袁永興，高建建，逯蕾，胡茜，王靖

西安國(guó)際醫(yī)學(xué)中心醫(yī)院婦科一病區(qū)，陜西 西安 710100

陰道是由女性特殊解剖結(jié)構(gòu)、陰道菌群、內(nèi)分泌環(huán)境、局部免疫等組成的重要的微生態(tài)系統(tǒng)之一，其微生態(tài)穩(wěn)態(tài)對(duì)維持陰道自凈作用、維護(hù)女性生殖健康具有重要意義[1]。對(duì)于子宮切除術(shù)患者而言，手術(shù)本身可直接損壞陰道微生態(tài)解剖結(jié)構(gòu)，而術(shù)前、術(shù)后抗生素使用可殺滅陰道正常微生物，加之術(shù)后腹水經(jīng)陰道殘端溢出、陰道積血或滲液排出不暢等原因，使得陰道酸性環(huán)境發(fā)生改變，這些均能導(dǎo)致陰道微生態(tài)嚴(yán)重破壞，繼而增加患者陰道感染風(fēng)險(xiǎn)，引發(fā)多種婦科疾病[2-3]。Toll 樣受體(TLR)是一類在機(jī)體固有免疫中扮演重要角色的模式識(shí)別受體，其信號(hào)通路異常表達(dá)對(duì)炎癥反應(yīng)發(fā)生進(jìn)展具有重要意義，被認(rèn)為與感染性疾病關(guān)聯(lián)密切[4]。輔助性T 細(xì)胞(Th 細(xì)胞)在人體細(xì)胞免疫中起重要作用，可通過(guò)影響局部自然殺傷細(xì)胞活性、T淋巴細(xì)胞應(yīng)答能力等影響女性生殖道清除病原體能力[5]。已有研究表明，陰道微生態(tài)變化與機(jī)體免疫功能可相互影響[6]。基于以上研究背景，本研究通過(guò)探究子宮切除術(shù)后患者陰道微生態(tài)變化與外周血Toll樣受體2(TLR2)、Toll樣受體4(TLR4)表達(dá)及細(xì)胞免疫炎癥因子的關(guān)系，旨在進(jìn)一步加深對(duì)陰道微生態(tài)失衡機(jī)制的認(rèn)識(shí)，從而為臨床針對(duì)性防治提供新思路。

1 資料與方法

1.1 一般資料 通過(guò)方便抽樣法選取2021 年1~12 月西安國(guó)際醫(yī)學(xué)中心醫(yī)院收治的95 例行子宮切除術(shù)患者為研究對(duì)象。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)均為腹腔鏡下全子宮切除術(shù)患者；(2)術(shù)前1個(gè)月內(nèi)無(wú)抗生素、微生態(tài)制劑、口服避孕藥使用；(3)術(shù)前3 個(gè)月內(nèi)無(wú)糖皮質(zhì)激素、免疫抑制劑等應(yīng)用；(4)術(shù)前均使用甲硝唑行陰道準(zhǔn)備，術(shù)后均連續(xù)使用抗菌藥物5~7 d；(5)精神正常。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)合并全身感染性疾病、免疫性疾病、惡性腫瘤、重要臟器功能不全者；(2)絕經(jīng)期女性；(3)無(wú)法取得檢查、研究配合；(4)糖尿病患者；(5)精神病史。95 例患者年齡36~56 歲，平均(43.14±6.78)歲；體質(zhì)量指數(shù)19.5~28.9 kg/m2，平均(23.68±3.15) kg/m2；原發(fā)疾?。鹤訉m肌瘤36 例，子宮腺肌癥28 例，功能性子宮出血15 例，重度宮頸病變10 例，重度子宮內(nèi)膜病變6 例。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)，所有患者均簽署知情同意書(shū)。

1.2 方法

1.2.1 陰道微生態(tài)檢測(cè)及定義[7]于術(shù)前、術(shù)后1周，采用無(wú)菌長(zhǎng)棉簽采集陰道側(cè)壁上1/3處陰道分泌物標(biāo)本送檢，主要檢測(cè)內(nèi)容：(1)陰道pH 值：采用精密pH 試紙直接測(cè)定陰道分泌物pH 值，pH 值≤4.5、>4.5分別視為正常、異常升高；(2)菌群密度：陰道分泌物涂片，干燥、固定，革蘭染色后于油鏡下(放大倍數(shù)10×100)觀察陰道菌群，各視野平均細(xì)菌數(shù)1~9 個(gè)、10~99 個(gè)、100個(gè)及以上(光鏡下細(xì)菌滿視野)、細(xì)菌聚集成團(tuán)或?qū)つど掀ぜ?xì)胞密集覆蓋分別分為Ⅰ級(jí)、Ⅱ級(jí)、Ⅲ級(jí)、Ⅳ級(jí)；(3)菌群多樣性：涂片中可辨別細(xì)菌1~3種、4~6種、7~9 種、10 種及以上分別分為Ⅰ級(jí)、Ⅱ級(jí)、Ⅲ級(jí)、Ⅳ級(jí)；(4)乳桿菌數(shù)量：計(jì)數(shù)以油鏡下各視野乳桿菌平均數(shù)為準(zhǔn)，未見(jiàn)乳桿菌或僅1~5 個(gè)/Hp、6~15個(gè)/Hp、16~30個(gè)/Hp、>30 個(gè)/Hp 分別分為Ⅰ級(jí)、Ⅱ級(jí)、Ⅲ級(jí)、Ⅳ級(jí)。正常陰道微生態(tài)定義：陰道pH值3.8~4.5，陰道菌群密度Ⅱ級(jí)或Ⅲ級(jí)，菌群多樣性Ⅱ級(jí)或Ⅲ級(jí)，優(yōu)勢(shì)菌為乳桿菌(即菌群中乳桿菌密度最大)。陰道微生態(tài)失衡：不符合上述正常定義中任意一條均視為微生態(tài)失衡。

1.2.2 TLR2、TLR4 表達(dá) 于術(shù)前、術(shù)后1 周，采集患者空腹靜脈血標(biāo)本5 mL，以3 000 r/min、離心半徑10 cm 離心10 min，留取血清于-80℃下保存?zhèn)溆茫徊捎妹芏忍荻入x心法分離外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)，采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)TLR2、TLR4 在CD14+細(xì)胞表面表達(dá)百分率；熒光標(biāo)記抗體FITC-抗人CD14 單抗、APC-抗人TLR2單抗、PE-抗人TLR4單抗均出自美國(guó)eBioscience 公司，檢測(cè)儀器為美國(guó)Beckman Coulter公司CytoFLEX LX型流式細(xì)胞儀。

1.2.3 細(xì)胞免疫炎癥因子 取上述血清標(biāo)本解凍后，采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法檢測(cè)Th1、Th2細(xì)胞因子水平，主要包括白介素-2 (IL-2)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白介素-4(IL-4)、白介素-10(IL-10)，試劑盒均出自美國(guó)BioVision公司。

1.3 觀察指標(biāo) (1)對(duì)比患者手術(shù)前后陰道微生態(tài)變化，統(tǒng)計(jì)陰道微生態(tài)失衡率；(2)比較手術(shù)前后失衡組與正常組TLR2、TLR4 及細(xì)胞免疫炎癥因子表達(dá)；(3)分析術(shù)后陰道微生態(tài)與TLR2、TLR4 及細(xì)胞免疫炎癥因子相關(guān)性。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS17.0 統(tǒng)計(jì)軟件分析數(shù)據(jù)。計(jì)數(shù)資料比較行χ2檢驗(yàn)，等級(jí)資料行秩和檢驗(yàn)；計(jì)量資料呈正態(tài)分布，均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，組間比較行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；采用Spearman 相關(guān)分析法分析陰道微生態(tài)與TLR2、TLR4 及細(xì)胞免疫炎癥因子的相關(guān)性；繪制受試者工作特征曲線(ROC)評(píng)估TLR2、TLR4及細(xì)胞免疫炎癥因子對(duì)陰道微生態(tài)失衡的預(yù)測(cè)價(jià)值。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 患者手術(shù)前后的陰道微生態(tài)比較 術(shù)后1周，患者的陰道pH 值、菌群密度、菌群多樣性、乳桿菌數(shù)量分級(jí)與術(shù)前比較差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；術(shù)后陰道微生態(tài)失衡率73.68%，明顯高于術(shù)前的44.21%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表1。

表1 95例患者手術(shù)前后的陰道微生態(tài)比較[例(%)]Table 1 Comparison of vaginal microecology in 95 patients before and after surgery[n(%)]

2.2 失衡組與正常組患者手術(shù)前后的TLR2、TLR4表達(dá)比較 術(shù)前，失衡組與正常組外周血TLR2、TLR4表達(dá)水平比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；術(shù)后1周，失衡組外周血TLR2、TLR4表達(dá)水平明顯高于術(shù)前及正常組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表2。

表2 失衡組與正常組患者的TLR2、TLR4表達(dá)水平比較(±s，%)Table 2 Comparison of expression levels of TLR2 and TLR4 between imbalance group and normal group(±s,%)

表2 失衡組與正常組患者的TLR2、TLR4表達(dá)水平比較(±s，%)Table 2 Comparison of expression levels of TLR2 and TLR4 between imbalance group and normal group(±s,%)

注：與本組術(shù)前比較，aP<0.05。Note:Compared with the value in the same group before surgery,aP<0.05.

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2.3 失衡組與正常組患者手術(shù)前后的細(xì)胞免疫炎癥因子比較 術(shù)前，失衡組與正常組患者的血清IL-2、TNF-α、IL-4、IL-10水平比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；術(shù)后1周，失衡組患者的血清IL-2、TNF-α水平明顯高于術(shù)前及正常組，IL-4、IL-10水平明顯低于術(shù)前及正常組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表3。

表3 失衡組與正常組患者手術(shù)前后的血清IL-2、TNF-α、IL-4、IL-10水平比較(±s，pg/mL)Table 3 Comparison of serum levels of IL-2, TNF-α, IL-4, and IL-10 between imbalance group and normal group before and after surgery(±s,pg/mL)

表3 失衡組與正常組患者手術(shù)前后的血清IL-2、TNF-α、IL-4、IL-10水平比較(±s，pg/mL)Table 3 Comparison of serum levels of IL-2, TNF-α, IL-4, and IL-10 between imbalance group and normal group before and after surgery(±s,pg/mL)

注：與本組術(shù)前比較，aP<0.05。Note:Compared with the value in the same group before surgery,aP<0.05.

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2.4 術(shù)后陰道微生態(tài)與TLR2、TLR4及細(xì)胞免疫炎癥因子的相關(guān)性 經(jīng)Spearman 相關(guān)分析法分析結(jié)果顯示，陰道pH 值與TLR4、IL-2、TNF-α表達(dá)呈正相關(guān)(P<0.05)；菌群密度、菌群多樣性與TLR2、TLR4、IL-2、TNF-α表達(dá)均呈正相關(guān)(P<0.05)，與IL-4、IL-10均呈負(fù)相關(guān)(P<0.05)；乳桿菌與TLR2、TLR4、IL-2、TNF-α表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(P<0.05)，見(jiàn)表4。

表4 術(shù)后陰道微生態(tài)與TLR2、TLR4及細(xì)胞免疫炎癥因子的相關(guān)性(r值)Table 4 Correlation between postoperative vaginal microecology and TLR2,TLR4 and cellular immune inflammatory factors(r)

2.5 TLR2、TLR4 及炎癥因子對(duì)陰道微生態(tài)失衡的預(yù)測(cè)價(jià)值 以是否診斷陰道微生態(tài)失衡為狀態(tài)變量，以外周血TLR2、TLR4 表達(dá)水平及血清IL-2、TNF-α、IL-4、IL-10 水平為檢驗(yàn)變量繪制ROC 曲線，結(jié)果顯示，TLR2、TLR4、IL-2、TNF-α、IL-4、IL-10 診斷陰道微生態(tài)失衡的ROC 曲線下面積分別為0.729、0.842、0.830、0.741、0.812、0.715 (P<0.05)。見(jiàn)圖1 和表5。

圖1 TLR2、TLR4及炎癥因子診斷陰道微生態(tài)失衡的ROCFigure 1 ROC of TLR2, TLR4 and inflammatory factors in the diagnosis of vaginal microecological imbalance

表5 TLR2、TLR4及炎癥因子對(duì)陰道微生態(tài)失衡的診斷效能Table 5 Diagnostic efficiency of TLR2,TLR4 and inflammatory factors on vaginal microecological imbalance

3 討論

3.1 子宮切除術(shù)后陰道微生態(tài)失衡率升高 本研究結(jié)果顯示，術(shù)后1 周，患者陰道pH 值>4.5 比例明顯升高，菌群密度、菌群多樣性、乳桿菌數(shù)量分級(jí)均下降，陰道微生態(tài)失衡率顯著高于術(shù)前，提示子宮切除術(shù)可加重陰道微生態(tài)破壞。分析原因，正常情況下，乳桿菌是陰道優(yōu)勢(shì)菌群，可通過(guò)釋放大量乳酸維持陰道偏酸性環(huán)境，其pH 值一般不超過(guò)4.5[8]。除乳桿菌外，陰道正常菌群中還包括棒狀感覺(jué)、大腸桿菌、類桿菌、梭桿菌、腸球菌、加德納菌、表皮葡萄球菌等細(xì)菌，維持著一定的菌群密度和多樣性，不過(guò)其中95%左右為兼性和專性厭氧菌，這些細(xì)菌可通過(guò)自身黏附機(jī)制同陰道上皮細(xì)胞受體結(jié)合，并于陰道壁黏膜表面生長(zhǎng)，這對(duì)參與宿主營(yíng)養(yǎng)轉(zhuǎn)化、調(diào)節(jié)免疫力、抑制外來(lái)病原菌生長(zhǎng)、維持生殖健康等具有重要意義[9]。對(duì)行子宮切除術(shù)患者而言，為降低圍生期感染風(fēng)險(xiǎn)，術(shù)前會(huì)行陰道擦洗換藥，術(shù)后會(huì)常規(guī)預(yù)防性使用抗生素，這會(huì)導(dǎo)致陰道乳桿菌數(shù)量減少甚至消失，而且術(shù)后早期活動(dòng)下降、陰道滲出液或積血難以順利排出，可一定程度上中和陰道酸度，這些因素使得患者術(shù)后陰道pH無(wú)法維持在4.5以內(nèi)；此外，手術(shù)創(chuàng)傷、麻醉刺激、術(shù)后免疫紊亂等等均不利于早期乳桿菌數(shù)量及菌群密度、多樣性恢復(fù)，因此本研究患者術(shù)后陰道pH值>4.5比例升高，而菌群密度、菌群多樣性、乳桿菌數(shù)量分級(jí)均下降，陰道失衡率大大升高。李辭妹等[10]研究顯示，全子宮切除術(shù)后患者乳桿菌數(shù)量、陰道pH 值、菌群多樣性、菌群密集度分級(jí)均明顯下降，而給予乳桿菌干預(yù)能促進(jìn)陰道微生態(tài)恢復(fù)，這與本研究有相似之處。

3.2 陰道微生態(tài)失衡與TLR2、TLR4表達(dá)呈正相關(guān) TLRs作為機(jī)體感知包括細(xì)菌、病毒、真菌等多種病原體入侵的膜受體家族，在機(jī)體固有免疫中扮演重要角色，由TLRs 介導(dǎo)的免疫炎癥反應(yīng)與女性生殖系統(tǒng)多種炎癥性疾病關(guān)聯(lián)密切[11]，而陰道微生態(tài)在女性生殖系統(tǒng)相關(guān)疾病發(fā)生、進(jìn)展全程中也起重要作用[12]，因此TLRs表達(dá)可能與女性陰道微生態(tài)有關(guān)。本文結(jié)果顯示，陰道微生態(tài)失衡組外周血TLR2、TLR4表達(dá)百分率較術(shù)前明顯升高，且高于正常組，提示TLR2、TLR4異常升高可能參與陰道微生態(tài)失衡發(fā)生。TLR2、TLR4是TLRs家族最具代表性成員，其中TLR2可識(shí)別的特異性配體最為廣泛，其外源性配體主要包括革蘭陽(yáng)性菌及其細(xì)胞壁肽聚糖、脂磷壁酸等成分，TLR4是最早發(fā)現(xiàn)也是當(dāng)前研究最多的TLR，其外源性配體主要為革蘭陰性菌脂多糖[13]。研究發(fā)現(xiàn)，孕婦微生態(tài)失衡率較正常育齡女性明顯升高，且孕婦陰道灌洗液TLR2 表達(dá)明顯高于正常育齡女性[14]；還有研究指出，血清TLR2 在宮頸癌繼發(fā)陰道感染者表達(dá)明顯升高，檢測(cè)其水平對(duì)陰道感染具有較高診斷價(jià)值[15]；上述研究也提示TLR2異常表達(dá)可能與女性陰道微生態(tài)失衡或陰道感染有關(guān)。文獻(xiàn)顯示[16]，無(wú)癥狀白假絲酵母菌攜帶者、有癥狀陰道念珠菌感染者內(nèi)皮細(xì)胞TLR4 表達(dá)水平明顯高于健康受試者；還有報(bào)道認(rèn)為，乳桿菌可通過(guò)下調(diào)TLR4 mRNA 和蛋白表達(dá)，降低陰道炎癥反應(yīng)；上述研究均提示，TLR4 與陰道微生態(tài)變化有關(guān)[17]。故陰道微生態(tài)失衡組TLR2、TLR4 表達(dá)升高。本研究相關(guān)性分析顯示，陰道pH 值與TLR4、呈正相關(guān)，菌群密度、菌群多樣性與TLR2、TLR4均呈正相關(guān)，乳桿菌與TLR2、TLR4呈負(fù)相關(guān)，進(jìn)一步證實(shí)子宮切除術(shù)后患者陰道微生態(tài)與TLRs 表達(dá)有關(guān)。此外，ROC曲線結(jié)果顯示，TLR2、TLR4診斷陰道微生態(tài)失衡的ROC曲線下面積分別為0.729、0.842，提示檢測(cè)TLR2、TLR4 對(duì)子宮切除術(shù)后患者陰道微生態(tài)失衡有一定預(yù)測(cè)價(jià)值。

3.3 陰道微生態(tài)與細(xì)胞免疫炎癥因子有相關(guān)性 Th1 細(xì)胞主要通過(guò)介導(dǎo)和刺激細(xì)胞免疫、細(xì)胞毒性T細(xì)胞等，參與對(duì)抗細(xì)胞內(nèi)細(xì)菌及原蟲(chóng)的免疫反應(yīng)；Th2 細(xì)胞則主要介導(dǎo)B 細(xì)胞增殖抗體生成，刺激體液免疫，正常情況下，Th1/Th2 細(xì)胞處于動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)，Th1/Th2 平衡失調(diào)與多種婦產(chǎn)科疾病有關(guān)[18]。IL-2、TNF-α是Th1 細(xì)胞的代表細(xì)胞因子，IL-4、IL-10 為T(mén)h2細(xì)胞的代表細(xì)胞因子，本文結(jié)果顯示，失衡組術(shù)后血清IL-2、TNF-α水平較術(shù)前及正常組顯著升高，而IL-4、IL-10 水平顯著降低，提示細(xì)胞免疫炎癥因子表達(dá)失衡可能與陰道微生態(tài)失衡有關(guān)。研究認(rèn)為[19]，陰道微生態(tài)菌群可參與宿主細(xì)胞免疫、體液免疫形成，當(dāng)陰道益生菌相對(duì)豐度下降、致病菌相對(duì)豐度升高時(shí)，陰道可出現(xiàn)Th1/Th2免疫平衡紊亂，使得陰道屏障功能減弱，進(jìn)而增加陰道感染風(fēng)險(xiǎn)。行相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，陰道pH值與IL-2、TNF-α呈正相關(guān)，菌群密度、菌群多樣性與IL-2、TNF-α表達(dá)均呈正相關(guān)，與IL-4、IL-10 均呈負(fù)相關(guān)，乳桿菌與IL-2、TNF-α呈負(fù)相關(guān)，進(jìn)一步證實(shí)子宮切除術(shù)后患者陰道微生態(tài)與細(xì)胞免疫炎癥因子有關(guān)。林雪珊等[20]研究發(fā)現(xiàn)，先兆流產(chǎn)患者陰道微生態(tài)與Th1/Th2 細(xì)胞因子有關(guān)，與本研究相似。此外，本研究發(fā)現(xiàn)，IL-2、TNF-α、IL-4、IL-10診斷陰道微生態(tài)失衡的ROC 曲線下面積分別為0.830、0.741、0.812、0.715，提示檢測(cè)細(xì)胞免疫炎癥因子對(duì)子宮切除術(shù)后患者陰道微生態(tài)失衡有一定預(yù)測(cè)價(jià)值。

結(jié)合本文結(jié)果可有以下提示：一，應(yīng)重視子宮切除術(shù)后患者陰道微生態(tài)平衡評(píng)估和調(diào)節(jié)；二，TLR2、TLR4 表達(dá)及Th1/Th2 免疫失衡靶向調(diào)節(jié)或許在陰道微生態(tài)失衡改善乃至相關(guān)婦科炎癥疾病治療中有應(yīng)用前景，當(dāng)然這有待于更多研究給予證實(shí)。

綜上所述，子宮切除術(shù)后患者陰道pH、菌群密度、多樣性、乳桿菌等微生態(tài)均發(fā)生改變，陰道微生態(tài)失衡率升高，且與患者TLR2、TLR4 及細(xì)胞免疫炎癥因子表達(dá)有關(guān)。