許瓊冠，歐陽(yáng)一彬，謝鎮(zhèn)明

術(shù)后認(rèn)知功能障礙(POCD)是全身麻醉后影響中樞神經(jīng)系統(tǒng)的常見并發(fā)癥之一。POCD可延長(zhǎng)術(shù)后的恢復(fù)時(shí)間，并長(zhǎng)期影響病人的生活質(zhì)量。60歲以上病人POCD發(fā)生率較高，嚴(yán)重影響了老年病人的生活能力和生活質(zhì)量[1]。有研究表明，年齡增加、大手術(shù)、心肌梗死史、酒精依賴史、既往存在認(rèn)知功能障礙為POCD的獨(dú)立危險(xiǎn)因素[2]。雖然POCD發(fā)病機(jī)制尚未明確，先前研究表明，炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激、蛋白表達(dá)變化、細(xì)胞凋亡和中樞膽堿能系統(tǒng)的退化可能是POCD發(fā)病的因素[3-4]。迫切需要了解導(dǎo)致POCD的潛在機(jī)制，并找到有效的方法保護(hù)術(shù)后認(rèn)知功能。酪氨酸激酶2(JAK2)/轉(zhuǎn)錄激活因子3(STAT3)通路參與較多生理過程，包括炎癥、增殖、分化和發(fā)育[5]，可能有助于驅(qū)動(dòng)暴露于細(xì)胞因子后神經(jīng)元的存活反應(yīng)。有研究證實(shí)，JAK2/STAT3通路參與了短暫性局灶性腦缺血后的抗凋亡過程[6]。阿爾茨海默病動(dòng)物模型中，激活JAK2/STAT3通路改善了空間學(xué)習(xí)和記憶功能[7]。MicroRNA(miRNA)是一類短鏈非編碼RNA，通過mRNA降解或翻譯在抑制靶基因表達(dá)中發(fā)揮關(guān)鍵作用。目前，在哺乳動(dòng)物的腦組織中發(fā)現(xiàn)了大量的miRNA，其與腦組織發(fā)育、神經(jīng)元分化和高級(jí)神經(jīng)功能(如學(xué)習(xí)和記憶)有關(guān)[8]，同時(shí)與神經(jīng)退行性疾病、精神障礙和腦腫瘤等疾病有關(guān)[9]。相關(guān)研究顯示，在阿爾茨海默病和帕金森病中，miRNA參與調(diào)節(jié)神經(jīng)元細(xì)胞周期控制和凋亡[10]，同時(shí)參與調(diào)節(jié)缺血后腦損傷的病理過程[11]。miR-433位于12號(hào)染色體上，有研究顯示，miR-433在缺氧條件下可調(diào)節(jié)神經(jīng)元的增殖和遷移[12]，提示miR-433在調(diào)節(jié)神經(jīng)細(xì)胞生物學(xué)功能方面具有重要作用。miR-433在POCD的神經(jīng)發(fā)病機(jī)制中的作用尚未明確。本研究探討miR-433和JAK2/STAT3信號(hào)通路在大鼠術(shù)后認(rèn)知障礙中的確切作用和相關(guān)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)試劑與儀器 SYBR Premix Ex Taq試劑盒(北京優(yōu)尼康生物科技有限公司)；PrimeScript RT Reagent Kit試劑盒、miRcute miRNA cDNA第一鏈合成試劑盒[寶日醫(yī)生物技術(shù)(北京)有限公司]；原位末端凋亡(TUNEL)染色試劑盒(Roche公司)；ABI 7500聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(qPCR)系統(tǒng)(Applied Biosystems公司)；BX51顯微鏡(奧林巴斯公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 8周齡雄性SD大鼠，體質(zhì)量500～600 g，飼養(yǎng)于動(dòng)物房中(由海南醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供)，溫度為22～24 ℃，濕度為55%～65%，光照/黑暗周期為12 h，并提供食物和水。所有實(shí)驗(yàn)方案和程序均獲得醫(yī)院動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.3 POCD大鼠模型的建立和實(shí)驗(yàn)分組 將大鼠隨機(jī)分為Control組、POCD組、POCD+NC mimic組、POCD+miR-433 mimic組。術(shù)前禁食12 h，大鼠吸入異氟醚(1.5%～2.0%)麻醉，進(jìn)行氣管插管和機(jī)械通氣。整個(gè)手術(shù)過程中暴露在21%O2、79%N2和1.5%～2.0%異氟醚的混合物中進(jìn)行麻醉。消毒后，在劍突下緣垂直切開3 cm，解剖左肝葉。探查左肝葉并與根部結(jié)扎，隨后切除。使用0.25%布比卡因浸潤(rùn)切口，3-0縫線縫合。待大鼠恢復(fù)意識(shí)后，將其送回到動(dòng)物房。一旦建立大鼠POCD模型，POCD+NC mimic組、POCD+miR-433 mimic組、POCD+miR-433 mimic+Vector組和POCD+miR-433 mimic+pcDNA-JAK2組大鼠分別通過腦室注射將總體積為 2 μL的NC mimic、miR-433 mimic及Vector、pcDNA-JAK2慢病毒注射到海馬中。Control組和POCD組大鼠未接受病毒載體。

1.4 方法

1.4.1 莫里斯水迷宮實(shí)驗(yàn)(Morris) 使用Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)評(píng)估認(rèn)知功能。于損傷后5～8 d進(jìn)行，訓(xùn)練持續(xù)4 d，每日5次實(shí)驗(yàn)。迷宮由一個(gè)不銹鋼圓形水池(直徑120 cm，高50 cm)組成，將水池分為4個(gè)象限，在西南象限的中央放置一個(gè)透明的有機(jī)玻璃平臺(tái)。將大鼠從4個(gè)象限中的一個(gè)放入水中自由游泳，探索迷宮，直至找到平臺(tái)。若大鼠在60 s內(nèi)找不到平臺(tái)，將其放置在平臺(tái)上休息10 s。第5天，移除平臺(tái)，將大鼠從東北象限放入水中，讓其游泳60 s，記錄大鼠逃避潛伏期、穿越平臺(tái)次數(shù)。

1.4.2 蘇木精-伊紅(HE)染色 使用35 mg/kg戊巴比妥鈉麻醉大鼠，解剖大鼠分離腦組織樣本。將腦組織置入4%多聚甲醛中固定24 h，進(jìn)行常規(guī)石蠟包埋。將組織切成厚度為5 μm的連續(xù)冠狀切片，之后脫蠟再水合。使用HE染色試劑盒對(duì)腦組織進(jìn)行染色，在光學(xué)顯微鏡下觀察腦組織病理變化。

1.4.3 TUNEL染色 按照制造商說明書，使用TUNEL染色試劑盒進(jìn)行染色。將切片與包括TdT酶和TMRred標(biāo)記的dUTP在內(nèi)的TUNEL反應(yīng)混合物在37 ℃下避光孵育1 h，之后洗滌15 min，使用含有0.03%的3，3′-二氨基聯(lián)苯胺(DAB)的轉(zhuǎn)化過氧化物酶可視化。在BX51顯微鏡下觀察和計(jì)數(shù)每個(gè)切片的5個(gè)視野下TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞總數(shù)。

1.4.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-qPCR) 使用Trizol試劑從海馬組織中提取總RNA。之后用PrimeScript RT Reagent Kit試劑盒和miRcute miRNA cDNA第一鏈合成試劑盒分別從mRNA和miRNA中反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。使用SYBR Premix Ex Taq試劑盒在ABI 7500 qPCR系統(tǒng)上進(jìn)行PCR反應(yīng)。反應(yīng)條件：50 ℃ 2 min，95 ℃ 10 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，重復(fù)40個(gè)循環(huán)。采用2-ΔΔCt法計(jì)算miRNA和mRNA基因的相對(duì)表達(dá)，U6和GAPDH分別作為miRNA和mRNA的內(nèi)部對(duì)照。

1.4.5 酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)實(shí)驗(yàn) 收集海馬組織，采用RIPA法分離蛋白，采用二喹啉甲酸法(BCA)試劑盒測(cè)定蛋白濃度。根據(jù)ELISA試劑盒說明書檢測(cè)超氧化物歧化酶(SOD)和丙二醛(MDA)水平，使用酶標(biāo)儀測(cè)量450 nm波長(zhǎng)各孔的吸光度值。

1.4.6 蛋白免疫印跡法(Western Blot) 使用RIPA裂解液對(duì)處理后的海馬組織進(jìn)行分裂，采用BCA試劑盒檢測(cè)蛋白濃度。將50 g蛋白樣品通過8%～12%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離并轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上。將膜在含5%脫脂牛奶的PBST緩沖液中于37 ℃封閉1 h，并與一抗在4 ℃下孵育過夜。之后將膜與相應(yīng)的辣根過氧化物酶結(jié)合的二抗在37 ℃下孵育1 h。使用電化學(xué)發(fā)光(ECL)試劑盒測(cè)量相關(guān)蛋白表達(dá)水平，并使用Image J軟件進(jìn)行定量。

1.4.7 雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn) 將293 T細(xì)胞接種在24孔板中，并與攜帶野生型JAK2(WT-JAK2)或突變型JAK2(MUT-JAK2)的熒光素酶質(zhì)粒和miR-433 mimic或NC mimic共轉(zhuǎn)染。孵育48 h后，根據(jù)說明書采用雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒檢測(cè)熒光強(qiáng)度。

2 結(jié) 果

2.1 miR-433對(duì)POCD大鼠認(rèn)知能力的影響 與Control組比較，POCD組大鼠海馬組織中miRNA-433表達(dá)降低，逃避潛伏期延長(zhǎng)，穿越平臺(tái)次數(shù)減少；與POCD+NC mimic組比較，POCD+miR-433 mimic組大鼠海馬組織中miRNA-433表達(dá)升高，逃避潛伏期縮短，穿越平臺(tái)次數(shù)增加，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。詳見圖1。

POCD組與Control組比較，＊P<0.05；POCD+miR-433 mimic組與POCD+NC mimic組比較，#P<0.05。圖1 miR-433對(duì)POCD大鼠認(rèn)知功能的影響(A為miRNA-433表達(dá)柱狀圖；B為逃避潛伏期柱狀圖；C為穿越平臺(tái)次數(shù)柱狀圖)

2.2 miR-433對(duì)POCD大鼠海馬組織病理學(xué)的影響 HE染色結(jié)果顯示：Control組海馬組織神經(jīng)細(xì)胞排列規(guī)則緊密，細(xì)胞邊界清晰，細(xì)胞核呈圓形或橢圓形。POCD組神經(jīng)細(xì)胞紊亂，細(xì)胞核溶解，海馬神經(jīng)元細(xì)胞和錐體細(xì)胞死亡，壞死神經(jīng)細(xì)胞數(shù)量減少。POCD+miR-433 mimic組大鼠海馬內(nèi)細(xì)胞排列較POCD+NC mimic組更規(guī)則，壞死神經(jīng)細(xì)胞數(shù)量減少。詳見圖2。

圖2 miR-433對(duì)POCD大鼠海馬組織病理學(xué)變化的影響(HE)

2.3 miRNA-433過表達(dá)對(duì)神經(jīng)元細(xì)胞凋亡的影響 與Control組比較，POCD組大鼠神經(jīng)元細(xì)胞凋亡率、Cleaved Caspase-3和Bad蛋白表達(dá)升高，Bcl-2蛋白表達(dá)降低；與POCD+NC mimic組比較，POCD+miR-433 mimic組大鼠神經(jīng)元細(xì)胞凋亡率、Cleaved Caspase-3和Bad蛋白表達(dá)降低，Bcl-2蛋白表達(dá)升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。詳見圖3。

POCD組與Control組比較，＊P<0.05；POCD+miR-433 mimic組與POCD+NC mimic組比較，#P<0.05。圖3 miR-433對(duì)POCD大鼠神經(jīng)元細(xì)胞凋亡的影響(A為TUNEL染色圖；B為細(xì)胞凋亡率柱狀圖；C為各蛋白表達(dá)條帶圖；D為各蛋白表達(dá)柱狀圖)

2.4miRNA-433過表達(dá)對(duì)POCD大鼠海馬組織氧化應(yīng)激水平的影響 與Control組比較，POCD組大鼠海馬組織SOD水平降低，MDA水平升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與POCD+NC mimic組比較，POCD+miR-433 mimic組大鼠海馬組織SOD水平升高，MDA水平降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。詳見圖4。

POCD組與Control組比較，＊P<0.05；POCD+miR-433 mimic組與POCD+NC mimic組比較，#P<0.05。圖4 miR-433對(duì)POCD大鼠海馬組織氧化應(yīng)激水平的影響 (A為MDA表達(dá)柱狀圖；B為SOD表達(dá)柱狀圖)

2.5 miR-433靶向JAK2并調(diào)控其表達(dá) 雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)結(jié)果顯示，與NC mimic組比較，miR-433 mimic組WT-JAK2細(xì)胞熒光素酶活性降低(P<0.05)；RT-qPCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與NC mimic組比較，miR-433 mimic組JAK2 mRNA和蛋白水平下降，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。詳見圖5。

與NC mimic組比較，＊P<0.05。圖5 miR-433靶向JAK2并調(diào)控其表達(dá)(A為熒光素酶活性柱狀圖；B為JAK2 mRNA表達(dá)柱狀圖；C為JAK2蛋白表達(dá)條帶圖；D為JAK2蛋白表達(dá)柱狀圖)

2.6 miR-433通過JAK2/STAT3通路對(duì)POCD大鼠氧化應(yīng)激和凋亡的影響 與POCD+NC mimic組比較，POCD+miR-433 mimic組大鼠海馬組織中p-JAK2、p-STAT3、Cleaved Caspase-3、Bad蛋白及MDA水平降低，Bcl-2蛋白、SOD水平升高；與POCD+miR-433 mimic+Vector組比較，POCD+miR-433 mimic+pcDNA-JAK2組大鼠海馬組織p-JAK2、p-STAT3、Cleaved Caspase-3、Bad蛋白及MDA水平升高，Bcl-2蛋白、SOD水平降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。詳見圖6。

POCD+miR-433 mimic組與POCD+NC mimic組比較，＊P<0.05；POCD+miR-433 mimic+pcDNA-JAK2組與POCD+miR-433 mimic+Vector組比較，#P<0.05。圖6 miR-433通過JAK2/STAT3通路對(duì)POCD大鼠氧化應(yīng)激和凋亡的影響(A為各蛋白表達(dá)條帶圖；B為Cleaved Caspase-3、Bad、Bcl-2蛋白表達(dá)柱狀圖；C為p-JAK2、p-STAT3蛋白表達(dá)柱狀圖；D為MDA表達(dá)柱狀圖；E為SOD表達(dá)柱狀圖)

3 討 論

POCD主要臨床表現(xiàn)為注意力、記憶、語(yǔ)言等認(rèn)知功能減退。POCD的病理機(jī)制復(fù)雜，且尚未明確。在具有學(xué)習(xí)和記憶功能的大腦海馬體中，信號(hào)通路的改變認(rèn)為是全身麻醉導(dǎo)致POCD認(rèn)知障礙的上游機(jī)制。據(jù)報(bào)道，異氟醚是一種常見的吸入麻醉劑，通過核轉(zhuǎn)錄因子(NF)-κB和缺氧誘導(dǎo)因子-1等多種途徑誘導(dǎo)老年大鼠海馬神經(jīng)炎癥和認(rèn)知損傷[13]。氧化應(yīng)激可能參與POCD的發(fā)病機(jī)制，有研究顯示，手術(shù)創(chuàng)傷誘導(dǎo)了POCD模型鼠海馬的氧化應(yīng)激[14]。這些機(jī)制為POCD提供了潛在的預(yù)防或治療靶點(diǎn)。已研究證實(shí)，在POCD大鼠模型中，抑制氧化應(yīng)激可改善認(rèn)知功能障礙[15]。本研究采用異氟醚誘導(dǎo)的大鼠POCD模型，通過測(cè)定氧化應(yīng)激因子、細(xì)胞凋亡和JAK2/STAT3信號(hào)通路相關(guān)蛋白，探討miR-433在大鼠POCD發(fā)生和進(jìn)展中的作用，本研究提供了一種新的POCD治療方法，并探討其作用機(jī)制。

Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)常用于評(píng)估大鼠認(rèn)知功能，主要是實(shí)驗(yàn)動(dòng)物空間位置和方向?qū)W習(xí)記憶能力，廣泛應(yīng)用于學(xué)習(xí)記憶、老年癡呆、海馬研究、智力與衰老、新藥研發(fā)等方面的研究[16]。逃逸潛伏期用于評(píng)估大鼠學(xué)習(xí)能力，逃逸潛伏期越短，表現(xiàn)越好。穿越平臺(tái)次數(shù)用于評(píng)估空間記憶能力，穿越平臺(tái)次數(shù)越多提示性能水平越高。本研究將miR-433過表達(dá)腺病毒注射至大鼠體內(nèi)，結(jié)果顯示，miR-433過表達(dá)改善了POCD大鼠學(xué)習(xí)和空間記憶能力。

本研究結(jié)果顯示，miR-433過表達(dá)與海馬MDA降低和SOD水平升高有關(guān)，表明miR-433過表達(dá)抑制了老年P(guān)OCD大鼠海馬的氧化應(yīng)激。氧化應(yīng)激是指抗氧化防御系統(tǒng)功能障礙，導(dǎo)致活性氧和活性氮過量產(chǎn)生，從而導(dǎo)致組織和細(xì)胞損傷[17]。SOD是抗氧化系統(tǒng)中重要的酶，其活性可直接反映線粒體抗氧化系統(tǒng)水平[18]。有研究表明，氧化應(yīng)激參與了POCD誘導(dǎo)的神經(jīng)元損傷[1]。有研究顯示，手術(shù)創(chuàng)傷可誘導(dǎo)POCD海馬氧化應(yīng)激，從而參與POCD發(fā)病機(jī)制，年齡也是POCD的危險(xiǎn)因素，年老的海馬表現(xiàn)出多種神經(jīng)生物學(xué)變化，包括氧化應(yīng)激增加[19]。因此，氧化應(yīng)激可能是治療POCD的潛在靶點(diǎn)。有研究表明，miR-7684參與調(diào)控POCD氧化應(yīng)激的表達(dá)[20]。本研究中，miR-433過表達(dá)可降低POCD大鼠氧化應(yīng)激，抑制神經(jīng)元凋亡，改善術(shù)后認(rèn)知功能障礙的發(fā)生和發(fā)展，發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。

相關(guān)研究顯示，JAK2/STAT3信號(hào)通路在腦缺血神經(jīng)元中具有抗炎和抗凋亡作用[21]。JAK2磷酸化或過表達(dá)可能是腦損傷的機(jī)制之一[22]。減少JAK2/STAT3磷酸化可減少神經(jīng)元死亡，縮小梗死面積，防止神經(jīng)細(xì)胞缺血后損傷。腦缺血后通過RNA干擾降低了STAT3磷酸化，具有顯著的神經(jīng)保護(hù)作用[23]。有研究顯示，電針刺激大鼠局灶性腦缺血，通過降低JAK2表達(dá)，防止JAK2異常激活，下調(diào)STAT3磷酸化，從而改善神經(jīng)功能缺損[24]。JAK2/STAT3通路下調(diào)與miRNA上調(diào)相關(guān)。miR-17通過靶向JAK2/STAT3信號(hào)通路，減少膠原誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎小鼠的炎癥和骨侵蝕[25]。有研究顯示，帕金森病和阿爾茨海默病病人miR-433下調(diào)，miR-433過表達(dá)可能通過JAK2/STAT3降低Aβ誘導(dǎo)的神經(jīng)元活性抑制[26]。miR-433通過JAK2/STAT3通路在術(shù)后認(rèn)知障礙中的作用尚未明確。本研究結(jié)果顯示，miR-433過表達(dá)可能通過JAK2/STAT3通路改善大鼠POCD。

綜上所述，miR-433通過JAK2/STAT3通路調(diào)控氧化應(yīng)激抑制海馬組織的神經(jīng)元凋亡，改善大鼠認(rèn)知功能，為治療POCD提供了新方法。