杜江 梁國標△ 彭顯月 付梓峰 樂俊鈞 李泰 李浩 梁天才 杜洋 趙法亮 王遠亮

(1.遵義醫(yī)科大學附屬醫(yī)院泌尿外科，貴州 遵義 563000；2.遵義醫(yī)科大學附屬醫(yī)院甲狀腺乳腺外科，貴州 遵義 563000)

腎透明細胞癌(clear cell renal cell carcinoma,ccRCC)是腎癌最主要的病理類型，手術(shù)切除腫瘤是ccRCC現(xiàn)今最主要的治療手段。目前尚無公認的腫瘤標記物以供臨床早癌篩查，約25%～30%的患者在確診時已經(jīng)發(fā)生轉(zhuǎn)移，其5年生存率顯著下降[1]。2019年NCCN(美國國家癌癥綜合網(wǎng)絡(luò))發(fā)布了最新的腎癌臨床診療指南中，阿西替尼等靶向藥物已被納入晚期腎癌的一線治療方案。在晚期腎癌靶向治療的新時代背景下，深入腎癌的發(fā)病機制研究，尋找更優(yōu)的治療靶點對推進靶向治療有著重要意義。在我們的前期研究中，發(fā)現(xiàn)SPRED2(Sprouty related proteins with an EVH 1 domain 2)在ccRCC發(fā)展過程中可能發(fā)揮抑癌作用，并具備成為新腫瘤標記物或治療靶點的潛在可能。

1 材料與方法

1.1標本的收集與處理 本課題中的前期實驗標本，選取于我院于2010年2月至2017年10月期間施行手術(shù)的患者；近期實驗標本取材于手術(shù)后的新鮮組織，其中包括正常腎組織、ccRCC癌組織及癌旁組織各9例。新鮮標本組織放置于液氮保存液中，并轉(zhuǎn)入-80℃冰箱內(nèi)保存。實驗中所納入的樣本在術(shù)后病理明確診斷為腎透明細胞癌，在近期均未接受過任何藥物及放射治療；癌旁組織取自于癌組織周圍2 cm以內(nèi)，且未發(fā)生壞死或癌變的組織；相對正常腎組織標本取自正常腎臟在外傷后進行腎臟切除或腎臟良性病變的患者。

1.2主要試劑 SPRED2及LC3抗體購自英國Abcam公司；SPRED2及LC3II抗體購自北京博奧公司；GAPDH抗體及SDS-PAGE凝膠配制試劑盒等購自碧云天公司；全蛋白提取及BCA蛋白濃度測定試劑盒購自凱基公司；免疫組化相關(guān)試劑購自北京中杉金橋公司。

1.3免疫組化檢測 組織切片制備：制備4 μm厚石蠟組織切片。脫蠟、脫水：室溫下，將石蠟切片置于二甲苯中浸泡，再經(jīng)梯度酒精脫水后漂洗；封閉：滴加3% H2O2進行封閉處理；抗原修復：用檸檬酸鈉進行抗原修復；顯色及染色：先后滴加5%BSA及滴加稀釋好的一抗，4℃冰箱過夜。取出恢復室溫后進行漂洗，并滴加二抗后再次孵育；DAB顯色；封片：脫水后用樹脂進行封片，用于顯微鏡觀察。

1.4Western-blot檢測 將樣本組織研磨成粉末后加入蛋白裂解液，震蕩使其充分裂解后離心，收集上清液；BCA法測上清蛋白的濃度按比例混合蛋白樣品與上樣緩沖液后，加熱使蛋白變性后冷卻至室溫；配膠：根據(jù)SPRED2及LC3蛋白的分子量配置10 % SDS-PAGE凝膠；電泳、切膠體及轉(zhuǎn)膜：待電泳結(jié)束后，切下待檢測蛋白條帶，將凝膠帶的PVDF膜放入甲醇中浸泡后，與濾紙層一同放入轉(zhuǎn)膜液中浸泡，以恒定電流轉(zhuǎn)膜；轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，將PVDF膜浸入封閉液中30 min，再用PBST洗膜，并加入稀釋后的一抗，4℃冰箱過夜。加入二抗后，37℃孵育；顯色、曝光后，采集圖像，并對結(jié)果進行灰度分析。

1.5統(tǒng)計學方法 運用GraphPad Prism 7.0，對所獲數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學處理，組間比較采用單因素方差分析；P<0.01或P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

在前期實驗中，通過免疫組織化學法檢測SPRED2及LC3在各組織中的基本表達情況，SPRED2及LC3蛋白主要定位于細胞膜和胞漿，以細胞膜為主(見圖1、2)。進一步通過Western-blot檢測SPRED2在各組織中的表達含量，SPRED2在癌組織、癌旁組織及正常腎組織中的表達水平分別為(0.52±0.24)、(0.86±0.30)及(1.47±0.55)。SPRED2在正常腎組織中的表達含量顯著高于ccRCC癌旁組織及癌組織，在癌旁組織中的表達水平明顯高于癌組織(見圖3)；LC3在癌組織、癌旁組織及正常腎組織中的表達水平分別為(1.34±0.40)、(0.72±0.32)及(0.33±0.12)。LC3在正常腎組織中的表達水平顯著低于癌旁組織及癌組織，在癌旁組織中的表達水平明顯低于癌組織(見圖3)。

注：a.陰性對照;b.正常腎組織;c.癌組織;d.癌旁組織。圖1 SPRED2在正常腎組織、ccRCC癌組織及癌旁組織中的表達情況(IHC，×400)

注：a.陰性對照;b.正常腎組織;c.癌組織;d.癌旁組織。圖2 LC3II在正常腎組織、ccRCC癌組織及癌旁組織中的表達情況(IHC，×400)

圖3 圖a、c是通過Western-blot檢測SPRED2在正常腎組織、ccRCC癌旁組織及癌組織中的表達情況(*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001)；圖b、d 是通過Western-blot檢測LC3II在正常腎組織、ccRCC癌旁組織及癌組織中的表達情況(*P<0.05；**P<0.01；****P<0.001)。

3 討 論

據(jù)2018年全球癌癥統(tǒng)計，腎癌新增患者例數(shù)超過40萬，死亡例數(shù)超過10萬，發(fā)病率及死亡率呈逐年上升趨勢[2]。腎癌作為一種多基因相關(guān)腫瘤，至今發(fā)病機制未明，尚無針對病因的有效救治手段。近年，SPRED2作為的一個被新發(fā)現(xiàn)的抑癌蛋白受到廣泛關(guān)注。它作為一類與Sprouty蛋白相關(guān)的細胞膜蛋白，能夠降低Ras/ERK信號調(diào)控通路的傳導活性，進而對腫瘤細胞的生長產(chǎn)生抑制作用；并且，能夠在不抑制Ras激活的狀態(tài)下，調(diào)低Raf-1的表達，從而發(fā)揮對生長因子等的負向調(diào)控功能[3-4]。SPREDs家族蛋白有三個成員，包括：SPRED1、SPRED2及SPRED3；其中，SPRED2在全身多器官中均有表達。SPRED2蛋白分子結(jié)構(gòu)主要由以下三個部分組成，分別是EVH 1同源結(jié)構(gòu)域，KBD結(jié)構(gòu)域及Sprouty相關(guān)蛋白結(jié)合區(qū)域[3]。

目前，已有多項研究結(jié)果表明，SPRED2表達水平的高低與多種腫瘤發(fā)展進程關(guān)系緊密。例如，在肝細胞癌發(fā)展過程中，上調(diào)SPRED2表達能夠提升凋亡標志蛋白caspase-3的表達水平并抑制腫瘤細胞的增殖和遷移[5]。K.Jiang等[6]在宮頸癌及肺癌的研究中另有新的發(fā)現(xiàn)，高表達的SPRED2能夠激活自噬標志蛋白LC3(microtubule-associated protein light chain 3)活性，并加速其轉(zhuǎn)換，促進生成更多自噬溶酶體，從而誘導腫瘤細胞自噬性死亡。在前列腺癌中，SPRED2通過阻斷了ERK調(diào)控通路的磷酸化，從而阻礙前列腺癌細胞增殖及轉(zhuǎn)移[7]。有研究[8]進一步發(fā)現(xiàn)，在BRAFV600E基因突變的人黑色素瘤細胞中，SPRED1/2通過調(diào)低Ras/PI3K/AKT通路傳導活性，誘導腫瘤細胞凋亡。PI3K/AKT調(diào)控通路的主要作用是，參與血管的生成、凋亡及自噬[9-11]。還有研究[12]表明，SPRED2通過調(diào)節(jié)Rho蛋白的活性，進而對腫瘤細胞的運動和轉(zhuǎn)移產(chǎn)生抑制。在結(jié)腸癌中，SPRED2的表達降低，能夠激活MAPK通過活性，促進腫瘤轉(zhuǎn)移[13]。在最新的研究中，有日本學者再次證實SPRED2通過抑制MAPK傳導通路活性，從而影響肺纖維化[14]。有國內(nèi)學者在結(jié)腸癌中發(fā)現(xiàn)，SPRED2的表達水平升高，直接影響了ERK通路活性，導致結(jié)腸癌細胞的上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)受到抑制[15]，眾所周知，EMT與腫瘤進展關(guān)系密切[16]。在心肌細胞的研究中發(fā)現(xiàn)，SPRED2的缺乏能夠抑制自噬，導致心功能不全及惡性心率失常[17]。綜上可見，SPRED2在不同的細胞中調(diào)控功能不同，對不同腫瘤的進展過程有著不同的負向調(diào)控分子機制，尚無相關(guān)文獻報道其在ccRCC中發(fā)揮的具體作用及分子調(diào)控機制。并且，近年有學者提出，SPRED2通過調(diào)控LC3蛋白的活化，從而調(diào)節(jié)腫瘤細胞的自噬程序。因此，為進一步探討SPRED2在ccRCC中具體發(fā)揮的生物學作用及與LC3之間存在的何種關(guān)系，我們對SPRED2及LC3在ccRCC中的表達情況進行了初步實驗，通過免疫組化及Western blot檢測正常腎組織、ccRCC癌組織及癌旁組織中SPRED2的表達情況。

在前期實驗中，我們通過免疫組化對SPRED2及LC3II在各組織中的表達進行定位檢測；在近期，通過Western blot對各組織中SPRED2及LC3的含量進行定量后發(fā)現(xiàn)，SPRED2在正常腎組織中的表達含量明顯高于ccRCC癌旁組織及癌組織，在癌組織中的表達水平最低；而LC3在正常腎組織中的表達含量明顯低于癌旁組織及癌組織，在癌旁組織中的表達含量又明顯低于癌組織。SPRED2在正常腎組織中表達含量最高，可能代表該抑癌因子在正常腎組織中的基礎(chǔ)表達含量；隨著腫瘤發(fā)生進展，從癌旁組織到癌組織，其表達含量逐漸降低，隨著這種保護因子被不斷消耗，機體對抗癌細胞侵襲的能力也隨之被削弱。由此推測，在ccRCC進展過程中，SPRED2可能發(fā)揮抑癌作用。LC3是細胞自噬發(fā)生的標志蛋白，其正常腎組織中的表達含量較低，說明在此階段細胞自噬程序可能處于休眠狀態(tài)；隨著腫瘤不斷進展，從癌旁組織向癌組織轉(zhuǎn)變過程中，細胞內(nèi)壓力不斷蓄積，自噬被激活，故LC3的含量逐漸升高。在ccRCC中，細胞自噬是否被激活并帶來保護作用，有待進一步驗證。此外，我們發(fā)現(xiàn)，LC3在ccRCC癌組織中的表達含量最高，而SPRED2在其中的表達含量最低，兩者的表達趨勢相反；說明在ccRCC進展過程中兩者可能不存在協(xié)同關(guān)系，自噬通路可能并未受到SPRED2表達的影響，而細胞凋亡可能是SPRED2影響ccRCC進展的主要因素。這為我們下一步實驗指引方向。