畢彩云，韓碧潔

西安市北方醫(yī)院婦科，陜西 西安 710000

乳腺癌是一種上皮性惡性腫瘤，已成為婦女身心健康的重大威脅[1-5]。目前，乳腺癌多通過手術(shù)、放療、化療、生物治療、靶向治療等方法治療，但5 年總生存期仍較差[2-7]。因此，尋找新的治療策略，提高臨床患者的生存率尤為重要，中藥治療在腫瘤的治療中有改善患者生存質(zhì)量、延長患者生存期、降低轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)率等優(yōu)勢，因此已成為乳腺癌重要的治療手段。

野鳶尾黃素是一種O-甲基化異黃酮，具有雌激素、抗炎和抗腫瘤等生物活性[8-14]。它的抗腫瘤作用在乳腺癌中未見有報道，因此，本研究旨在探索野鳶尾黃素對人乳腺癌細(xì)胞MCF7的細(xì)胞增殖、遷移、侵襲能力的影響及其可能的機制。

1 材料與方法

1.1 材料 人乳腺癌細(xì)胞MCF7 購自中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會細(xì)胞庫；FBS、RPMI-1640培養(yǎng)基、青鏈霉素、胰酶均購自Hyclone 公司；野鳶尾黃素購自美國MCE 公司；Transwell 小室購自美國Corning公司；β-catenin 抗體及p-GSK-3β-ser9 抗體購自美國Abcam公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 人乳腺癌細(xì)胞MCF7 采用RPMI-1640+10%FBS+1%青鏈霉素培養(yǎng)基于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞融合度達到80%~90%進行傳代及實驗。

1.2.2 CCK-8 實驗檢測細(xì)胞活力 實驗設(shè)定為五組，取處于對數(shù)生長期，生長狀態(tài)良好的MCF7細(xì)胞用RPMI-1640培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞密度到5×103個/100 μL，以每孔100 μL細(xì)胞懸液加入96 孔板，37℃培養(yǎng)過夜；貼壁后加入不同濃度(0 μmol/L、20 μmol/L、40 μmol/L、80 μmol/L、160 μmol/L)的野鳶尾黃素處理48 h[8]，每空加入10 μL CCK-8 孵育30~60 min 并于酶標(biāo)儀450 nm處測定其吸光度，計算不同處理組MCF7 細(xì)胞的細(xì)胞的增殖率。

1.2.3 細(xì)胞分組與給藥方法 根據(jù)上述CCK-8實驗結(jié)果，根據(jù)IC50(半抑制濃度)將實驗分為對照組和低劑量組、高劑量組?？瞻讓φ战M不加任何藥物；低、高劑量實驗組分別加入40 μmol/L和80 μmol/L 野鳶尾黃素處理48 h。

1.2.4 細(xì)胞侵襲 制備濃度為2×104/mL 的各組人乳腺癌細(xì)胞MCF7 無血清細(xì)胞懸液。24 孔板底部加800 μL RPMI-1640完全培養(yǎng)基，Transwell小室上室底部中央垂直加入100 μL 1 mg/mL 的Matrigel，待Matrigel干成膠狀后在Transwell上室分別加入200 μL各組細(xì)胞懸液，5%CO2、37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h。取出Transwell 小室，磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗一側(cè)未侵襲細(xì)胞，并用10%甲醇溶液固定30 min。切下膜并在膜上滴1 滴5%結(jié)晶紫染液，靜置染色20 min，PBS 清洗后于顯微鏡下觀察拍照。實驗重復(fù)3次。

1.2.5 細(xì)胞劃痕實驗 Marker筆在6孔板背后劃線，將人乳腺癌細(xì)胞MCF7單細(xì)胞懸液，按每孔2×105個細(xì)胞均勻的接種到6 孔板中，5% CO2、37℃培養(yǎng)過夜。第二天用槍頭比著直尺，盡量垂至于背后的橫線劃痕。然后用PBS清洗掉劃下的細(xì)胞，加入無血清培養(yǎng)基、拍照。緊接著將培養(yǎng)板放入37℃、5%CO2培養(yǎng)箱，培養(yǎng)，24 h 后拍照，計算遷移距離。

1.2.6 免疫印跡實驗檢測β-catenin的表達 各組人乳腺癌MCF7 細(xì)胞經(jīng)冰凍PBS 洗滌，在蛋白裂解緩沖液中提取，用Bradford法測定蛋白濃度后，變性并電泳分離。電泳后，蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到PVDF膜并于4℃過夜孵育一抗β-catenin(1：200)及p-GSK-3β-ser9(1：150)。洗滌后，孵育二抗1 h，并用ECL化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)觀察信號，計算目的蛋白相對于GAPDH的表達量。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS20.0 軟件對各處理組進行統(tǒng)計分析。計量資料以均值±標(biāo)準(zhǔn)差(x-±s)表示，使用單因素方差分析(One-way ANVOA)對低劑量實驗組、高劑量實驗組及對照組侵襲、遷移、蛋白相對表達量等數(shù)據(jù)進行分析，不同處理間平均值的差異性顯著性用Tukey's HSD test 分析。以P<0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 野鳶尾黃素對MCF7細(xì)胞活性的影響 CCK-8檢測野鳶尾黃素處理的MCF7細(xì)胞活性，結(jié)果顯示，野鳶尾黃素處理48 h后空白對照組及處理組(20 μmol/L、40 μmol/L、80 μmol/L、160 μmol/L)細(xì)胞活力分別為(100±4.00)%、(70.6±3.68)%、(62.9±2.60)%、(32.2±6.25)%、(19.8±6.58)%，與對照組比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，且具有濃度依賴性，如圖1 所示。這提示野鳶尾黃素可抑制MCF7 細(xì)胞的增殖，基于野鳶尾黃素濃度為80 μmol/L 時，細(xì)胞的增殖能力為其半數(shù)，因此在后續(xù)的實驗中采用40 μmol/L、80 μmol/L進行實驗。

圖1 CCK-8法檢測MCF7細(xì)胞的活力Figure 1 MCF7 cell viability was detected by CCK-8

2.2 野鳶尾黃素對MCF7細(xì)胞侵襲的影響 Transwell實驗結(jié)果顯示，對照組、低劑量處理組和高劑量處理組侵襲的細(xì)胞數(shù)量分別為(130±3.33)個、(96±3.33)個和(66±2.66)個，與對照組比較，處理組細(xì)胞的侵襲能力均下降，且差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)，與低劑量組比較，高劑量組細(xì)胞侵襲能力下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，見圖2。

圖2 Transwell檢測鳶尾黃素對MCF7細(xì)胞侵襲的影響Figure 2 Effect of tectorigenin on the invasion of MCF7 cells by Transwell invasion assay

2.3 野鳶尾黃素對MCF7細(xì)胞遷移的影響 細(xì)胞劃痕結(jié)果顯示對照組、低劑量組、高劑量組24 h 的遷移的距離分別為(392±7.32) μm、(272±17.45) μm 和(92±5.36)μm，與對照組比較，處理組細(xì)胞的遷移能力均下降，與低劑量組比較，高劑量組細(xì)胞遷移能力下降，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01或P<0.001)，見圖3。

圖3 細(xì)胞劃痕檢測野鳶尾黃素對細(xì)胞遷移能力的影響Figure 3 Cell migration was detected by cell scratch assay

2.4 野鳶尾黃素對MCF7 細(xì)胞β-catenin 蛋白及p-GSK-3β-ser9 的影響 Western Blotting 實驗檢測三組β-catenin 及p-GSK-3β-ser9 蛋白的表達，對照組、低劑量組、高劑量組β-catenin 蛋白相對于GAPDH的表達量分別為0.567±0.06、0.312±0.06 及0.243±0.05；p-GSK-3β-ser9 蛋白相對于GAPDH 的表達量分別為0.501±0.06、0.236±0.04、0.166±0.03。與對照組比較，低劑量及高劑量組細(xì)胞的β-catenin 及p-GSK-3β-ser9 蛋白表達均下降，與低劑量組比較，高劑量組細(xì)胞的β-catenin及p-GSK-3β-ser9蛋白表達均下降，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01 或P<0.001)，見圖4。

圖4 WB檢測野鳶尾黃素對MCF7細(xì)胞β-catenin及p-GSK-3β-ser9蛋白的影響Figure 4 Effect of tectorigenin on β-catenin and p-GSK-3β-ser9 of MCF7 cells was detected by western blot

3 討論

乳腺癌是對女性健康和生命威脅最大的惡性腫瘤之一，雖然手術(shù)、放療、化療等傳統(tǒng)的治療策略在一定程度上提高了乳腺癌患者早期的總生存率，但是腫瘤的耐藥、復(fù)發(fā)、侵襲、轉(zhuǎn)移、抗輻射等惡性表型特征使其致死率居高不下[1-5]。

植物雌激素是一類從植物中提取的多酚類化合物，其結(jié)構(gòu)與內(nèi)源性雌激素相似，已被證實具有多種生物活性。其以長期使用的安全性和可忽略/不存在副作用為特點，被認(rèn)為是傳統(tǒng)化療的佐劑，亦被證明可以對抑制多種癌癥的生長、侵襲和轉(zhuǎn)移[15-17]。野鳶尾黃素是一種植物雌激素，具有抗炎、抗腫瘤的特性，如Yang 等[18]研究結(jié)果表明紫葛根花中提取的一種異黃酮類化合物野鳶尾黃素增強了紫杉醇對MPSC1(TR)、A2780(TR)和SKOV3(TR)等紫杉醇耐藥卵巢癌細(xì)胞的生長抑制作用。研究結(jié)果表明，以野鳶尾黃素為主要活性成分的葛根提取物對卵巢癌細(xì)胞具有較高雌激素生物效價和較強的細(xì)胞毒性作用[19-20]。另外，野鳶尾黃素可抑制激素反應(yīng)性前列腺癌細(xì)胞的增殖，導(dǎo)致G1 期阻滯中p21 (WAF1)或p27kip1 蛋 白 表 達，并 下 調(diào)PDEF、PSA、hTERT 和IGF-1 受體基因表達[21-22]。這些研究結(jié)果提示植物雌激素野鳶尾黃素在激素應(yīng)答性乳腺癌中可能有一定的作用。因此，本研究檢測了野鳶尾黃素對人乳腺癌MCF7 細(xì)胞的作用，結(jié)果顯示隨著野鳶尾黃素濃度依賴性的抑制MCF7細(xì)胞的增殖。

腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移與侵襲是腫瘤的重要特征，同時也是導(dǎo)致腫瘤致死率高的重要原因，本研究細(xì)胞劃痕及Transwell 實驗結(jié)果顯示40 μmol/L 及80 μmol/L 的野鳶尾黃素可顯著抑制MCF7 細(xì)胞的侵襲及遷移。另外，多項研究表明Wnt/β-Catenin信號通路在腫瘤的侵襲遷移等重要進程中發(fā)揮不可或缺的調(diào)控作用，β-Catenin 作為Wnt/β-Catenin 信號通路的核心分子[15-17]，其表達水平與乳腺癌患者的預(yù)后呈負(fù)相關(guān)，其表達越高，表明預(yù)后越差。GSK3β是Wnt/β-catenin 信號通路的負(fù)調(diào)控因子，位于β-catenin 的上游，抑制β-catenin的過度激活，而GSK-3β-Ser9磷酸化時，β-catenin 受到保護，從而在細(xì)胞質(zhì)中逐漸積累[23]。本研究檢測了野鳶尾黃素處理的MCF7細(xì)胞β-catenin及p-GSK-3β-Ser9 的表達水平，結(jié)果表明，野鳶尾黃素可抑制β-catenin及p-GSK-3β-Ser9的表達，即野鳶尾黃素可能通過調(diào)節(jié)p-GSK-3β-Ser9 的表達從而抑制β-Catenin蛋白的表達。

總之，野鳶尾黃素可能通過調(diào)節(jié)Wnt/GSK-3β/β-catenin 通路從而抑制MCF7 細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移，為野鳶尾黃素在乳腺癌中的應(yīng)用提供了理論支持。