尹佳琦，盧 軍，劉佰林，馬小強(qiáng)

缺血性腦血管病(ischemia cerebral vascular disease，ICVD)指由于相應(yīng)腦組織的缺血、缺氧而引起的短暫或持續(xù)、局部或彌漫性的腦組織損傷，導(dǎo)致一系列神經(jīng)功能障礙癥狀或體征的腦血管病的總稱[1-6]。而腦缺血再灌注損傷(cerebral ischemia reperfusion injury，CIRI)是缺血性腦血管病的重要病理過程。血腦屏障(blood brain barrier，BBB)是腦組織和腦循環(huán)之間的生理屏障，滋養(yǎng)腦組織，過濾從大腦到血液的各種物質(zhì)，保護(hù)中樞神經(jīng)系統(tǒng)的穩(wěn)定，而CIRI早期可損傷血腦屏障，降低CIRI導(dǎo)致的血腦屏障損傷，對(duì)于CIRI的治療有著重大意義[7-8]。本研究觀察活血通絡(luò)方對(duì)大鼠腦缺血再灌注后腦組織緊密連接蛋白1(ZO-1)、閉合蛋白(occludin)、基質(zhì)金屬蛋白酶-2(MMP-2)、水通道蛋白4(AQP4)含量的影響，從調(diào)節(jié)血腦屏障結(jié)構(gòu)和功能方向探討活血通絡(luò)方改善CIRI的可能調(diào)節(jié)機(jī)制及潛在作用靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)儀器與試劑 DR-200Bs酶標(biāo)儀(Diatek公司)；DYY-6C電泳儀、DYCZ-400D轉(zhuǎn)移電泳儀槽(北京市六一儀器廠)；TGL-16c臺(tái)式離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠)；Eclipse Ci-L正置熒光拍照顯微鏡(Nikon)；UPK-1-10T超純水機(jī)(UPK-1-10T)；RM2016病理切片機(jī)(上海徠卡儀器有限公司)；WD-9405脫色搖床(北京市六一儀器廠)；移液槍(Dragon)；二喹啉甲酸法(BCA)蛋白質(zhì)濃度測(cè)定試劑盒(貨號(hào)：AS1086)；增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光試劑(ECL)化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒(貨號(hào)：AS1059)；聚偏二氟乙烯(PVDF)膜(貨號(hào)：IPVH00010)；MicroPublisher成像系統(tǒng)(Q-IMAGING)；ZO-1(貨號(hào)：sc-33725)；閉合蛋白(貨號(hào)：ab167161)；MMP-2(貨號(hào)：ab86607)；AQP4(貨號(hào)：16473-1-AP)；辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記山羊抗兔甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)(貨號(hào)：AS-1107)；HRP標(biāo)記山羊抗小鼠GAPDH(貨號(hào)：AS-1106)。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物 活血通絡(luò)方由懷牛膝、石決明、天麻、鉤藤、龍齒、白芍、黃芪、太子參、丹參、玄參等藥物組成。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 清潔SD雄性大鼠50只，體質(zhì)量180～220 g，許可證號(hào)：SCXK(新)2003-0001，由新疆實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 實(shí)驗(yàn)分組 將50只大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、陽性對(duì)照組、活血通絡(luò)方低劑量組、活血通絡(luò)方高劑量組，每組10只。假手術(shù)組和模型組連續(xù)2周給予生理鹽水10 mg/(kg·d)灌胃；陽性對(duì)照組給予尼莫地平混懸液9.375 mg/(kg·d)灌胃，連續(xù)2周；活血通絡(luò)方低劑量組給予活血通絡(luò)方水體液6.25 g/(kg·d)灌胃，連續(xù)2周；活血通絡(luò)方高劑量組給予活血通絡(luò)方水體液25 g/(kg·d)灌胃，連續(xù)2周。

1.4.2 動(dòng)物模型制備 用水合氯醛400 mg/kg腹膜內(nèi)注射麻醉大鼠，頸部正中切開表皮，暴露右側(cè)頸總動(dòng)脈，小心地暴露頸外動(dòng)脈和頸內(nèi)動(dòng)脈，并將其與鄰近的神經(jīng)分開。將尼龍絲引入動(dòng)脈切開孔，向遠(yuǎn)端送入頸內(nèi)動(dòng)脈，并從頸動(dòng)脈分叉處推進(jìn)18～20 mm。缺血2 h后，輕輕取出尼龍絲。假手術(shù)組進(jìn)行相同的麻醉和創(chuàng)口縫合，但不閉塞腦中動(dòng)脈。所有動(dòng)物均由同一操作員在相同條件下操作。

1.4.3 神經(jīng)功能評(píng)分 采用 Zea-Longa 評(píng)分法進(jìn)行評(píng)分，具體評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)詳見表1。

表1 Zea-Longa神經(jīng)功能損傷評(píng)分表

1.4.4 蛋白免疫印跡法 配制10 %分離膠，加水封30 min，注意膠中不能有氣泡，膠已凝固，吸棄水封，加入4%的濃縮膠，立即插入樣品梳。電泳80 V 30 min后轉(zhuǎn)為120 V 40 min。 將切好的 PVDF膜置于甲醇溶液中浸泡，然后與膠置于夾子中后放入轉(zhuǎn)移槽中。外敷冰降溫。120 V轉(zhuǎn)膜2 h。移至 4 %脫脂奶粉封閉液，室溫封閉1 h。分別加入上述指標(biāo)一抗(1∶1 000)孵育過夜，同時(shí)以 GAPDH 作為內(nèi)參照。TBST洗滌液洗膜，室溫 10 min，重復(fù)3次。孵育二抗，室溫 1 h，TBST洗滌液洗膜，室溫 10 min，重復(fù)3次；ECL發(fā)光液進(jìn)行化學(xué)發(fā)光反應(yīng)。

1.4.5 免疫組化 抗原修復(fù)，磷酸緩沖鹽溶液(PBS)浸泡 5 min，3%過氧化氫孵育15～20 min；添加試劑血清封閉 20 min 后去血清，用一抗孵育，37 ℃、4 ℃過夜；PBS洗滌3 min，重復(fù)3次；室溫下用二抗孵育20 min；PBS洗滌3次，每次3 min；室溫下試劑 C孵育20 min；PBS洗滌3 min，重復(fù)3次；用顯色劑顯色；自來水沖洗后用中性樹膠封片。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠神經(jīng)功能評(píng)分比較 與假手術(shù)組比較，模型組、活血通絡(luò)方低劑量組、活血通絡(luò)方高劑量組、陽性對(duì)照組神經(jīng)功能評(píng)分均明顯升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與模型組比較，活血通絡(luò)方低劑量組、活血通絡(luò)方高劑量組、陽性對(duì)照組神經(jīng)功能評(píng)分均明顯降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與活血通絡(luò)方低劑量組比較，活血通絡(luò)方高劑量組和陽性對(duì)照組神經(jīng)功能評(píng)分均明顯降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；活血通絡(luò)方高劑量組與陽性對(duì)照組神經(jīng)功能評(píng)分比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。詳見表2。

表2 各組大鼠神經(jīng)功能評(píng)分比較(±s) 單位：分

2.2 各組大鼠腦組織ZO-1蛋白和閉合蛋白表達(dá)比較 與假手術(shù)組相比，模型組、活血通絡(luò)方低劑量組、活血通絡(luò)方高劑量組、陽性對(duì)照組ZO-1蛋白和閉合蛋白表達(dá)均明顯降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與模型組相比，活血通絡(luò)方高劑量組、活血通絡(luò)方低劑量組及陽性對(duì)照組ZO-1蛋白和閉合蛋白表達(dá)均明顯升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與活血通絡(luò)方低劑量組相比，活血通絡(luò)方高劑量組與陽性對(duì)照組ZO-1蛋白和閉合蛋白表達(dá)均明顯升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；活血通絡(luò)方高劑量組ZO-1蛋白和閉合蛋白表達(dá)與陽性對(duì)照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。詳見圖1及表3。

圖1 各組大鼠腦組織ZO-1蛋白和閉合蛋白表達(dá)條帶圖

表3 各組大鼠腦組織ZO-1蛋白和閉合蛋白表達(dá)比較(±s)

2.3 各組大鼠腦組織MMP-2、AQP4表達(dá)比較 與假手術(shù)組相比，模型組、活血通絡(luò)方低劑量組、活血通絡(luò)方高劑量組、陽性對(duì)照組MMP-2、AQP4表達(dá)水平均明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與模型組相比，活血通絡(luò)方高劑量組、活血通絡(luò)方低劑量組及陽性對(duì)照組MMP-2、AQP4表達(dá)水平均明顯減少，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與活血通絡(luò)方低劑量組相比，活血通絡(luò)方高劑量組與陽性對(duì)照組MMP-2、AQP4表達(dá)水平均明顯減少，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；活血通絡(luò)方高劑量組MMP-2、AQP4表達(dá)水平與陽性對(duì)照組比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。詳見表4。

表4 各組大鼠腦組織MMP-2、AQP4表達(dá)比較(±s)

3 討 論

腦缺血再灌注會(huì)引起腦損傷，導(dǎo)致腦水腫、腦出血和神經(jīng)元死亡，包括興奮性氨基酸毒性、能量代謝障礙、細(xì)胞內(nèi)鈣超載、炎癥反應(yīng)、細(xì)胞凋亡等多種機(jī)制，是一個(gè)復(fù)雜的病理過程[9]。

血腦屏障破壞可導(dǎo)致離子失調(diào)、水腫和神經(jīng)炎癥，從而導(dǎo)致神經(jīng)元功能障礙、顱內(nèi)壓升高和神經(jīng)元變性，是CIRI的重要病理階段[10]。血腦屏障功能障礙通常與腦水腫有關(guān)，嚴(yán)重時(shí)甚至導(dǎo)致腦出血，這是CIRI后腦水腫重要的病理改變[11]。因此，改善CIRI導(dǎo)致的血腦屏障損傷，對(duì)缺血性腦血管疾病的治療有著重大意義。本研究探討活血通絡(luò)方對(duì)CIRI大鼠保護(hù)作用的影響，從對(duì)血腦屏障結(jié)構(gòu)和功能的調(diào)節(jié)作用研究活血通絡(luò)方對(duì)CIRI影響的可能機(jī)制。

緊密連接由多個(gè)蛋白組成的細(xì)胞黏附，這些蛋白通過其細(xì)胞外成分直接相互作用，將兩個(gè)細(xì)胞膜連接在一起，包括跨膜蛋白(閉合蛋白、緊密連接蛋白、連接黏附分子)、胞質(zhì)附著蛋白[ZO-1、緊密連接蛋白2(ZO-2)和緊密連接蛋白3(ZO-3)]和細(xì)胞骨架蛋白等組成部分。CIRI中緊密連接位置的異常、表達(dá)數(shù)量對(duì)血腦屏障通透性及神經(jīng)功能影響重大[12]。有研究通過觀察腦CIRI大鼠模型血腦屏障通透性及ZO-1、 閉合蛋白與緊密連接蛋白5的異常表達(dá)和分布發(fā)現(xiàn)，CIRI可能導(dǎo)致緊密連接蛋白的結(jié)構(gòu)和功能的變化，從而導(dǎo)致血腦屏障通透性異常[13]。本研究結(jié)果顯示，與假手術(shù)組相比，模型組、活血通絡(luò)方低劑量組、活血通絡(luò)方高劑量組、陽性對(duì)照組ZO-1蛋白和閉合蛋白表達(dá)均明顯降低(P<0.05)；與模型組相比，活血通絡(luò)方低劑量組、活血通絡(luò)方高劑量組、陽性對(duì)照組ZO-1蛋白和閉合蛋白表達(dá)均明顯升高(P<0.05)；與活血通絡(luò)方低劑量組相比，活血通絡(luò)方高劑量組與陽性對(duì)照組ZO-1蛋白和閉合蛋白表達(dá)均明顯減少(P<0.05)，表明活血通絡(luò)方可能通過上調(diào)ZO-1和閉合蛋白的表達(dá)，加強(qiáng)細(xì)胞間的連接，從而保持血腦屏障的穩(wěn)定性，避免CIRI后導(dǎo)致的腦組織的二次損傷。

CIRI可以激活基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMPs)，MMPs 是一組可以降解多種細(xì)胞外基質(zhì)成分的鋅依賴的蛋白水解酶，在組織形態(tài)發(fā)生、細(xì)胞遷移和血管生成等過程中發(fā)揮作用，參與大腦和血腦屏障的許多生理和病理過程[14-16]。有研究發(fā)現(xiàn)，MMP-2的活性受到抑制后可阻礙細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)的降解，從而導(dǎo)致細(xì)胞外膠原纖維的聚集[17]。CIRI中發(fā)現(xiàn)血腦屏障和緊密連接蛋白的破壞，而抑制MMPs可以防止緊密連接蛋白的丟失，表明MMPs通過降解緊密連接蛋白來破壞屏障的完整性[18]。本研究結(jié)果顯示，與假手術(shù)組相比，模型組及各用藥組MMP-2水平均明顯升高；而與模型組相比，各用藥組MMP-2水平均明顯降低；與活血通絡(luò)方低劑量組相比，活血通絡(luò)方高劑量組與陽性對(duì)照組MMP-2水平均明顯降低，表明活血通絡(luò)方可能通過下調(diào)MMP-2表達(dá)水平，降低對(duì)緊密連接蛋白等基質(zhì)蛋白的降解，保護(hù)血腦屏障的功能。

AQP4廣泛存在于中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)，具有不同于其他水通道蛋白的特征，是藥物發(fā)現(xiàn)的有吸引力的靶標(biāo)，與腦水腫的發(fā)生密切相關(guān)，AQP4在神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)，在主要血管和腦組織之間的邊界高表達(dá)，參與維持腦穩(wěn)態(tài)，并可能是調(diào)節(jié)滲透壓的關(guān)鍵因素[19-20]，當(dāng) AQP4異常表達(dá)時(shí)，血腦屏障通透性會(huì)發(fā)生明顯改變，導(dǎo)致腦水腫的發(fā)生[21-24]。本研究結(jié)果顯示，與假手術(shù)組相比，模型組及各用藥組AQP4水平均明顯升高；與模型組相比，各用藥組AQP4水平均明顯降低；與活血通絡(luò)方低劑量組相比，活血通絡(luò)方高劑量組與陽性對(duì)照組AQP4水平均明顯降低。表明活血通絡(luò)方可能通過下調(diào)AQP4表達(dá)水平，抑制腦水腫的發(fā)展，保護(hù)血腦屏障的功能。

綜上所述，活血通絡(luò)方可改善大鼠CIRI，其機(jī)制可能是通過上調(diào)ZO-1、閉合蛋白和下調(diào)MMP-2、AQP4，從而調(diào)節(jié)血腦屏障結(jié)構(gòu)和功能，發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。