劉曉東，劉曉琴，閆業(yè)軍

急性心肌梗死是一種臨床常見(jiàn)的疾病類(lèi)型，目前采用經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入等手段進(jìn)行治療，當(dāng)缺血心肌組織恢復(fù)供血后可加重心肌組織損傷，即心肌缺血再灌注損傷[1-2]。相關(guān)研究表明，中藥具有抗氧化、抗凋亡等作用，可減輕心肌缺血再灌注損傷[3-4]。金櫻子總黃酮(rosa laevigata michx total flavonoids，RLMTF)可減輕動(dòng)脈內(nèi)皮損傷，具有降低大鼠體內(nèi)的氧化應(yīng)激反應(yīng)、保護(hù)血管內(nèi)皮功能的作用[5]。金櫻子總黃酮對(duì)缺氧/復(fù)氧(H/R)誘導(dǎo)心肌細(xì)胞損傷的影響尚未明確。微小RNA(miRNA)在心肌細(xì)胞損傷中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用，有研究表明miR-1247-3p在H/R誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷中表達(dá)下調(diào)，過(guò)表達(dá)miR-1247-3p可減輕H/R誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷[6]。本研究探討金櫻子總黃酮是否通過(guò)調(diào)控miR-1247-3p表達(dá)影響H/R誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷，以期為金櫻子在心肌缺血再灌注損傷方面的作用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 金櫻子購(gòu)自扶風(fēng)斯諾特生物科技有限公司；大鼠心肌細(xì)胞H9C2購(gòu)自上海研謹(jǐn)生物科技有限公司；Trizol試劑、cDNA合成及實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(qRT-PCR)試劑均購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher；LipofectamineTM3000 Transfection Reagent購(gòu)自美國(guó)Invitrogen；miR-NC、miR-1247-3p mimics、anti-miR-NC、anti-miR-1247-3p購(gòu)自廣州銳博生物；丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSH-Px)試劑盒購(gòu)自南京建成生物；細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自北京Solarbio；兔抗鼠Cleaved-Caspase 3、Cleaved-Caspase 9抗體與HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗購(gòu)自北京中杉金橋生物。

1.2 方法

1.2.1 金櫻子總黃酮提取與制備[7]金櫻子粉碎后過(guò)40目篩，取1.0 g粉末置于50 mL離心管內(nèi)，加入30%乙醇和1%纖維素酶，充分混勻后封口，60 ℃恒溫下水浴90 min，之后置于90 ℃恒溫水浴鍋內(nèi)，滅活酶30 s，提取金櫻子總黃酮(純度73%)，加入二甲基亞砜(DMSO)溶解后稀釋?zhuān)瑵舛确謩e為0.12 mg/mL、0.24 mg/mL、0.48 mg/mL。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)分組 將H9C2細(xì)胞接種于不含血清的低糖DMEM培養(yǎng)基，置于37 ℃低氧密閉培養(yǎng)箱(95%N2+5%CO2)內(nèi)缺氧處理3 h，之后以含10%胎牛血清的高糖DMEM置于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)復(fù)氧處理4 h[8]，作為H/R組。同時(shí)將正常培養(yǎng)的H9C2細(xì)胞作為Con組。H9C2細(xì)胞接種于96孔板(每孔3×103個(gè))，分別加入含有濃度為0.12 mg/mL、0.24 mg/mL、0.48 mg/mL金櫻子總黃酮的培養(yǎng)基，維持24 h后進(jìn)行H/R處理，分別作為H/R+RLMTF-L組、H/R+RLMTF-M組、H/R+RLMTF-H組。采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將miR-NC、miR-1247-3p mimics、anti-miR-NC、anti-miR-1247-3p分別轉(zhuǎn)染至H9C2細(xì)胞，轉(zhuǎn)染成功后，轉(zhuǎn)染miR-NC、miR-1247-3p mimics的細(xì)胞進(jìn)行H/R處理，轉(zhuǎn)染anti-miR-NC、anti-miR-1247-3p的細(xì)胞，加入0.48 mg/mL金櫻子總黃酮，維持24 h后進(jìn)行H/R處理，分別作為H/R+miR-NC組、H/R+miR-1247-3p組、H/R+RLMTF+anti-miR-NC組、H/R+RLMTF+anti-miR-1247-3p組。

1.2.3 試劑盒檢測(cè)MDA水平與SOD、GSH-Px活性 收集各組H9C2細(xì)胞，采用反復(fù)凍融法裂解細(xì)胞，利用試劑盒嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)檢測(cè)MDA水平與SOD、GSH-Px活性。

1.2.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率 取各組H9C2細(xì)胞在冰磷酸緩沖鹽溶液(PBS)中洗滌，懸浮于500 μL Binding Buffer，之后在室溫避光處與膜聯(lián)蛋白-異硫氰酸熒光素(Annexin V-FITC)/碘化丙啶(PI)各5 μL，充分反應(yīng)10 min，應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組H9C2細(xì)胞凋亡率。

1.2.5 qRT-PCR檢測(cè)miR-1247-3p表達(dá)水平 采用Trizol試劑從各組H9C2細(xì)胞中制備總RNA。反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以cDNA為模板進(jìn)行qRT-PCR擴(kuò)增，應(yīng)用羅氏LightCycler480熒光定量PCR儀檢測(cè)Ct值，并采用2-ΔΔCt法計(jì)算miR-1247-3p相對(duì)表達(dá)量。

1.2.6 免疫印跡法(Western Blot)檢測(cè)Cleaved-Caspase 3、Cleaved-Caspase 9蛋白表達(dá)量 以500 μL RIPA裂解液從各組H9C2細(xì)胞中制備總蛋白，取40 μg蛋白進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，轉(zhuǎn)膜、封閉后加入Cleaved-Caspase 3、Cleaved-Caspase 9一抗(1∶1 000)與內(nèi)參GAPDH抗體稀釋液(1∶2000)4℃孵育12h，加入稀釋比為1∶3 000的二抗稀釋液室溫孵育2 h，暗室內(nèi)曝光顯影，應(yīng)用Quantity One軟件對(duì)Cleaved-Caspase 3、Cleaved-Caspase 9蛋白條帶進(jìn)行定量分析。

2 結(jié) 果

2.1 金櫻子總黃酮抑制H/R誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激 與Con組比較，H/R組MDA水平升高(P<0.05)，SOD、GSH-Px活性降低(P<0.05)；與H/R組比較，H/R+RLMTF-L組、H/R+RLMTF-M組、H/R+RLMTF-H組MDA水平降低(P<0.05)，SOD、GSH-Px活性升高(P<0.05)，且呈劑量依賴(lài)性。詳見(jiàn)表1。

表1 金櫻子總黃酮對(duì)H/R誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激的影響(±s，n=3)

2.2 金櫻子總黃酮對(duì)H/R誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡的影響 與Con組比較，H/R組細(xì)胞凋亡率和Cleaved-Caspase 3、Cleaved-Caspase 9蛋白水平升高(P<0.05)；與H/R組比較，H/R+RLMTF-L組、H/R+RLMTF-M組、H/R+RLMTF-H組細(xì)胞凋亡率和Cleaved-Caspase 3、Cleaved-Caspase 9蛋白水平降低(P<0.05)，且呈劑量依賴(lài)性。詳見(jiàn)圖1、表2。

圖1 金櫻子總黃酮對(duì)H/R誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡的影響 (A為凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)條帶圖；B為心肌細(xì)胞凋亡流式圖)

表2 金櫻子總黃酮對(duì)H/R誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡的影響(±s，n=3)

2.3 金櫻子總黃酮對(duì)H/R誘導(dǎo)心肌細(xì)胞miR-1247-3p表達(dá)的影響 H/R組miR-1247-3p表達(dá)量較Con組降低(P<0.05)；相較于H/R組，H/R+RLMTF-L組、H/R+RLMTF-M組、H/R+RLMTF-H組miR-1247-3p表達(dá)量升高(P<0.05)，且呈劑量依賴(lài)性。詳見(jiàn)表3。

表3 金櫻子總黃酮對(duì)H/R誘導(dǎo)心肌細(xì)胞miR-1247-3p表達(dá)的影響(±s，n=3)

2.4 miR-1247-3p過(guò)表達(dá)保護(hù)H/R誘導(dǎo)心肌細(xì)胞損傷的影響 與H/R+miR-NC組比較，H/R+miR-1247-3p組MDA水平降低(P<0.05)，SOD活性、GSH-Px活性增強(qiáng)(P<0.05)，細(xì)胞凋亡率和Cleaved-Caspase 3、Cleaved-Caspase 9蛋白水平降低(P<0.05)。詳見(jiàn)圖2、表4。

圖2 miR-1247-3p過(guò)表達(dá)抑制H/R誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡(A為miR-1247-3p過(guò)表達(dá)影響H/R誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)條帶圖；B為miR-1247-3p過(guò)表達(dá)和H/R誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡流式圖)

表4 miR-1247-3p過(guò)表達(dá)保護(hù)H/R誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷(±s，n=3)

2.5 干擾miR-1247-3p表達(dá)逆轉(zhuǎn)金櫻子總黃酮(0.48 mg/mL)對(duì)H/R誘導(dǎo)心肌細(xì)胞損傷的影響 與H/R+RLMTF+anti-miR-NC組比較，H/R+RLMTF+anti-miR-1247-3p組MDA水平升高(P<0.05)，SOD活性、GSH-Px活性減弱(P<0.05)，細(xì)胞凋亡率和Cleaved-Caspase 3、Cleaved-Caspase 9蛋白水平升高(P<0.05)。詳見(jiàn)圖3、表5。

圖3 干擾miR-1247-3p表達(dá)逆轉(zhuǎn)金櫻子總黃酮(0.48 mg/mL)對(duì)H/R誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡的影響(A為干擾miR-1247-3p表達(dá)、金櫻子總黃酮和H/R誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)條帶圖；B為干擾miR-1247-3p表達(dá)、金櫻子總黃酮和H/R誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡流式圖)

表5 干擾miR-1247-3p表達(dá)逆轉(zhuǎn)了金櫻子總黃酮對(duì)H/R誘導(dǎo)心肌細(xì)胞損傷的影響(±s，n=3)

3 討 論

金櫻子屬于薔薇科，薔薇屬綠灌木的果實(shí)，金櫻子總黃酮是其主要活性成分，黃酮類(lèi)化合物常表現(xiàn)出抑制自由基生成、抗腫瘤等功能，金櫻子總黃酮可抑制氧化應(yīng)激及炎癥反應(yīng)，減輕肝組織缺血/再灌注損傷[9]。金櫻子總黃酮可抑制氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)，減輕腎缺血再灌注損傷[10]。金櫻子總黃酮可減輕脂多糖誘導(dǎo)的小鼠肝損傷[11]。但其對(duì)H/R誘導(dǎo)心肌細(xì)胞損傷的影響尚未明確。本研究結(jié)果顯示，H/R誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞MDA水平升高，SOD、GSH-Px活性降低，與相關(guān)研究報(bào)道結(jié)果[12]相近，提示成功構(gòu)建心肌缺血再灌注損傷模型。進(jìn)一步研究顯示，在H/R誘導(dǎo)心肌細(xì)胞中，金櫻子總黃酮呈劑量依賴(lài)性減輕氧化應(yīng)激，該結(jié)果由MDA水平下調(diào)和SOD、GSH-Px活性上調(diào)證實(shí)。本研究結(jié)果表明，H/R誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡率和Cleaved-Caspase 3、Cleaved-Caspase 9蛋白水平升高，與相關(guān)研究報(bào)道結(jié)果[13]相近。金櫻子總黃酮可降低H/R誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡率和Cleaved-Caspase 3、Cleaved-Caspase 9蛋白水平，提示金櫻子總黃酮保護(hù)H/R誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷與抑制細(xì)胞凋亡密切相關(guān)。

miR-1247-3p在缺氧缺糖/再?gòu)?fù)氧誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞中表達(dá)下調(diào)，恢復(fù)其表達(dá)可減輕細(xì)胞凋亡，進(jìn)而改善細(xì)胞缺氧缺糖/再?gòu)?fù)氧損傷[14]。本研究結(jié)果顯示，在心肌細(xì)胞中H/R下調(diào)miR-1247-3p水平，金櫻子總黃酮可提高H/R誘導(dǎo)心肌細(xì)胞miR-1247-3p表達(dá)量，且呈劑量依賴(lài)性，提示金櫻子總黃酮可能通過(guò)上調(diào)miR-1247-3p表達(dá)，減輕H/R誘導(dǎo)心肌細(xì)胞損傷。本研究結(jié)果顯示，miR-1247-3p過(guò)表達(dá)可降低MDA水平和細(xì)胞凋亡率，SOD、GSH-Px活性升高；干擾miR-1247-3p表達(dá)部分削弱了金櫻子總黃酮抑制H/R誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激及抑制細(xì)胞凋亡的結(jié)果。上述結(jié)果表明，金櫻子總黃酮通過(guò)調(diào)控miR-1247-3p表達(dá)減輕H/R誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷。

綜上所述，金櫻子總黃酮通過(guò)促進(jìn)miR-1247-3p表達(dá)，抑制H/R誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激及凋亡，從而減輕細(xì)胞損傷，miR-1247-3p可能作為金櫻子總黃酮減輕心肌缺血再灌注損傷的潛在靶點(diǎn)。具體作用機(jī)制仍需進(jìn)一步深入研究。