楊成超

(遼寧省楊樹研究所，遼寧 營口 115213)

溫度是決定植物地域分布的主要限制因子，全世界每年因低溫對植物造成的經(jīng)濟(jì)損失達(dá)數(shù)十億元。楊樹是多年生木本植物，較早完成基因組測序，是開展抗寒分子機(jī)理研究的模式樹木，是耐凍融分子機(jī)制研究的理想材料。楊樹凍融傷害分為可逆凍融傷害和不可逆凍融傷害，有效凍融傷害的累積效應(yīng)是楊樹越冬死亡的主要原因[1，2]。楊樹具有在可逆凍融傷害后自我修復(fù)的能力是其最終能從冬季嚴(yán)寒中存活下來的關(guān)鍵，楊樹抗寒分子機(jī)理研究對楊樹抗寒育種具有重要意義。

楊樹響應(yīng)低溫脅迫分為幾個階段：信號感知(signal perception)、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)(transduction)、次級信號(Secondary signals)和靶基因響應(yīng)(target-responses)等。近20年來，樹樹抗寒機(jī)理研究進(jìn)展緩慢，主流觀點是20世紀(jì)的細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和功能傷害及活性氧導(dǎo)致的氧化性損傷。一般認(rèn)為，細(xì)胞膜最先感知到環(huán)境溫度變化，將信號傳遞到胞內(nèi)。此外，組蛋白激酶、鈣離子通道及磷脂酶等都可能扮演著次級溫度感受器的角色。研究人員長期專注于抗凍鍛煉階段冷脅迫和零下輕度凍脅迫的冷信號感知及冷信號傳導(dǎo)機(jī)制研究，例如Chen J等[3]對4 ℃和-4 ℃處理的胡楊(Populuseuphratica)葉片的轉(zhuǎn)錄組研究和Yang X Y 等[4]對4 ℃處理的毛白楊(P.tomentosa)葉片的轉(zhuǎn)錄組研究，而對較低溫度(如-40 ℃)凍脅迫階段的研究未見報道。

1 楊樹細(xì)胞外和細(xì)胞內(nèi)冰點精確測定

楊樹凍害指冰點以下低溫造成的傷害。冰點分為胞外冰點和胞內(nèi)冰點。研究表明，胞外冰點可能造成細(xì)胞損傷，但一般不致死，而胞內(nèi)結(jié)冰會造成細(xì)胞死亡。另外，有效凍融傷害的累積超過抗凍融度，也會造成組織死亡[1]。因此，要研究楊樹可逆凍融傷害修復(fù)，首先要精確測定胞外冰點和胞內(nèi)冰點溫度，然后是有效凍融傷害的閾值[2]。

當(dāng)前的楊樹抗寒評價技術(shù)主要是測定相對電導(dǎo)率、丙二醛、脯氨酸、可溶性糖等生理指標(biāo)。根據(jù)相對電導(dǎo)率確定的半致死溫度不是細(xì)胞冰點，現(xiàn)在缺乏可精確測定細(xì)胞冰點的新技術(shù)來確定楊樹在抗寒鍛煉期、深度休眠期和脫鍛煉期胞外和胞內(nèi)冰點。該項技術(shù)研究將為楊樹抗寒性精確評價和凍融傷害修復(fù)分子機(jī)理研究奠定基礎(chǔ)。

2 凍融傷害修復(fù)與膜再密封

洋蔥表皮蛋白質(zhì)組學(xué)[5]和菠菜葉靶標(biāo)蛋白研究[6]是已開展的2個與凍融修復(fù)相關(guān)的典型研究。組織的凍融傷害修復(fù)程度通過融化后離子滲出率的減少、光合系統(tǒng)Ⅱ的光合效率恢復(fù)、抗氧化酶激活或者活性氧的損耗來評估。組織化學(xué)染色表明，在菠菜葉凍融傷害修復(fù)期間受傷害組織活性氧的累積或它們被減少的強(qiáng)度同損耗修復(fù)一致。

蛋白和基因的豐度直接或間接與膜聯(lián)蛋白離子平衡相關(guān)，受傷害組織的橫跨膜水通道蛋白減少，但在融化后修復(fù)。修復(fù)期間，K+流或離子平衡可能被14-3-3蛋白和膜聯(lián)蛋白控制，細(xì)胞膜中驅(qū)動橫跨膜K+運(yùn)輸?shù)腍+-ATPase是14-3-3對細(xì)胞膜整合和激活的主要目標(biāo)[7]。也就是說，14-3-3蛋白能激活向內(nèi)的K+通道[8]。通過離子平衡和氧化脅迫的改善，鈣磷脂結(jié)合蛋白能夠促進(jìn)凍融傷害修復(fù)，值得研究。

膜再密封策略在膜凍融傷害修復(fù)過程中是可行的。在植物細(xì)胞背景下，凍害誘導(dǎo)的囊泡已被用親脂的熒光染料和共聚焦低溫顯微鏡觀察到。Ca2+通過細(xì)胞膜上的穿孔點從細(xì)胞外間隙流入，最終導(dǎo)致冰凍誘導(dǎo)的囊泡經(jīng)由Ca2+綁定突觸結(jié)合蛋白進(jìn)行融合和細(xì)胞膜傷害點的再密封。這表明細(xì)胞外Ca2+提高原生質(zhì)體或未損傷葉細(xì)胞的耐凍性和抗電穿孔能力是膜保護(hù)而不是膜穿孔的象征[9]。當(dāng)前，楊樹還沒有開展凍融傷害后的質(zhì)膜修復(fù)分子機(jī)理研究。

3 CBF/DREB調(diào)節(jié)

在林木抗寒性調(diào)控及響應(yīng)機(jī)制方面，發(fā)現(xiàn)了CBF/DREB低溫信號調(diào)節(jié)途徑及相關(guān)轉(zhuǎn)錄子。其中，在楊樹[10]、藍(lán)桉(Eucalyptusglobulus)[11]、葡萄(Vitisvinifera)[12]等分離鑒定出CBF直系同源基因。CBF/DREB系統(tǒng)誘導(dǎo)抗寒基因表達(dá)所編碼的防凍蛋白，對保護(hù)植物細(xì)胞免于低溫脅迫傷害很重要。例如，楊樹CBF調(diào)節(jié)因子CBF1、CBF2和CBF3表達(dá)誘導(dǎo)物ICEl在冬季休眠芽中上調(diào)了391倍，抗寒性增強(qiáng)。

4 轉(zhuǎn)錄調(diào)控

轉(zhuǎn)錄組可定量分析生物受外界環(huán)境影響的各基因表達(dá)的變化，主要檢測的是生物體RNA水平的基因表達(dá)量。Chen 等[3]將2年生胡楊分別置于4 ℃和-4 ℃處理6 h后，使用Solexa測序技術(shù)對其葉片做轉(zhuǎn)錄物組測序。Wang等[13]鑒定了茶樹(Camelliasinensis)在自然越冬條件下抗凍鍛煉后差異表達(dá)基因，包括低溫應(yīng)答基因、質(zhì)膜穩(wěn)定基因、滲透應(yīng)答基因等。上述研究表明，抗凍性強(qiáng)的胡楊關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄成分主要與ABA及鈣信號傳導(dǎo)相關(guān)，而在抗凍性較弱的茶樹中碳水化合物代謝途徑和鈣信號通路相關(guān)基因起主要作用。

小RNAs通過降解mRNA、抑制翻譯和修飾染色質(zhì)誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄后基因沉默，在植物脅迫響應(yīng)過程中發(fā)揮著重要作用[14]。Lu等[15]通過構(gòu)建楊樹脅迫處理前后的小RNA文庫，成功鑒定19個冷響應(yīng)miRNAs，其中miR397等低溫上調(diào)，miR156g-j等低溫下調(diào)。Chen等[16]也在楊樹中鑒定了脅迫響應(yīng)相關(guān)的miRNAs。但目前有關(guān)小RNAs調(diào)控基因表達(dá)及產(chǎn)生抗逆性的具體分子調(diào)控機(jī)制還不明確，須進(jìn)一步研究。

長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA，lncRNA)是指長度大于200個核苷酸、不具備蛋白編碼功能的RNA。應(yīng)用深度測序和生物信息學(xué)分析，在擬南芥、水稻、番茄等中鑒定了數(shù)千種lncRNAs[17]。在lncRNA響應(yīng)低溫脅迫功能研究方面，模式植物擬南芥取得進(jìn)展，在其基因組的低溫敏感區(qū)域鑒定了一個叫SVALKA的lncRNA，SVALKA的突變會影響CBF1基因的表達(dá)和植物的冷害抗性[18]。但大多數(shù)lncRNA的生物學(xué)功能還不清楚。在楊樹方面，主要研究了lncRNA在毛白楊木材形成[19]中的作用、lncRNA/circRNA-miRNA-mRNA網(wǎng)絡(luò)調(diào)節(jié)楊樹根和莖頂端分生組織的發(fā)育[20]、IAA響應(yīng)的毛白楊lncRNA基因甲基化和生長發(fā)育[21]、小葉楊非編碼RNA甲基化調(diào)節(jié)非生物脅迫基因表達(dá)[22]。lncRNA調(diào)控楊樹凍融傷害方面未見報道。

5 CRISPR/Cas9技術(shù)

CRISPR/Cas9技術(shù)是基于細(xì)菌體內(nèi)的獲得性免疫機(jī)制改造而成，可通過一條單鏈的單向?qū)NA(sgRNA)來識別特定DNA序列，并引導(dǎo)Cas9核酸內(nèi)切酶剪切DNA雙鏈[23]。該技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于細(xì)菌、酵母和動物的基因組編輯中[24]，而且，李然等利用CRISPR/Cas9技術(shù)對番茄lncRNA1459進(jìn)行了編輯，獲得了lncRNA1459的功能缺失突變體[25]。這說明，CRISPR/Cas9技術(shù)可以用于lncRNA基因功能研究。

CRISPR/Cas9系統(tǒng)具備同時快速高效地敲除多個內(nèi)源基因的優(yōu)勢。利用改良的CRISPR/Cas9多靶點載體系統(tǒng)[26]，在楊樹體內(nèi)同時表達(dá)Cas9蛋白和多個針對八氫番茄紅素脫氫酶基因的sgRNA，在楊樹體內(nèi)實現(xiàn)了對內(nèi)源基因的高效定點敲除，獲得穩(wěn)定的基因定點敲除的突變體株系[27]。CRISPR/Cas9系統(tǒng)在楊樹功能基因研究和遺傳改良中具有廣泛的應(yīng)用前景。

6 DNA修復(fù)

DNA修復(fù)是細(xì)胞對DNA受損傷后的一種反應(yīng)，這種反應(yīng)可能使DNA結(jié)構(gòu)恢復(fù)原樣，重新執(zhí)行它原來的功能，使細(xì)胞能繼續(xù)生存。如果細(xì)胞不具備這種修復(fù)功能，就無法應(yīng)對經(jīng)常發(fā)生的DNA損傷事件，就不能生存，所以研究DNA修復(fù)是探索生命的一個重要課題。David R. Liu發(fā)明了堿基編輯器，首先借助CRISPRi篩選發(fā)現(xiàn)多種促進(jìn)C-G編輯的因子，在此基礎(chǔ)上構(gòu)建出的新CGBEs的編輯效果有明顯提升[28]，使DNA人工修復(fù)成為可能。楊樹在抗寒性分子機(jī)理方面還沒有開展DNA修復(fù)研究。

7 問題與展望

在楊樹基因組測序完成的背景下，楊樹抗寒分子機(jī)理研究思路從單一基因或蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)向同時對多個基因或蛋白質(zhì)功能的系統(tǒng)發(fā)掘。凍融傷害作為數(shù)量性狀，受到多基因、多水平的協(xié)同調(diào)控。研究楊樹凍融傷害修復(fù)的分子機(jī)理是抗寒分子機(jī)理研究的發(fā)展趨勢之一。楊樹凍融傷害修復(fù)過程中，哪些基因在起作用？其功能是什么? 各個基因之間如何互作？在可逆凍融傷害DNA修復(fù)過程中哪些堿基發(fā)生了改變和修正？需要系統(tǒng)研究。