、Lh-MYB12和LhMYB12－Lat分別在百合的凸起式斑點(diǎn)[10]、飛濺式斑點(diǎn)[11]和非斑區(qū)表達(dá)[12]；cjMYB1基因可能在紅色山茶品種的花色苷合成途徑中起關(guān)鍵作用[13]；FtMYB23提高了苦蕎原花青素的合成與積累[14]；在月季紅花突變體中，RhMYB基因正調(diào)控花青素的合成[15]。 劉盛雨[16]研究發(fā)現(xiàn)，MYB114轉(zhuǎn)錄因子可能在血橙果實(shí)成熟過程中介導(dǎo)藍(lán)光對多甲氧基黃酮和花青素的合成調(diào)控；Yao 等[17]提出PyMYB114與已報(bào)道的Py-MYB10有著色增強(qiáng)的效應(yīng)，并在草莓果實(shí)和煙草葉片中得到驗(yàn)證；趙英[18]提出SmMYB36的同源基因首次出現(xiàn)在洛磯山耬斗菜中， 過表達(dá)SmMYB36的轉(zhuǎn)基因材料可以提高丹參酮類物質(zhì)而抑制酚酸類物質(zhì)。 但關(guān)于MYB36基因調(diào)控花斑形成的相關(guān)研究尚未見報(bào)道。

滇水金鳳(Impatiens uliginosa)為中國特有的鳳仙花科鳳仙花屬一年或多年生草本植物，花色艷麗，以紅色為主，花形獨(dú)特，旗瓣圓形，花期長，具有較高的園林應(yīng)用價(jià)值[19]。 目前關(guān)于滇水金鳳的研究主要集中于種子萌發(fā)特性、花發(fā)育調(diào)控基因克隆、花色調(diào)控基因及金屬元素測定等方面[20－23]，尚未見關(guān)于其花斑的研究報(bào)道。 本研究從斑色系滇水金鳳花瓣中克隆得到IuMYB114和IuMYB36基因，并分析了其序列結(jié)構(gòu)、系統(tǒng)發(fā)育和表達(dá)模式，為研究滇水金鳳花斑形成的分子調(diào)控機(jī)理以及鳳仙花花色改良等提供一定的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試斑色系滇水金鳳于2020 年10 月取自昆明市尋甸縣清水海，于滇水金鳳盛花期采集樣品(圖1)，迅速放于液氮中，并帶回實(shí)驗(yàn)室保存于－80℃冰箱中備用。

圖1 斑色系滇水金鳳花器官

1.2 總RNA 的提取與IuMYB114 和IuMYB36 基因的克隆

以滇水金鳳整個(gè)花器官為試驗(yàn)材料，采用RNA 提取試劑盒(OMEGA)提取總RNA；RNA 逆轉(zhuǎn)錄采用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(北京全式金生物技術(shù)股份有限公司)，－20℃保存?zhèn)溆谩?根據(jù)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)設(shè)計(jì)擴(kuò)增全長的特異性引物(表1)。 以RNA 逆轉(zhuǎn)錄合成的cDNA 第一鏈作為模板進(jìn)行Iu-MYB114和IuMYB36基因全長cDNA 擴(kuò)增。 回收產(chǎn)物并進(jìn)行克隆，送上海生工生物工程有限公司測序。

表1 滇水金鳳MYB 基因cDNA 序列擴(kuò)增引物

1.3 滇水金鳳花斑IuMYB114 和IuMYB36 序列分析

采用ExPasy－ProtParam 在線軟件進(jìn)行基因編碼蛋白質(zhì)的基本理化性質(zhì)分析；運(yùn)用TMHMM 2.0 對蛋白進(jìn)行跨膜結(jié)構(gòu)域的預(yù)測分析；利用NCBI 的CDD 工具預(yù)測目的基因結(jié)構(gòu)域；運(yùn)用SMART 對蛋白結(jié)構(gòu)域進(jìn)行分析，蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)預(yù)測采用SOPMA 在線軟件進(jìn)行，蛋白質(zhì)的三級結(jié)構(gòu)預(yù)測采用SWISS－MODE 在線軟件進(jìn)行；運(yùn)用NCBI 中的Protein BLAST 工具尋找同源序列，借助NCBI BLAST、DNAMAN 和MEGA 11 進(jìn)行序列分析和系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建。

1.4 IuMYB114 和IuMYB36 基因的表達(dá)模式

按照前述方法分別提取滇水金鳳旗瓣斑區(qū)和非斑區(qū)2 個(gè)部位(圖1)的RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，設(shè)計(jì)qRT－PCR 引物(表2)，以滇水金鳳Actin1作為內(nèi)參基因，進(jìn)行qRT－PCR 試驗(yàn)。 每個(gè)樣本設(shè)置3 個(gè)生物學(xué)重復(fù)。 將非斑區(qū)的表達(dá)水平設(shè)為對照，與斑區(qū)的進(jìn)行比較。

表2 滇水金鳳MYB 基因qRT－PCR 擴(kuò)增相關(guān)引物序列

2 結(jié)果與分析

2.1 滇水金鳳IuMYB114 和IuMYB36 基因的克隆

通過PCR 擴(kuò)增，獲得IuMYB114與IuMYB36基因的cDNA 全長，分別為315 bp 和876 bp(圖2)，分別編碼104 個(gè)和151 個(gè)氨基酸。 對這兩個(gè)MYB基因的內(nèi)含子和外顯子進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)兩者均不具有內(nèi)含子。

圖2 IuMYB114 和IuMYB36 基因的PCR 擴(kuò)增

2.2 IuMYB114 和IuMYB36 基因的序列結(jié)構(gòu)分析

IuMYB114、IuMYB36 蛋白均為親水性不穩(wěn)定蛋白，均不具有跨膜結(jié)構(gòu)域，均屬于MYB 超家族蛋白成員(圖3、表3)。 預(yù)測目的基因結(jié)構(gòu)域發(fā)現(xiàn)IuMYB114具有MYB 轉(zhuǎn)錄因子典型的SANT 結(jié) 構(gòu)域，IuMYB36不具有保守結(jié)構(gòu)域(圖4)。

圖3 IuMYB114 (上)和IuMYB36 (下)基因的保守結(jié)構(gòu)域

表3 IuMYB114 和IuMYB36 基因編碼蛋白的理化性質(zhì)

圖4 IuMYB114 和IuMYB36 結(jié)構(gòu)域

2.3 IuMYB114 和IuMYB36 基因編碼蛋白的二、三級結(jié)構(gòu)預(yù)測

IuMYB114 和IuMYB36 蛋白的二級結(jié)構(gòu)均以無規(guī)則卷曲為主，說明其結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定。 蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果(圖5)顯示，IuMYB114 是以轉(zhuǎn)錄因子WER 為模型，屬于R2R3 型亞類成員，覆蓋率為53.19%，序列相似性為47%；IuMYB36 是以涂層蛋白為模型，覆蓋率為27.08%，序列相似性為33%。

圖5 IuMYB114 和IuMYB36 蛋白三級結(jié)構(gòu)預(yù)測

2.4 IuMYB114 和IuMYB36 的氨基酸序列同源性分析及系統(tǒng)進(jìn)化分析

分別將IuMYB114 和IuMYB36 的氨基酸序列與其它植物的氨基酸序列進(jìn)行對比，結(jié)果(圖6)顯示，IuMYB114 與芝麻(XP＿011100166.1)、歐洲李(XP＿034208044.1)等物種的MYB 同源性較高，同源性均達(dá)64%左右；IuMYB36 與常綠越橘(KAH7854734.1)、黃芩(AKA59789.1)和藍(lán)果樹(KAA8518714.1)等的同源性較高，同源性均在50%左右。 通過構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，發(fā)現(xiàn)IuMYB114和IuMYB36 均分別與各自的同源序列聚在一起，各處在兩個(gè)分支，與IuMYB114 親緣關(guān)系最近的是旱金蓮，而與IuMYB36 親緣關(guān)系最近的是除蟲菊(圖7)。

圖6 IuMYB114(A)和IuMYB36(B)的同源氨基酸序列比對

圖7 基于IuMYB114 和IuMYB36 氨基酸序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹

2.5 IuMYB114 和IuMYB36 基因在滇水金鳳旗瓣中的表達(dá)模式分析

通過對兩個(gè)基因在滇水金鳳旗瓣不同部位的表達(dá)分析(圖8)發(fā)現(xiàn)，IuMYB114與IuMYB36在斑區(qū)和非斑區(qū)均有表達(dá)，但斑區(qū)表達(dá)量顯著高于非斑區(qū)，分別為非斑區(qū)的12.83 倍和9.88 倍，與轉(zhuǎn)錄組分析結(jié)果相符。 推測IuMYB114 和IuMYB36 可能在盛花期存在一定的正調(diào)控作用從而使花斑顯現(xiàn)；另外，兩個(gè)基因的表達(dá)模式和表達(dá)量相似，推測兩者在斑區(qū)具有一定的協(xié)同作用。

圖8 IuMYB114 和IuMYB36 基因在滇水金鳳旗瓣2 個(gè)部位的表達(dá)分析

3 討論與結(jié)論

MYB 轉(zhuǎn)錄因子集特異性和多樣性于一體，在花色素中發(fā)揮著重要作用，是花斑形成的關(guān)鍵基因。 最早從玉米中克隆出第一個(gè)調(diào)節(jié)花色素合成的單一型MYB基因——C1基因[24]，隨后從巨峰葡萄中克隆出VlMYBA基因，能誘導(dǎo)葡萄果實(shí)上紅紫色斑點(diǎn)的產(chǎn)生[25]。 近幾年，關(guān)于MYB 轉(zhuǎn)錄因子組織表達(dá)特異性導(dǎo)致花斑出現(xiàn)的機(jī)理逐漸成為研究熱點(diǎn)，但未見其在滇水金鳳花斑形成中作用的相關(guān)研究報(bào)道。

本研究成功從滇水金鳳花器官中克隆得到2個(gè)cDNA 全長分別為315 bp 和876 bp、分別編碼104 個(gè)和151 個(gè)氨基酸的MYB基因，命名為Iu-MYB114和IuMYB36。 經(jīng)生物信息學(xué)分析，Iu-MYB114和IuMYB36均沒有內(nèi)含子，這與從蓖麻莖稈中克隆的RcMYB114[26]、從丹參中克隆的SmMYB36[27]分析結(jié)果一致，且二者均屬于親水不穩(wěn)定蛋白，二級結(jié)構(gòu)均以不穩(wěn)定的無規(guī)則卷曲為主；IuMYB114 三級結(jié)構(gòu)以轉(zhuǎn)錄因子WER 為模型，屬于R2R3 型亞類，且具有典型的MYB 轉(zhuǎn)錄因子SANT 結(jié)構(gòu)域，這與在甘藍(lán)型油菜中克隆的RFBnMYB114的分析結(jié)果一致[28]；IuMYB36不具有保守結(jié)構(gòu)域，與丹參SmMYB36基因[27]的分析結(jié)果一致，推測其屬于新的R2R3－MYB 轉(zhuǎn)錄因子亞組[29]。 同源性分析發(fā)現(xiàn)，滇水金鳳的Iu-MYB114 與芝麻(Sesamum indicum) 和 歐洲李(Prunus dulcis)等的MYB 同源性均達(dá)64%左右，IuMYB36 與常綠越橘(Vaccinium darrowii)、黃芩(Scutellaria playfairii)等的MYB 同源性均達(dá)50%左右；系統(tǒng)進(jìn)化分析發(fā)現(xiàn)IuMYB114 和IuMYB36各處在兩個(gè)分支。

植物花斑的出現(xiàn)主要依賴花青素在時(shí)間和空間上的受限沉積，由于MYB基因是調(diào)節(jié)花青素合成和積累的關(guān)鍵因子，研究MYB基因?qū)ò咝纬傻淖饔镁哂兄匾饬x。 研究表明，在牡丹中R2R3－MYB 轉(zhuǎn)錄因子PsMYB12 協(xié)同WD40 和bHLH 轉(zhuǎn)錄因子，共同調(diào)控牡丹花瓣底部花斑的形成[30]；文心蘭中得到的OgMYB1基因通過控制OgCHI和OgDFR兩個(gè)結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)進(jìn)而調(diào)控花斑的形成[31]；外源αMYB基因?qū)χ袊苫ㄉ剀沾x途徑產(chǎn)生了影響，且誘導(dǎo)了結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)，使其花瓣發(fā)生了顏色的變化[32]；PcMYB114是導(dǎo)致梨果皮紅色突變的關(guān)鍵基因[33]；AT-MYB114作為激活劑參與了擬南芥中原花青素、類黃酮或花青素的生物合成[34]；PyMYB114與PybHLH3、PyERF3之間相互作用形成調(diào)控復(fù)合體，促進(jìn)梨果實(shí)花青素的積累[35]；MdMYB114是蘋果花青素生物合成和運(yùn)輸?shù)姆e極調(diào)節(jié)因子[36]。結(jié)合以往研究，推測IuMYB114可能與滇水金鳳的花色苷生物合成有關(guān)。 另外，有研究表明，CsMYB36可以調(diào)節(jié)黃瓜的黃綠色果皮著色[37]；SlMYB36－1基因過表達(dá)后對番茄根系內(nèi)皮層凱氏帶形成具有影響[38]；MYB36控制擬南芥?zhèn)雀吔纾瑥亩{(diào)控根從增殖到分化的轉(zhuǎn)變[39，40]。本研究發(fā)現(xiàn)IuMYB114和IuMYB36在滇水金鳳旗瓣斑區(qū)和非斑區(qū)均有表達(dá)，但在斑區(qū)的表達(dá)量顯著高于非斑區(qū)，這與MYB114L在‘鳳丹’牡丹花色變化過程中的表達(dá)分析結(jié)果[41]一致。 推測Iu-MYB114可能在滇水金鳳盛花期的斑區(qū)中起一定的正調(diào)控作用，而IuMYB36可能在斑區(qū)顏色形成中發(fā)揮著一種新功能，從而對花斑的形成具有一定調(diào)控作用；因二者表達(dá)模式和表達(dá)量相似，推測它們具有一定的協(xié)同作用，但具體功能尚有待進(jìn)一步試驗(yàn)驗(yàn)證。

本研究結(jié)果可為后續(xù)進(jìn)行IuMYB114和Iu-MYB36基因的功能研究、探究其對滇水金鳳花斑形成的調(diào)控機(jī)制以及鳳仙花花色改良等提供一定的理論依據(jù)。