劉文銳，瞿惠燕，楊天舒，唐巧林，周 華

心力衰竭是指在多種因素作用下心臟結構和(或)功能發(fā)生異常改變，引起心臟收縮和(或)舒張功能障礙的一組臨床綜合征，是心血管疾病的“最后主戰(zhàn)場”[1]?！吨袊难芙】蹬c疾病報告2020》指出，我國心血管病患病率處于持續(xù)上升趨勢，推算現(xiàn)患病人數達3.3億例，其中心力衰竭約890萬例[2]。目前針對心力衰竭尚無特異性的西藥，且西藥作用靶點常以某個單一靶點為主，中藥復方可緩解心力衰竭臨床癥狀，從多途徑、多靶點、多通路干預心室重構，具有廣闊的應用前景[3]。

丹參飲首載于陳修園之《時方歌括》卷下，原方由丹參、砂仁、檀香3味中藥組成，主治心腹諸痛，具有行氣活血、化瘀止痛之功效。丹參飲廣泛應用于治療冠心病、心絞痛、心肌缺血等心血管疾病和慢性萎縮性胃炎、消化性潰瘍等胃腸道疾病[4]?，F(xiàn)代研究表明，丹參飲具有減輕心肌細胞缺血再灌注損傷[5]、抗冠狀動脈粥樣硬化[6]、保護內皮細胞[7]、抗心肌纖維化[8]、抑制心肌細胞凋亡[9]等作用。

網絡藥理學利用大數據平臺將生物網絡與其他學科交叉融合，從整體闡述藥物與疾病之間的有機聯(lián)系，體現(xiàn)了中醫(yī)整體觀念的思想，為研究中藥復方提供了一種方法[10]。本研究采用網絡藥理學方法探討丹參飲治療心力衰竭的潛在作用機制，為今后丹參飲的研究提供了思路。

1 資料與方法

1.1 丹參飲活性化合物及靶點篩選 通過TCMSP數據庫(https://tcmspw.com/tcmsp.php)檢索丹參、砂仁和檀香的活性成分。篩選條件為口服生物利用度(OB)≥30%、類藥性(DL)≥0.18。將納入的活性化合物通過TCMSP數據庫進行成分的靶點預測，所有靶點經UniProt數據庫(https://www.uniprot.org/)校正，去掉非人類靶點。

1.2 心力衰竭靶點基因的篩選 以“heart failure”為關鍵詞，在GeneCards數據庫(https://www.genecards.org/)、NCBI基因數據庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)及OMIM數據庫(https://www.omim.org/)進行人類基因檢索。其中，GeneCards數據庫獲得的靶點將得分進行中位值篩選以獲得相關的靶點。利用韋恩圖制作軟件Venny 2.1得到丹參飲活性成分與心力衰竭的共有靶點。

1.3 丹參飲“中藥-成分-靶點”蛋白-蛋白互作(PPI)網絡構建 將藥物疾病共有靶點輸入STRING數據庫(https://string-db.org/cgi/input.pl)進行PPI網絡的構建，將生物種類設定為“Homo sapiens”，得到PPI網絡。將PPI網絡導入Cystoscape 3.8.0中，運用NetworkAnalyzer工具進行拓撲分析，通過度值(Degree)排序，選取分值大于平均分的基因作為關鍵靶點。打開MCODE模塊進行基因簇的分析以及核心靶點的篩選。

1.4 治療靶點的基因本體(GO)功能富集分析及京都基因與基因組百科全書(KEGG)通路富集分析 將藥物疾病共有靶點進行GO的生物過程(biological process，BP)、分子功能(molecular function，MF)、細胞組分(cell component，CC)富集分析和KEGG通路富集分析，引用STRING數據庫，將校正P值<0.05的項目進行篩選。最后將成分-疾病-通路-靶點網絡文件導入Cytoscape 3.8.0進行通路網絡圖的繪制，直觀展示中藥活性成分在治療心力衰竭過程中的多成分、多靶點的作用特點。

2 結 果

2.1 丹參飲有效活性化合物 通過TCMSP數據庫篩選活性化合物，篩選條件為OB≥30%、DL≥0.18，共得到78個活性化合物，其中丹參65個、砂仁10個、檀香3個，活性化合物相應靶點264個。其中丹參活性化合物包括1，2，5，6-四氫丹參酮、茯苓甾醇、多孔司特-5-烯-3β-醇、脫氫蒽酮ⅡA、黃芩苷、木犀草素等；檀香活性化合物包括異鼠李素、木犀草素、異牡荊黃素；砂仁活性化合物包括24-乙基膽甾醇-4-烯-3-酮、多孔司特-5-烯-3β-醇、谷甾醇醋酸酯、β谷甾醇、豆甾醇、維生素E等。丹參飲主要活性成分基本信息見表1。

表1 丹參飲的主要活性成分

(續(xù)表)

(續(xù)表)

2.2 丹參飲治療心力衰竭的潛在作用靶點 通過GeneCards數據庫、NCBI基因數據庫及OMIM數據庫獲取心力衰竭靶點，其中，GeneCards數據庫獲得1 495個相關靶點，NCBI數據庫獲得1 296個相關靶點，OMIM數據庫獲得143個相關靶點。將這3個數據庫的基因合并刪除之后，得到2 273個心力衰竭相關基因。將篩選出的丹參飲活性化合物靶點與心力衰竭靶點輸入韋恩圖制作軟件Venny 2.1，得到86個共有靶點。詳見圖1。

圖1 丹參飲治療心力衰竭潛在靶點的韋恩圖

2.3 “丹參飲有效成分-心力衰竭-關鍵靶點”PPI網絡構建與分析結果 將藥物-疾病共有靶點輸入STRING

數據庫，得到PPI網絡，該網絡中有86個節(jié)點、1 002條邊，平均度值為23.3。詳見圖2、圖3。圖3中的節(jié)點顏色和大小根據度值調整，節(jié)點越大，顏色越紅，度值越大，線粗到細表示邊介數(edge betweenness)從大到小?；赑PI網絡進行拓撲分析，共篩選出36個關鍵靶點蛋白，其中，居前20位關鍵靶點蛋白為蛋白激酶B(AKT1)、白細胞介素-6(IL6)、表皮生長因子受體(EGFR)、胱天蛋白酶3(CASP3)、熱休克蛋白90α家族A類成員1(HSP90AA1)、低聚果糖(FOS)、過氧化物酶體增殖物激活受體(PPARG)、環(huán)氧合酶2(PTGS2)、雌激素受體α(ESR1)、c-Jun氨基末端激酶(JUN)、重組人信號轉導與轉錄激活因子3(STAT3)、基質金屬蛋白酶9(MMP9)、MYC、酪氨酸激酶受體2(ERBB2)、人內皮型一氧化氮合酶(NOS3)、細胞周期素D1重組蛋白(CCND1)、核因子κB抑制蛋白α重組蛋白(NFKBIA)、胱天蛋白酶8(CASP8)、糖原合成酶激酶-3(GSK3B)、白細胞介素-10(IL10)，詳見圖4。通過MCODE模塊進行基因簇分析和核心靶點的篩選，共得到3個基因簇和3個核心基因，核心基因為DRD2、PTPN1、IL10，詳見表2和圖5。

圖2 丹參飲治療心力衰竭潛在靶點的PPI網絡圖(STRING網站)

圖3 丹參飲治療心力衰竭潛在靶點的PPI網絡圖(Cytoscape軟件)

圖4 PPI網絡拓撲分析靶點排序(居前20位)

表2 MCODE聚類分析詳細信息

圖5 MCODE聚類分析核心基因簇

2.4 GO功能富集分析和KEGG通路富集分析 GO功能富集分析共富集到1 900條生物過程、106項分子功能、54項細胞組分。涉及的主要生物過程包括血液循環(huán)調節(jié)、血管直徑調節(jié)、血管收縮調節(jié)、上皮細胞增殖調控、活性氧代謝過程、凋亡信號調控、DNA結合轉錄因子活性的調控、腎上腺素能受體信號通路、平滑肌細胞增殖的調控；涉及的主要細胞組分包括膜、膜筏、突觸前膜、突觸后膜、線粒體外膜、囊泡、蛋白激酶復合物等；涉及的分子功能包括G蛋白偶聯(lián)胺受體活性、泛素樣蛋白連接酶結合、核受體活性、配體激活轉錄因子活性、細胞因子受體結合、DNA轉錄因子結合、類固醇激素受體、生長因子受體結合、腎上腺素能受體結合、核轉錄因子(NF)-κB結合等。詳見圖6、圖7。

圖6 丹參飲治療心力衰竭潛在核心靶點的GO富集分析柱狀圖

圖7 丹參飲治療心力衰竭潛在核心靶點的GO富集分析氣泡圖

對KEGG通路富集分析，依據校正P值<0.05，共富集到165條丹參飲治療心力衰竭的信號通路，將其中富集顯著的20條信號通路繪制成柱狀圖和氣泡圖。20條信號通路包括脂質與動脈粥樣硬化、內分泌抵抗、乙型肝炎、化學致癌-受體激活、人巨細胞病毒感染、大腸癌、IL17信號通路、前列腺癌、卡波西肉瘤相關皰疹病毒感染、糖尿病并發(fā)癥中的晚期糖基化終末產物-糖基化終產物受體(AGE-RAGE)信號通路、癌癥中的蛋白多糖、膀胱癌、松弛素信號通路、缺氧誘導因子-1(HIF-1)信號通路、弓形蟲病、非小細胞肺癌、利什曼病、愛潑斯坦-巴爾病毒感染、恰加斯病、PI3K-Akt等信號通路。詳見圖8、圖9。

圖8 丹參飲治療心力衰竭潛在核心靶點的KEGG通路分析柱狀圖

圖9 丹參飲治療心力衰竭潛在核心靶點的KEGG通路分析氣泡圖

2.5 丹參飲活性成分-心力衰竭-通路-靶點網絡圖構建 運用Cytoscape 3.8.0進行通路網絡圖的繪制，直觀展示中藥活性成分在治療心力衰竭過程中的多成分、多靶點的作用特點。詳見圖10。

圖10 丹參飲活性成分-心力衰竭-通路-靶點網絡圖(藍色為丹參飲活性化合物，黃色為丹參飲活性化合物作用于心力衰竭的靶點，綠色為最顯著的前20條通路，紅色為疾病即心力衰竭，紫色為中藥)

3 討 論

心力衰竭歸屬于中醫(yī)學“心水病”范疇，為本虛標實之證，主要病機為氣虛血瘀[11]。丹參飲為臨床治療氣虛血瘀證的常用方劑，丹參飲中丹參活血而補血，《名醫(yī)別錄》記載：“丹參養(yǎng)血，去心腹痼疾結氣”，故有丹參一味功同四物之說；砂仁醒脾開胃，中州健運則氣血生化有源；檀香行氣活血，祛瘀生新，瘀血不去則新血不生。臨床研究表明，丹參飲聯(lián)合常規(guī)西藥治療慢性肺源性心臟病心力衰竭能提高病人心功能，改善生活質量[12]。目前丹參飲作用于心力衰竭的靶點和通路尚不明確，因此本研究通過網絡藥理學探討丹參飲治療心力衰竭的作用機制，將為今后的研究奠定基礎。

PPI網絡拓撲分析顯示，丹參飲治療心力衰竭的核心靶點有20個，居前5位度值最高分別是AKT1、IL6、EGFR、CASP3、HSP90AA1。AKT信號可促進細胞生長、增殖和生存[13]。AKT1信號的持續(xù)激活將誘發(fā)廣泛的心臟肥大，導致心臟嚴重的收縮功能障礙，進而加重心力衰竭發(fā)生和發(fā)展[14]。IL6作為一種炎性細胞因子，可促進心肌細胞增殖，進而刺激心肌細胞外基質的合成，并通過增強炎癥信號通路傳導，加重心室重構程度[15]。EGFR是位于細胞膜表面且有酪氨酸激酶活性的糖蛋白受體，具有調節(jié)細胞增殖、抗炎、抗氧化信號傳導的功能[16]。有研究顯示，血管緊張素Ⅱ通過EGFR活化促進體內心臟肥大發(fā)展[17]。CASP3參與細胞凋亡途徑，可促使心肌細胞中肌鈣蛋白的降解，心肌細胞發(fā)生凋亡，導致心臟收縮功能逐漸喪失[18-19]。

GO功能富集分析可知丹參飲治療心力衰竭主要與血管的調節(jié)、細胞凋亡、細胞增殖、能量代謝等生物過程有關。細胞組分主要以膜結構為主，推測丹參飲發(fā)揮治療作用的關鍵機制為干預人體神經-體液機制。KEGG通路富集結果顯示，丹參飲治療心力衰竭的相關通路包括IL17、AGE-RAGE、松弛素、HIF-1、PI3K-Akt等。IL17是一種親炎細胞因子，由T輔助細胞、巨噬細胞、樹突狀細胞、自然殺傷細胞等合成，可促進誘導型一氧化氮合酶(iNOS)表達，進而引起心肌細胞凋亡，同時激活基質金屬蛋白酶，致使心肌細胞外基質合成增加，導致心肌纖維化發(fā)生[20-21]，在心力衰竭中發(fā)揮著重要作用，IL17水平隨著心功能的惡化而升高[22]。AGE-RAGE信號通路是導致糖尿病心肌病的常見信號通路，有研究表明，AGEs/RAGE水平與心肌纖維化呈正相關[23-24]，AGE-RAGE可刺激人體腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)(RAAS)激活、NF-κB炎性因子、轉化生長因子β1(TGF-β1)致纖維化因子的產生，加速心肌纖維化進程，從而加重心力衰竭[25-26]。松弛素是一種肽類激素，具有擴張血管、保護心臟細胞的作用，通過激活多個信號轉導通路，抑制炎癥和肌纖維細胞激活，發(fā)揮抗纖維化的作用[27-29]。有研究發(fā)現(xiàn)，松弛素家族胰島素樣肽6(INSL6)抑制血管緊張素Ⅱ導致的心臟收縮功能障礙和心臟纖維化，延緩心力衰竭發(fā)生[30]。HIF-1是調控缺氧反應的重要轉錄因子，HIF-1α是HIF-1的調節(jié)和功能亞基，通過調節(jié)血管新生、調控氧代謝和糖代謝，從而達到抗心肌缺氧及改善心肌代謝的目的[31-32]。射血分數正常的心力衰竭病人病情嚴重程度和不良預后與血清HIF-1α水平呈正相關[33]。PI3K-Akt信號通路是調節(jié)心肌肥厚的重要靶點通路，通過調節(jié)血管形成、細胞凋亡、氧化應激等過程參與心室重構[34]。有研究發(fā)現(xiàn)，PI3K-Akt信號通路的磷酸化可影響相關凋亡蛋白表達，從而降低心肌細胞凋亡，改善心功能[35-36]。

綜上所述，本研究通過網絡藥理學方法對丹參飲治療心力衰竭的靶點和通路進行了初步探討，證實了丹參飲多途徑、多靶點治療心力衰竭的特點，為丹參飲治療心力衰竭提供了理論依據，同時為今后的研究指明了方向，但仍需動物實驗進一步驗證結果。