郭 亮，李亞潔

缺血性心律失常是心肌梗死病人常見的并發(fā)癥，可減少病人冠狀動脈血流量，促進(jìn)心肌缺血進(jìn)展，加重心肌損傷，是導(dǎo)致病人猝死的主要原因之一，因此，防治缺血性心律失常對提高冠心病等心血管疾病病人生活質(zhì)量和存活率具有重要的臨床意義[1-2]。炎癥參與介導(dǎo)缺血性心律失常的發(fā)病過程，并促進(jìn)其進(jìn)展，使用抗炎藥物可改善心肌缺血引發(fā)的心律失常癥狀[3-4]。miR-146a-5p是一種具有顯著抗炎作用的微小RNA，參與介導(dǎo)哮喘、慢性阻塞性肺疾病、心律失常等炎性疾病的發(fā)生發(fā)展過程，過表達(dá)miR-146a通過阻止核轉(zhuǎn)錄因子-κB(NF-κB)信號激活抑制炎癥[5]，且miR-146a-5p可作為心房顫動的生物標(biāo)志物，經(jīng)藥物治療后其血漿水平升高[6]，Notch2是其靶基因。有研究表明，miR-146a-5p可直接靶向下調(diào)Notch2表達(dá)，進(jìn)而保護(hù)心肌細(xì)胞免受缺氧/復(fù)氧損傷[7-8]，提示miR-146a-5p/Notch2可作為缺血性心律失常的重要治療靶點。Hipk1是一種環(huán)狀RNA，可調(diào)控炎癥發(fā)生及進(jìn)展，下調(diào)Hipk1表達(dá)可減少炎性因子表達(dá)分泌，抑制炎癥，抑制宮頸炎進(jìn)展[9]，同時促進(jìn)心肌細(xì)胞生長和增殖，改善心肌缺血損傷后不良心臟重塑和心功能障礙[10]，因而推測干擾CircRNA Hipk1可能對缺血性心律失常具有治療作用。本研究建立缺血性心律失常大鼠模型，探討CircRNA Hipk1調(diào)控miR-146a-5p/Notch2軸對缺血性心律失常大鼠心肌細(xì)胞凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物 SD大鼠購自遼寧長生生物技術(shù)股份有限公司[SCXK(遼)2020-0001]，質(zhì)量合格證號No.210726200100192861，體質(zhì)量(200±20)g，無特定病原體(SPF)級，雄性，參照《中華人民共和國實驗動物管理條例》于我院實驗動物中心飼養(yǎng)，分籠飼養(yǎng)，每籠8只，照明12 h/12 h晝夜節(jié)律，食水充足，通風(fēng)良好，溫度20～25 ℃，相對濕度50%～60%。

1.1.2 實驗試劑與儀器 Hipk1、miR-146a-5p、U6、Notch2及GAPDH引物、CircRNA Hipk1 siRNA腺相關(guān)病毒、miR-146a-5p Antagomir、CircRNA Hipk1 siRNA陰性對照腺相關(guān)病毒、miR-146a-5p Antagomir陰性對照均購自上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司；2，3，5-氯化三苯基四氮唑(TTC)染液(D025-1-1)、末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的dUTP缺口末端標(biāo)記測定法(TUNEL)染色檢測試劑盒(G001-1-1)、蘇木精-伊紅(HE)染色試劑盒(D006-1-1)、大鼠白細(xì)胞介素(IL)-17測試盒(H014-1)、大鼠IL-1β測試盒(H002)、TRIzol總RNA提取試劑(N065)、一步法逆轉(zhuǎn)錄實時定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-qPCR)試劑盒(N123)購自南京建成生物工程研究所有限公司。

小動物呼吸機(Kent)購自肯特企業(yè)集團(tuán)公司；生物機能實驗系統(tǒng)(BL-420F)購自成都泰盟軟件有限公司；酶標(biāo)儀(PT-DR200B)購自北京普天新橋技術(shù)有限公司；倒置顯微鏡(IX51)購自日本OlymPus公司；冰凍切片機(CM1950)購自德國Leica公司；RT-qPCR儀(Roche Light Cycler480 Ⅱ)購自瑞士羅氏公司等。

1.2 方法

1.2.1 制備缺血性心律失常大鼠模型及分組給藥 SD大鼠禁食12 h后腹腔注射60 mg/kg的戊巴比妥鈉麻醉，參照文獻(xiàn)[11]制備缺血性心律失常模型：仰臥固定后氣管插管，采用小動物呼吸機進(jìn)行機械通氣(呼吸頻率70次/min，潮氣量6～7 mL)，將大鼠四肢皮下連接到生物機能實驗系統(tǒng)，隨時觀察心電變化，大鼠前胸備皮消毒，開胸暴露心臟，鈍性分離肺動脈并結(jié)扎，觀察到結(jié)扎線下左心室前壁出現(xiàn)發(fā)紺，且標(biāo)準(zhǔn)Ⅱ?qū)?lián)心電圖ST段抬高，表明心肌缺血成功，0.5 h后，放開結(jié)扎線，恢復(fù)血流灌注2 h，即完成造模。將大鼠隨機分為模型組、CircRNA Hipk1 siRNA腺相關(guān)病毒(干擾CircRNA Hipk1)組、miR-146a-5p Antagomir(miR-146a-5p抑制劑)組、CircRNA Hipk1 siRNA腺相關(guān)病毒+miR-146a-5p Antagomir組、陰性對照(CircRNA Hipk1 siRNA腺相關(guān)病毒陰性對照+miR-146a-5p Antagomir陰性對照)組，每組12只；另外隨機選擇12只大鼠，僅開胸暴露心臟，不結(jié)扎肺動脈，作為假手術(shù)組。

將購買的RNA抑制劑及陰性對照溶解于生理鹽水，配制成8 mg/mL的CircRNA Hipk1 siRNA腺相關(guān)病毒藥液、8 mg/mL的miR-146a-5p Antagomir藥液、8 mg/mL的CircRNA Hipk1 siRNA陰性對照腺相關(guān)病毒藥液、8 mg/mL的miR-146a-5p Antagomir陰性對照藥液、8 mg/mL的CircRNA Hipk1 siRNA腺相關(guān)病毒藥液和8 mg/mL的miR-146a-5p Antagomir混合藥液、8 mg/mL的CircRNA Hipk1 siRNA腺相關(guān)病毒陰性對照藥液和8 mg/mL的miR-146a-5p Antagomir陰性對照混合藥液，參照文獻(xiàn)[12]及說明書，藥物干預(yù)組大鼠均于放開結(jié)扎線前5 min，分組尾靜脈注射10 mL/kg劑量的藥液，間隔1 d后，再次注射，共注射3次，假手術(shù)組和模型組以相同方法注射等量生理鹽水。

1.2.2 測定大鼠心律失常癥狀 藥物干預(yù)后24 h，采用生物機能實驗系統(tǒng)記錄大鼠心電圖并進(jìn)行分析，根據(jù)室性期前收縮(ventricular premature beat，VP)、非持續(xù)性室性心動過速(nonsustained VT，NSVT)、室性心動過速(ventricular tachycardia，VT)、房室傳導(dǎo)阻滯(atrioventricular block，AVB)等心律失常癥狀發(fā)生情況進(jìn)行心律失常評分，評分標(biāo)準(zhǔn)：無心律失常計0分，單個VP計1分，2個VP計2分，3個VP或NSVT計3分，VT或AVB計4分，死亡計5分。

1.2.3 測量大鼠心肌梗死面積及標(biāo)本采集 心律失常評分完成后，參照1.2.1方法采用戊巴比妥鈉麻醉大鼠，使用注射器刺入頸動脈采集血液約1.2 mL，離心(4 ℃，15 min，3 000 r/min)，吸出上清并得到血清，保存于-80 ℃冰箱中；斷頭處死大鼠，解剖取出心臟，每組隨機選取6只大鼠心臟，清洗后，剪下約0.8 g心肌組織并保存于液氮中，剩余心肌組織置于包埋劑中，使用液氮快速冷凍，再用冰凍切片機進(jìn)行連續(xù)病理切片備用；每組剩余6只大鼠心臟沿左心室長軸方向切成厚約2 mm薄片，浸入TTC染液中，37 ℃下孵育30 min，之后以4%多聚甲醛固定24 h，取出后采用Image J軟件分析計算，心肌梗死面積=心肌損傷面積/總心肌面積×100%。

1.2.4 觀察大鼠心肌組織病理形態(tài)及心肌細(xì)胞凋亡 取出1.2.3中的心肌組織冰凍切片，室溫下復(fù)溫15 min，以冰丙酮固定，各取出3張，分別使用試劑盒進(jìn)行HE及TUNEL染色，具體步驟參照說明書進(jìn)行，之后分別以蒸餾水漂洗后，鋪在載玻片上，封片后以顯微鏡觀察，任意選出每張切片上5個視野拍照，以Image J軟件分析計算，心肌細(xì)胞凋亡率=凋亡細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100%。

1.2.5 測定血清IL-1β、IL-17水平 取出1.2.3中大鼠血清，置于冰水浴中提前解凍，采用相應(yīng)試劑盒檢測血清IL-1β、IL-17水平，具體步驟按照試劑盒說明進(jìn)行。

1.2.6 測定大鼠心肌組織CircRNA Hipk1、miR-146a-5p及Notch2 mRNA表達(dá)水平 取出1.2.3中大鼠心肌組織，采用TRIzol提取其中總RNA后通過試劑盒進(jìn)行RT-qPCR反應(yīng)，具體步驟按照試劑盒說明進(jìn)行，反應(yīng)體系為20 μL，方法按照試劑盒說明書進(jìn)行，反應(yīng)條件：預(yù)變性(95 ℃)3 min，變性(95 ℃)12 s，退火(62 ℃)40 s，40個循環(huán)，通過2-ΔΔCt法分析數(shù)據(jù)，采用相對定量法，以U6作為miR-146a-5p的內(nèi)參，以GAPDH作為CircRNA Hipk1及Notch2 mRNA的內(nèi)參，檢測CircRNA Hipk1、miR-146a-5p及Notch2 mRNA相對表達(dá)水平，各基因擴增引物序列見表1。

表1 各基因引物序列

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠心律失常評分比較 與假手術(shù)組比較，模型組大鼠心律失常評分升高(P<0.05)；與模型組、CircRNA Hipk1 siRNA腺相關(guān)病毒+miR-146a-5p Antagomir組比較，CircRNA Hipk1 siRNA腺相關(guān)病毒組大鼠心律失常評分降低(P<0.05)，miR-146a-5p Antagomir組大鼠心律失常評分升高(P<0.05)；陰性對照組、CircRNA Hipk1 siRNA腺相關(guān)病毒+miR-146a-5p Antagomir組與與模型組大鼠心律失常評分比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。詳見表2。

表2 各組大鼠心律失常評分比較(±s) 單位：分

2.2 各組大鼠心肌梗死面積比較 與假手術(shù)組比較，模型組大鼠心肌梗死面積增大(P<0.05)；與模型組、CircRNA Hipk1 siRNA腺相關(guān)病毒+miR-146a-5p Antagomir組比較，CircRNA Hipk1 siRNA腺相關(guān)病毒組大鼠心肌梗死面積減小(P<0.05)，miR-146a-5p Antagomir組大鼠心肌梗死面積增大(P<0.05)；陰性對照組、CircRNA Hipk1 siRNA腺相關(guān)病毒+miR-146a-5p Antagomir組與模型組大鼠心肌梗死面積比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。詳見表3、圖1。

表3 各組大鼠心肌梗死面積比較(±s) 單位：%

圖1 TTC染色測定大鼠心肌梗死大體情況(A為假手術(shù)組；B為模型組；C為CircRNA Hipk1 siRNA腺相關(guān)病毒組；D為miR-146a-5p Antagomir組；E為CircRNA Hipk1 siRNA腺相關(guān)病毒+miR-146a-5p Antagomir組；F為陰性對照組)

2.3 各組大鼠心肌組織病理形態(tài)結(jié)果比較 假手術(shù)組大鼠心肌組織無明顯損傷；模型組、CircRNA Hipk1 siRNA腺相關(guān)病毒+miR-146a-5p Antagomir組、陰性對照組大鼠心肌組織結(jié)構(gòu)紊亂，細(xì)胞輪廓不清，排列紊亂，有炎癥細(xì)胞浸潤，呈明顯損傷；CircRNA Hipk1 siRNA腺相關(guān)病毒組大鼠心肌組織相關(guān)病理損傷減輕；miR-146a-5p Antagomir組大鼠心肌組織上述病理損傷加重。詳見圖2。

圖2 HE染色測定大鼠心肌組織病理形態(tài)(A為假手術(shù)組；B為模型組；C為CircRNA Hipk1 siRNA腺相關(guān)病毒組；D為miR-146a-5p Antagomir組；E為CircRNA Hipk1 siRNA腺相關(guān)病毒+miR-146a-5p Antagomir組；F為陰性對照組)

2.4 各組大鼠心肌細(xì)胞凋亡率比較 與假手術(shù)組比較，模型組大鼠心肌細(xì)胞凋亡率升高(P<0.05)；與模型組、CircRNA Hipk1 siRNA腺相關(guān)病毒+miR-146a-5p Antagomir組比較，CircRNA Hipk1 siRNA腺相關(guān)病毒組大鼠心肌細(xì)胞凋亡率降低(P<0.05)，miR-146a-5p Antagomir組大鼠心肌細(xì)胞凋亡率升高(P<0.05)；陰性對照組、CircRNA Hipk1 siRNA腺相關(guān)病毒+miR-146a-5p Antagomir組與模型組大鼠心肌細(xì)胞凋亡率比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。詳見圖3、表4。

圖3 TUNEL染色測定大鼠心肌細(xì)胞凋亡情況(A為假手術(shù)組；B為模型組；C為CircRNA Hipk1 siRNA腺相關(guān)病毒組；D為miR-146a-5p Antagomir組；E為CircRNA Hipk1 siRNA腺相關(guān)病毒+miR-146a-5p Antagomir組；F為陰性對照組)

表4 各組大鼠心肌細(xì)胞凋亡率比較(±s) 單位：%

2.5 各組大鼠血清IL-1β、IL-17水平比較 與假手術(shù)組比較，模型組大鼠血清IL-1β、IL-17水平升高(P<0.05)；與模型組、CircRNA Hipk1 siRNA腺相關(guān)病毒+miR-146a-5p Antagomir組比較，CircRNA Hipk1 siRNA腺相關(guān)病毒組大鼠血清IL-1β、IL-17水平降低(P<0.05)，miR-146a-5p Antagomir組大鼠血清IL-1β、IL-17水平升高(P<0.05)；陰性對照組、CircRNA Hipk1 siRNA腺相關(guān)病毒+miR-146a-5p Antagomir組大鼠與模型組血清IL-1β、IL-17水平比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。詳見表5。

表5 各組大鼠血清IL-1β、IL-17水平比較(±s) 單位：pg/mL

2.6 各組大鼠心肌組織CircRNA Hipk1、miR-146a-5p及Notch2 mRNA水平比較 與假手術(shù)組比較，模型組大鼠心肌組織CircRNA Hipk1、Notch2 mRNA表達(dá)水平升高(P<0.05)，miR-146a-5p mRNA表達(dá)水平降低(P<0.05)。與模型組、CircRNA Hipk1 siRNA腺相關(guān)病毒+miR-146a-5p Antagomir組比較，CircRNA Hipk1 siRNA腺相關(guān)病毒組大鼠心肌組織CircRNA Hipk1、Notch2 mRNA表達(dá)水平降低(P<0.05)，miR-146a-5p mRNA表達(dá)水平升高(P<0.05)；miR-146a-5p Antagomir組大鼠心肌組織CircRNA Hipk1、Notch2 mRNA表達(dá)水平升高(P<0.05)，miR-146a-5p mRNA表達(dá)水平降低(P<0.05)。陰性對照組、CircRNA Hipk1 siRNA腺相關(guān)病毒+miR-146a-5p Antagomir組與模型組大鼠心肌組織CircRNA Hipk1、miR-146a-5p及Notch2 mRNA表達(dá)水平比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。詳見表6。

表6 各組大鼠心肌組織CircRNA Hipk1、miR-146a-5p及Notch2 mRNA表達(dá)水平比較(±s)

3 討 論

心律失常作為冠心病、急性心肌梗死等心血管疾病的常見并發(fā)癥，是導(dǎo)致心源性猝死的主要原因，心律失常的防治一直是臨床工作的難點和重點。有研究表明，心肌梗死面積越大，心律失常癥狀越嚴(yán)重，因此，減輕急性心肌缺血后損傷對改善心律失常癥狀至關(guān)重要[13-14]。本研究通過結(jié)扎肺動脈方法建立缺血性心律失常模型，結(jié)果顯示，造模大鼠心律失常評分、心肌梗死面積、心肌細(xì)胞凋亡率、血清IL-1β與IL-17水平升高，且心肌組織結(jié)構(gòu)紊亂，細(xì)胞輪廓不清，排列紊亂，有炎性細(xì)胞浸潤，呈明顯損傷，表明心肌缺血再灌注后炎性細(xì)胞因子大量產(chǎn)生，引發(fā)強烈的心肌炎癥，造成心肌細(xì)胞凋亡，損害心肌組織，導(dǎo)致心律失常，提示模型構(gòu)建成功。

炎癥反應(yīng)在心律失常發(fā)生及病情進(jìn)展過程中發(fā)揮著關(guān)鍵的作用，抑制炎癥的發(fā)生發(fā)展，可減輕心肌缺血損傷，改善心律失常癥狀[15-16]。Hipk1是一種參與調(diào)控炎癥和過氧化反應(yīng)的環(huán)狀RNA，下調(diào)其表達(dá)，可減輕炎癥，改善急性呼吸窘迫綜合征小鼠肺損傷，同時減少心肌缺血引發(fā)的心肌細(xì)胞凋亡，緩解心臟不良重塑，改善心功能障礙[10，17]，提示Hipk1可作為防治缺血性心律失常的一個潛在作用靶點。本研究結(jié)果顯示，以CircRNA Hipk1 siRNA腺相關(guān)病毒處理缺血性心律失常大鼠，可減輕心肌組織病理損傷，減小心肌梗死面積，降低心律失常評分、心肌細(xì)胞凋亡率、血清IL-1β與IL-17水平，表明下調(diào)CircRNA Hipk1表達(dá)，可減小心肌梗死面積，抑制心肌缺血引發(fā)的炎性因子過度表達(dá)，減輕心肌炎癥損傷，減少心肌細(xì)胞凋亡，改善大鼠心律失常癥狀。

miR-146a-5p作為一種有較強抗炎活性的微小RNA，在心肌缺血損傷過程中發(fā)揮重要的調(diào)控作用，促進(jìn)其表達(dá)，可降低活性氧過度釋放，減輕心肌炎癥，抑制心肌細(xì)胞凋亡，保護(hù)心功能[18]。Notch2作為其靶基因[7]，可調(diào)控氧糖剝奪引發(fā)的嚴(yán)重及氧化應(yīng)激反應(yīng)，下調(diào)Notch2表達(dá)，可阻礙炎癥發(fā)生發(fā)展，保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞免受氧糖剝奪誘導(dǎo)的損傷[19]，同時抑制內(nèi)皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，減輕高糖誘導(dǎo)的心肌纖維化[20]，緩解缺氧/復(fù)氧導(dǎo)致的心肌細(xì)胞損傷[8]，因此，miR-146a-5p/Notch2可作為防治缺血性心律失常的一個重要靶點。本研究結(jié)果顯示，以miR-146a-5p Antagomir下調(diào)缺血性心律失常大鼠miR-146a-5p表達(dá)，可加重心肌組織病理損傷，增大心肌梗死面積，升高心律失常評分、心肌細(xì)胞凋亡率、血清IL-1β與IL-17水平、心肌組織Notch2 mRNA表達(dá)水平，表明miR-146a-5p/Notch2參與介導(dǎo)缺血性心律失常的發(fā)生發(fā)展過程，下調(diào)Hipk1表達(dá)，可升高miR-146a-5p表達(dá)水平，且miR-146a-5p Antagomir可減弱干擾CircRNA Hipk1表達(dá)對缺血性心律失常大鼠心肌炎癥損傷及心律失常癥狀的改善作用，逆轉(zhuǎn)對心肌細(xì)胞凋亡的抑制作用，表明下調(diào)CircRNA Hipk1表達(dá)可促進(jìn)miR-146a-5p表達(dá)，降低Notch2表達(dá)，減輕心肌炎癥，緩解缺血性心律失常大鼠心肌細(xì)胞凋亡及心律失常癥狀。

綜上所述，CircRNA Hipk1參與介導(dǎo)缺血性心律失常的發(fā)病及進(jìn)展過程，下調(diào)其表達(dá)，可上調(diào)miR-146a-5p表達(dá)，降低Notch2表達(dá)，阻礙炎癥發(fā)生發(fā)展，減輕心肌病理損傷，抑制心肌細(xì)胞凋亡，改善心肌梗死及心律失常癥狀，調(diào)節(jié)miR-146a-5p/Notch2信號傳導(dǎo)是其發(fā)揮抗心律失常作用的分子機制，本研究為缺血性心律失常的臨床治療提供了新靶點。