張澤宇，閆海峰，閆 利

慢性心力衰竭(chronic heart failure，CHF)是一種以心室結(jié)構(gòu)改變、射血功能異常為特征的慢性進(jìn)行性心血管系統(tǒng)疾病，以乏力、胸悶氣短、水腫、血瘀等臨床表現(xiàn)為主，最終導(dǎo)致死亡[1]。黃連素又稱為小檗堿，是一種異喹啉衍生生物堿，存在于黃連、小檗、黃芩、黃柏等多種具有藥用價(jià)值的植物根莖、樹皮和果實(shí)中，在我國中醫(yī)學(xué)和阿育吠陀醫(yī)學(xué)中已有兩千多年的藥用歷史，有研究證實(shí)，黃連素具有降低血糖、調(diào)節(jié)血脂、抗心律失常、抗氧化及正性肌力等生物活性，對(duì)心臟具有保護(hù)作用[2]。以0.2 mg/(kg·min)的劑量靜脈輸注黃連素可降低右心房和左心室舒張末期壓力，增加左室射血分?jǐn)?shù)，降低動(dòng)靜脈氧差[3]。已有研究證實(shí)口服黃連素可改善CHF病人生活質(zhì)量，并降低室性期前收縮和死亡發(fā)生率[4]?；A(chǔ)研究、轉(zhuǎn)化研究和臨床研究表明，黃連素通過調(diào)節(jié)哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白、p21 蛋白激活激酶1、絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated proteinkinase，MAPK)、c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase，JNK)、核因子κB、腺苷酸活化蛋白激酶、胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(extracellular signal regulated kinase，ERK)、絲氨酸/蘇氨酸激酶、瞬態(tài)電位受體香草醛4、髓分化因子88、Toll樣受體(Toll-like receptor，TLR)4等信號(hào)通路靶點(diǎn)和鈣離子濃度改善心功能以預(yù)防CHF[5]，肝臟靶向納米技術(shù)可促進(jìn)黃連素改善心臟代謝疾病[6]。證實(shí)了黃連素在預(yù)防和治療心血管疾病方面具有廣闊的應(yīng)用前景。

由于黃連素治療CHF的具體作用機(jī)制尚未明確，需進(jìn)一步研究。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是利用公共數(shù)據(jù)庫挖掘生物信息并進(jìn)行分析，可多方面預(yù)測中藥成分對(duì)疾病的作用機(jī)制，同時(shí)構(gòu)建可視化網(wǎng)絡(luò)模型，使結(jié)果清晰，在藥物研究中已廣泛應(yīng)用。分子對(duì)接技術(shù)通過計(jì)算藥物成分與靶蛋白之間的親和力數(shù)值，預(yù)測其結(jié)合形式與結(jié)合能力。鑒于黃連素在保護(hù)血管內(nèi)皮、縮小心肌梗死面積和改善心功能方面的作用，本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法探討黃連素治療CHF的核心靶點(diǎn)，旨在為今后的實(shí)驗(yàn)及臨床研究提供思路。

1 資料與方法

1.1 CHF核心蛋白的獲取 以“chronic heart failure”為檢索詞、相關(guān)性評(píng)分>15為條件，在GeneCards數(shù)據(jù)庫(http://www.genecards.org/)中獲取CHF相關(guān)蛋白，再利用STRING數(shù)據(jù)庫(http://string-db.org)以中等置信度=0.9為條件預(yù)測蛋白相互作用關(guān)系。采用Cytoscape v3.9.0軟件，度值、介度、緊密度、網(wǎng)絡(luò)中心性和局部邊緣通性均大于中位值的條件下篩選2次，獲取CHF核心蛋白。

1.2 “黃連素靶蛋白”與“CHF核心蛋白”交集靶點(diǎn)的獲取 基于HERB數(shù)據(jù)庫(http://herb.ac.cn/)獲取黃連素靶蛋白，并與CHF核心蛋白取交集。將黃連素和交集靶點(diǎn)導(dǎo)入Cytoscape v3.8.2可視化軟件，構(gòu)建成分靶標(biāo)網(wǎng)絡(luò)，其中節(jié)點(diǎn)代表化合物和靶蛋白，邊代表節(jié)點(diǎn)間的相互作用。

1.3 基因本體(gene ontology，GO)功能富集分析和京都基因與基因組百科全書(Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG)通路富集分析 將交集蛋白通過Rx64 4.0.2軟件以P<0.05為篩選條件進(jìn)行GO功能富集分析和KEGG通路富集分析。GO功能富集分析主要包括生物過程(biological process，BP)、分子功能(molecular function，MF)和細(xì)胞組成(cellular component，CC)，在GO富集分析得到的3部分中，將排名居前10位的功能繪制成條形圖；將KEGG通路富集分析獲取的前30條通路繪制氣泡圖(縱坐標(biāo)為通路名稱，橫坐標(biāo)為基因占比，圓圈面積代表富集基因數(shù)目，顏色為富集程度，紅色越深代表富集顯著性越強(qiáng))，通過查閱文獻(xiàn)篩選疾病相關(guān)通路并在KEGG富集結(jié)果中獲取富集蛋白，利用Cytoscape v3.9.0軟件分析通路與靶點(diǎn)的拓?fù)潢P(guān)系。

1.4 分子對(duì)接驗(yàn)證及篩選 利用STRING數(shù)據(jù)庫和Cytoscape v3.9.0軟件篩選富集核心蛋白，與黃連素進(jìn)行分子對(duì)接。采用Chem3D軟件對(duì)黃連素進(jìn)行結(jié)構(gòu)優(yōu)化，保存為lig.mol2文件；通過PDB數(shù)據(jù)庫(http://www.rcsb.org/)獲取富集核心蛋白結(jié)構(gòu)，并利用PyMOLWin.exe軟件去除水分子和小分子配體，保存為rep.pdb；將rep.pdb和lig.mol2文件導(dǎo)入AutoDock Tools 1.5.6轉(zhuǎn)化為PDBQT格式，確定活性位點(diǎn)；最后，利用AutoDock Vina進(jìn)行分子對(duì)接，PyMOLWin.exe可視化對(duì)接結(jié)果。

2 結(jié) 果

2.1 CHF核心蛋白 通過GeneCards、STRING數(shù)據(jù)庫和Cytoscape v3.9.0軟件，篩選獲得77個(gè)CHF核心蛋白，詳見圖1。

圖1 CHF核心蛋白的篩選

2.2 黃連素靶蛋白與CHF核心蛋白的交集靶點(diǎn) 以HERB數(shù)據(jù)庫中共獲得91類黃連素靶蛋白，與77個(gè)CHF核心蛋白取交集(見圖2)。利用Cytoscape v3.9.0軟件將黃連素與交集蛋白的關(guān)系進(jìn)行拓?fù)浞治黾翱梢暬?見圖3)。

圖2 黃連素與CHF的交集蛋白韋恩圖

圖3 黃連素與交集蛋白的拓?fù)浞治?/p>

2.3 GO和KEGG富集分析 富集分析表明，GO功能富集分析得到2 070個(gè)功能項(xiàng)(見圖4)，其中BP為1 968個(gè)，主要包括細(xì)胞化學(xué)應(yīng)激反應(yīng)、DNA調(diào)控-結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子活性、炎癥反應(yīng)調(diào)節(jié)等；CC為13個(gè)，主要與囊腔、RNA聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)復(fù)合物、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)復(fù)合物等有關(guān)；MF為89個(gè)，主要涉及細(xì)胞因子活性、信號(hào)受體激活劑活性、受體-配體活性等。KEGG通路富集分析共獲得146條信號(hào)通路(見圖5)，有研究證實(shí)，白細(xì)胞介素(interleukin，IL)17信號(hào)通路[7]、輔助性T細(xì)胞(T helper cell，Th)17細(xì)胞分化通路[8]、晚期糖基化終末產(chǎn)物(advanced glycation end product，AGE)-晚期糖基化終末產(chǎn)物受體(receptor for advanced glycation end products，RAGE)信號(hào)通路[9]、TLR信號(hào)通路、脂質(zhì)與動(dòng)脈粥樣硬化通路[10]、Th1和Th2細(xì)胞分化信號(hào)通路[11]、腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor，TNF)信號(hào)通路[12]、MAPK信號(hào)通路[13]、缺氧誘導(dǎo)因子-1(hypoxia inducible factor-1，HIF-1)信號(hào)通路[14]與CHF相關(guān)。獲取上述信號(hào)通路富集蛋白(見表1)，并將信號(hào)通路與靶點(diǎn)關(guān)系的拓?fù)浞治鼋Y(jié)果可視化(見圖6)。

圖4 交集蛋白的GO功能富集分析

圖5 交集蛋白的KEGG通路富集分析

圖6 通路-靶點(diǎn)拓?fù)浞治?/p>

2.4 核心靶點(diǎn)與藥物有效成分的分子對(duì)接 構(gòu)建信號(hào)通路富集蛋白互作關(guān)系網(wǎng)絡(luò)，圖中紅色節(jié)點(diǎn)代表核心蛋白，即轉(zhuǎn)錄因子p65(transcription factor p65，RELA)、c-fos原癌基因蛋白(c-fos proto-oncogene proteins，F(xiàn)OS)、MAPK14、TNF、IL6、JUN等，藍(lán)色節(jié)點(diǎn)代表相關(guān)蛋白(見圖7)。受體與配體的結(jié)合能<-29.3 kJ/mol表明兩者之間具有強(qiáng)烈的結(jié)合能力[15]，通過分子對(duì)接技術(shù)驗(yàn)證核心蛋白與黃連素之間的對(duì)接精度。結(jié)果表明，靶蛋白與黃連素的結(jié)合能<-29.3 kJ/mol(見表2)。黃連素與核心蛋白構(gòu)建分子對(duì)接模式圖說明黃連素與核心蛋白強(qiáng)烈結(jié)合(見圖8)。

圖7 通路富集蛋白互作關(guān)系網(wǎng)絡(luò)

表2 黃連素與核心蛋白的分子對(duì)接結(jié)合能 單位：kJ/mol

圖8 分子對(duì)接模式圖(A代表黃連素與RELA；B代表黃連素與JUN；C代表黃連素與FOS；D代表黃連素與MAPK14；E代表黃連素與TNF；F代表黃連素與IL6)

3 討 論

已有研究證實(shí)黃連素可改善CHF病人心功能，然而，其介導(dǎo)的心臟保護(hù)作用機(jī)制尚未明確。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是基于分子層面分析黃連素的作用機(jī)制，分子對(duì)接可計(jì)算其與核心蛋白的結(jié)合能。因此，本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接方法，拓展黃連素與CHF的關(guān)系，初步探討其治療CHF的相關(guān)信號(hào)通路及核心靶點(diǎn)。GO功能富集分析表明，黃連素治療CHF主要涉及調(diào)節(jié)細(xì)胞化學(xué)應(yīng)激反應(yīng)、DNA調(diào)控-結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子活性、炎癥反應(yīng)調(diào)節(jié)等功能；KEGG通路富集分析表明，黃連素可能通過調(diào)控IL17信號(hào)通路、Th17細(xì)胞分化通路、AGE-RAGE信號(hào)通路、TLR信號(hào)通路、脂質(zhì)與動(dòng)脈粥樣硬化信號(hào)通路、Th1和Th2細(xì)胞分化信號(hào)通路、TNF信號(hào)通路、MAPK信號(hào)通路、HIF-1信號(hào)通路等抑制CHF的惡化。相關(guān)研究顯示，糖尿病并發(fā)癥中AGE過剩可誘導(dǎo)AGE-RAGE信號(hào)通路激活，促進(jìn)心肌成纖維細(xì)胞增殖和氧化應(yīng)激，從而對(duì)心肌造成損傷及纖維化，嚴(yán)重?fù)p害心肌收縮和舒張功能，導(dǎo)致CHF[9-16]。IL17信號(hào)通路可參與免疫反應(yīng)，通過激活MAPK信號(hào)通路促進(jìn)心室重構(gòu)，有研究顯示，CHF大鼠免疫應(yīng)答平衡受損伴有IL17信號(hào)通路的活化，通過抑制IL17信號(hào)通路，可改善免疫應(yīng)答不平衡，進(jìn)而改善CHF大鼠心臟功能[7]。賴氨酰氧化酶是一種氧化膠原蛋白和彈性蛋白的賴氨酸殘基促進(jìn)相關(guān)纖維性蛋白共價(jià)交聯(lián)的蛋白酶，Th17細(xì)胞通過激活I(lǐng)L17-ERK1/2-活化蛋白1信號(hào)通路促進(jìn)賴氨酰氧化酶表達(dá)，而調(diào)節(jié)性T細(xì)胞可激活I(lǐng)L10-Janus激酶信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子3抑制賴氨酰氧化酶表達(dá)，因此，抑制Th17細(xì)胞分化，調(diào)節(jié)Th17/調(diào)節(jié)性T細(xì)胞平衡可緩解異丙腎上腺素誘導(dǎo)的心肌纖維化、CHF和自身免疫性心肌炎[8]。TLR及下游信號(hào)通路在免疫系統(tǒng)中發(fā)揮重要作用，參與動(dòng)脈粥樣硬化、腦卒中、心肌梗死、缺血再灌注損傷、心室重構(gòu)和CHF的發(fā)生，如s-亞硝基化的肌肉LIM蛋白可刺激TLR3與肌肉LIM蛋白、受體相互作用蛋白激酶3結(jié)合，誘導(dǎo)NOD樣受體熱蛋白結(jié)構(gòu)域相關(guān)蛋白3炎性小體活化，促進(jìn)心肌肥厚；阻斷TLR2活性，從而改善阿霉素和缺血引起的心功能不全和心室重構(gòu)；抑制TLR2和TLR4表達(dá)，可延緩心腎綜合征進(jìn)程[17-19]。冠心病是CHF的潛在重要因素，脂質(zhì)與動(dòng)脈粥樣硬化信號(hào)通路的激活可誘發(fā)冠狀動(dòng)脈微血管循環(huán)障礙、心肌細(xì)胞損傷和僵硬，增加射血分?jǐn)?shù)保留的心力衰竭事件風(fēng)險(xiǎn)[10，20]。CHF過程中腎素-血管緊張素系統(tǒng)的激活可產(chǎn)生大量的血管緊張素Ⅱ，增加Th1細(xì)胞因子γ干擾素的產(chǎn)生，改變Th1/Th2平衡，促進(jìn)炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致心肌組織纖維化和壞死[11]。TNF-α以跨膜TNF-α和可溶性TNF-α形式存在，并通過(tumor necrosis factor，TNF)受體1(TNFR1)和TNF受體2(TNFR2)傳遞信號(hào)，在炎癥過程中，心肌細(xì)胞中TNFR2的蛋白和mRNA表達(dá)水平明顯上調(diào)，跨膜TNF-α通過TNFR2激活絲氨酸/蘇氨酸激酶信號(hào)通路抑制核因子κB信號(hào)通路，發(fā)揮抗心肌肥厚和抗炎作用；可溶性TNF-α在心肌肥厚和CHF中發(fā)揮重要的致病作用，可介導(dǎo)心肌細(xì)胞肥大并引發(fā)促炎細(xì)胞因子IL1β和IL6的進(jìn)一步表達(dá)[12，21]；MAPK信號(hào)通路主要有ERK1/2、p38MAPK和JNK 3條主干，p38MAPK與JNK信號(hào)通路主要涉及心肌細(xì)胞凋亡與分化，ERK1/2信號(hào)通路的激活可促進(jìn)心肌纖維化發(fā)生[13，22-23]；HIF-1信號(hào)通路與血管內(nèi)皮生長因子和促紅細(xì)胞生成素轉(zhuǎn)錄引起的內(nèi)皮功能障礙、平滑肌增殖、炎癥、血管生成、動(dòng)脈粥樣硬化等心血管疾病密切相關(guān)[14]。通過富集蛋白核心篩選、信號(hào)通路-靶點(diǎn)拓?fù)浞治黾胺肿訉?duì)接得到黃連素通過與RELA、JUN、FOS、MAPK14、TNF、IL6等核心蛋白強(qiáng)烈結(jié)合，進(jìn)而調(diào)控上述信號(hào)通路。

4 小 結(jié)

基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析和分子對(duì)接技術(shù)，得到黃連素可能主要通過作用于RELA、JUN、FOS、MAPK14、TNF、IL6等蛋白，調(diào)節(jié)IL17信號(hào)通路、Th17細(xì)胞分化通路、AGE-RAGE信號(hào)通路等，進(jìn)而在CHF治療中發(fā)揮保護(hù)血管內(nèi)皮、縮小心肌梗死面積和改善心功能等作用。黃連素具有多通路、多靶點(diǎn)綜合調(diào)控抑制CHF病理過程的優(yōu)點(diǎn)，該結(jié)果與臨床實(shí)踐及療效預(yù)期一致。本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接技術(shù)預(yù)測黃連素治療CHF所涉及的通路、靶點(diǎn)和結(jié)合能力，存在一定的局限性，需結(jié)合臨床和實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證，以評(píng)價(jià)其安全性和有效性。