賈歆 劉強(qiáng) 劉經(jīng)堯

(1邢臺(tái)市人民醫(yī)院藥劑科，河北 邢臺(tái) 054001；2河北省眼科醫(yī)院醫(yī)學(xué)影像科；3河北醫(yī)科大學(xué))

耳聾是臨床常見的耳鼻喉科疾病，藥物、噪音、外傷等是引起耳蝸組織細(xì)胞損傷，導(dǎo)致聽覺喪失的主要因素，聽力喪失可極大影響日常交流，給患者正常學(xué)習(xí)工作造成障礙〔1,2〕。聽覺中樞在聽力受損或恢復(fù)時(shí)，其神經(jīng)細(xì)胞病理形態(tài)會(huì)發(fā)生改變，被稱作可塑性，藥物、噪音等外界刺激可誘導(dǎo)活性氧(ROS)的大量產(chǎn)生，引發(fā)嚴(yán)重的過氧化及炎癥反應(yīng)，造成耳蝸組織結(jié)構(gòu)受損，毛細(xì)胞凋亡缺失，進(jìn)而引起聽皮層可塑性改變，是導(dǎo)致聽覺喪失的主要病理基礎(chǔ)〔2～4〕。腦源性神經(jīng)生長(zhǎng)因子(BDNF)可與受體酪氨酸激酶(Trk)B結(jié)合，促進(jìn)神經(jīng)元的生長(zhǎng)、發(fā)育、分化及再生修復(fù)，維持突觸的傳遞及可塑性，是保證神經(jīng)系統(tǒng)正常生理結(jié)構(gòu)及功能的關(guān)鍵信號(hào)，上調(diào)其信號(hào)分子表達(dá)，可抑制ROS的過量產(chǎn)生，減輕β-淀粉樣蛋白25-35誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞損傷與認(rèn)知功能障礙，還可延緩耳聾患者聽神經(jīng)的退化，促使其聽力恢復(fù)〔5,6〕，因而BDNF/TrkB信號(hào)是改善聽覺喪失患者聽皮層可塑性的潛在作用靶點(diǎn)。紅景天苷是一種酚苷類化合物，大多提取自紅景天屬植物的根、莖，具有抗氧化、抗衰老、抗疲勞、抗菌、抗炎的功能，能通過清除ROS抑制高糖誘導(dǎo)的應(yīng)激及炎癥反應(yīng)，減輕視網(wǎng)膜Müller細(xì)胞凋亡，還能顯著減輕噪聲引發(fā)的耳蝸外毛細(xì)胞損傷，緩解豚鼠聽力損傷癥狀〔7,8〕，但紅景天甙是否可通過調(diào)控BDNF/TrkB通路而改善耳聾患者聽皮層可塑性，目前還未可知，本文探討紅景天甙調(diào)控BDNF/TrkB通路對(duì)聽覺剝奪模型大鼠聽層可塑性的影響。

1 材料與方法

1.1動(dòng)物 SPF級(jí)SD大鼠63只，體重(200±20)g，生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK(粵)2018-0043，購自廣州相觀生物科技有限公司。大鼠在本院動(dòng)物中心進(jìn)行適應(yīng)飼養(yǎng)，動(dòng)物飼養(yǎng)房中溫度(25±2)℃，相對(duì)濕度(55±5)%，以12 h/12 h明暗循環(huán)進(jìn)行照明，大鼠自由飲水進(jìn)食。

1.2主要試劑及儀器 慶大霉素注射液(批號(hào)1808183)購自河南潤弘制藥公司；紅景天苷(HPLC≥98%，貨號(hào)D0558)購自上海寶曼生物科技有限公司；K252a(貨號(hào)HY-N6732)購自美國MedChemExpress公司；活體組織ROS測(cè)定試劑盒(貨號(hào)HL10016.4)購自上海哈靈生物科技有限公司；OCT包埋劑(貨號(hào)4583)購自上海睿鉑賽生物科技有限公司；蘇木素-伊紅(HE)染色試劑盒、二喹啉甲酸(BCA)蛋白檢測(cè)試劑盒、大鼠白細(xì)胞介素(IL)-18酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)試劑盒、大鼠腫瘤壞死因子(TNF)-α ELISA試劑盒、大鼠干擾素(IFN)-γ ELISA試劑盒、兔源磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)一抗、兔源腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)一抗、兔源TrkB一抗、兔源p-TrkB一抗、羊抗兔二抗(貨號(hào)分別為ab245880、ab102536、ab213909、ab236712、ab239425、ab181602、ab226843、ab248704、ab197072、ab150077)購自美國Abcam公司；RIPA裂解液(貨號(hào)P0013K)購自上海碧云天公司等。

ABR電位儀(型號(hào)ICS-CHARTR-EP)，購自北京麥德森醫(yī)療器械銷售中心；隔聲屏蔽室購自廣州聲左聲學(xué)科技有限公司；掃描電子顯微鏡(型號(hào)S-4800)購自日本日立公司；全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀(型號(hào)HBS-ScanX)購自南京德鐵實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；冰凍切片機(jī)(型號(hào)KH-LQ3500)購自湖北孝感闊海醫(yī)療科技有限公司；光學(xué)顯微鏡(型號(hào)E100)購自日本Nikon公司；小型蛋白垂直電泳轉(zhuǎn)印系統(tǒng)(型號(hào)1658033)購自美國Bio-Rad公司；凝膠成像系統(tǒng)(型號(hào)GelDoc-It 310)購自上海巴玖實(shí)業(yè)有限公司等。

1.3聽覺剝奪模型大鼠制備及分組給藥 取SD大鼠63只，檢測(cè)大鼠聽覺腦干誘發(fā)電位(ABR)閾值，然后以100 mg/kg的劑量肌內(nèi)注射慶大霉素注射液〔9〕，每天1次，連續(xù)注射2 w，再次測(cè)定ABR閾值，當(dāng)其上升20 dB以上時(shí)，表示造模成功，共造模51只大鼠，將造模成功48只隨機(jī)分為模型組、K252a(BDNF/TrkB通路抑制劑)組、紅景天苷組、紅景天苷+K252a組，每組12只，另取12只大鼠肌內(nèi)注射等劑量生理鹽水，設(shè)為對(duì)照組。將紅景天苷、K252a以生理鹽水溶解，配制為10 mg/ml的紅景天苷〔10〕藥液、20 μg/ml的K252a〔11〕藥液、10 mg/ml的紅景天苷及20 μg/ml的K252a混合藥液，給藥組大鼠以5 ml/kg的劑量腹腔注射，對(duì)照組與模型組腹腔注射同劑量生理鹽水，每天注射一次，持續(xù)21 d。

1.4ABR閾值檢測(cè) 以乙醚氣體麻醉大鼠，于其顱頂正中插入記錄電極，于給聲耳、對(duì)側(cè)耳后皮下分別插入?yún)⒖茧姌O及接地電極，將大鼠放在隔聲屏蔽室內(nèi)，以濾波短聲刺激，耳機(jī)輸出，距離給聲耳道口0.5 cm，每秒重復(fù)10次，頻率100～3 000 Hz，疊加512次，掃描時(shí)程10 ms，以Ⅲ波為基準(zhǔn)確定記錄反應(yīng)閾值。

1.5大鼠耳蝸組織病理形態(tài)檢測(cè)及標(biāo)本采集 ABR閾值檢測(cè)結(jié)束后，以注射器自頸動(dòng)脈處采集血液1.5 ml，離心(4℃，1 000 r/min)，收集上清置于干凈的Ep管中，保存在-80℃冰箱中；通過頸椎脫位處死大鼠，各組隨機(jī)選出6只解剖，取出大腦及雙側(cè)聽泡，分離出聽皮層及耳蝸組織，各剪下0.5 g保存在液氮中；各組剩余的6只大鼠解剖后取出大腦及雙側(cè)聽泡，也分離出聽皮層及耳蝸組織，將大腦聽皮層組織浸入OCT包埋劑中，以液氮快速冰凍后置于冰凍切片機(jī)中，做連續(xù)病理切片備用，耳蝸組織進(jìn)行充分灌注固定后，于解剖顯微鏡下仔細(xì)解剖、暴露耳蝸各轉(zhuǎn)螺旋器，以單寧酸導(dǎo)電染色后脫水，經(jīng)叔丁醇置換后將樣品粘貼在導(dǎo)電膠上，進(jìn)行離子濺射鍍膜后，以掃描電子顯微鏡觀察耳蝸組織病理形態(tài)。

1.6大鼠聽皮層神經(jīng)元病理形態(tài)檢測(cè) 取出1.5中的大腦聽皮層切片，浸入冰丙酮中固定后，采用試劑盒進(jìn)行HE染色，以蒸餾水漂洗后，置于光學(xué)顯微鏡下觀察并拍照。

1.7大鼠聽皮層及耳蝸組織ROS水平檢測(cè) 取出1.5中保存在液氮中的聽皮層及耳蝸組織，加入RIPA裂解液進(jìn)行勻漿、離心，采集上清液，以BCA檢測(cè)試劑盒測(cè)定其中蛋白總濃度，取出0.15 ml，采用ROS測(cè)定試劑盒測(cè)定其中ROS水平，剩余蛋白樣品液保存在-80℃冰箱中。

1.8大鼠血清致炎因子IL-18、TNF-α、IFN-γ水平檢測(cè) 取出1.5中的血清，以冰水浴解凍，采用試劑盒測(cè)定其中致炎因子IL-18、TNF-α、IFN-γ水平。

1.9大鼠聽皮層及耳蝸組織BDNF/TrkB通路蛋白表達(dá)檢測(cè) 取出1.7中剩余的蛋白樣品液，以冰水浴解凍，加入適量上樣緩沖液后煮沸變性，每組各取20 μg進(jìn)行電泳(110 V，90 min)，分離蛋白后濕轉(zhuǎn)(110 V，90 min)，以5%脫脂奶粉封閉所得聚偏氟乙烯(PVDF)膜上蛋白，根據(jù)蛋白分子量截取目的蛋白p-TrkB、TrkB、BDNF、GAPDH條帶，以兔源一抗孵育、洗膜，加入羊抗兔二抗孵育、洗膜，顯色后拍照，通過Image J軟件分析圖片灰度值，進(jìn)行定量后統(tǒng)計(jì)分析出各蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.10統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS24.0軟件進(jìn)行單因素方差分析、LSD-t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1各組聽力情況比較 與對(duì)照組相比，模型組ABR閾值顯著升高(P<0.05)；與模型組、紅景天苷+K252a組分別相比，紅景天苷組ABR閾值均顯著降低(P<0.05)，K252a組ABR閾值均顯著升高(P<0.05)。見表1。

2.2各組聽皮層及耳蝸組織ROS水平比較 與對(duì)照組相比，模型組聽皮層及耳蝸組織ROS水平顯著升高(P<0.05)；與模型組、紅景天苷+K252a組分別相比，紅景天苷組聽皮層及耳蝸組織ROS水平均顯著降低(P<0.05)，K252a組聽皮層及耳蝸組織ROS水平均顯著升高(P<0.05)。見表1。

2.3各組血清致炎因子IL-18、TNF-α、IFN-γ水平比較 與對(duì)照組相比，模型組血清致炎因子IL-18、TNF-α、IFN-γ水平顯著升高(P<0.05)；與模型組、紅景天苷+K252a組分別相比，紅景天苷組血清致炎因子IL-18、TNF-α、IFN-γ水平均顯著降低(P<0.05)，K252a組血清致炎因子IL-18、TNF-α、IFN-γ水平均顯著升高(P<0.05)。見表1。

表1 各組ABR閾值、聽皮層及耳蝸組織ROS、血清致炎因子IL-18、TNF-α、IFN-γ水平、p-TrkB/TrkB、BDNF蛋白表達(dá)

2.4各組耳蝸組織病理改變 對(duì)照組耳蝸組織毛細(xì)胞形態(tài)正常，排列整齊；模型組毛細(xì)胞結(jié)構(gòu)改變，大小不一，且排列紊亂，數(shù)目缺失，與螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞周圍突結(jié)合發(fā)生裂隙，耳蝸組織出現(xiàn)明顯病理損傷；紅景天苷組耳蝸組織病理損傷相比模型組減輕；K252a組耳蝸組織病理損傷相比模型組進(jìn)一步加重；紅景天苷+K252a組耳蝸組織病理損傷相比模型組無明顯變化。見圖1。

圖1 掃描電鏡觀察各組耳蝸組織病理形態(tài)(×3 000)

2.5各組聽皮層神經(jīng)元改變 對(duì)照組聽皮層神經(jīng)元體積較大，結(jié)構(gòu)形態(tài)完好，分布均勻；模型組聽皮層神經(jīng)元萎縮變小，胞質(zhì)減少，細(xì)胞核出現(xiàn)固縮碎裂，且分布雜亂，數(shù)目明顯減少，呈明顯病理損傷；紅景天苷組聽皮層神經(jīng)元病理損傷相比模型組減輕；K252a組聽皮層神經(jīng)元病理損傷相比模型組進(jìn)一步加重；紅景天苷+K252a組聽皮層神經(jīng)元病理損傷相比模型組無明顯變化。見圖2。

圖2 各組聽皮層神經(jīng)元病理形態(tài)(HE染色，×200)

2.6各組聽皮層及耳蝸組織BDNF/TrkB通路蛋白表達(dá)比較 與對(duì)照組相比，模型組聽皮層及耳蝸組織p-TrkB/TrkB、BDNF蛋白表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)；與模型組、紅景天苷+K252a組分別相比，紅景天苷組聽皮層及耳蝸組織p-TrkB/TrkB、BDNF蛋白表達(dá)水平均顯著升高(P<0.05)，K252a組聽皮層及耳蝸組織p-TrkB/TrkB、BDNF蛋白表達(dá)水平均顯著降低(P<0.05)。見表1和圖3。

1～5:對(duì)照組、模型組、紅景天苷組、K252a組、紅景天苷+K252a組圖3 各組聽皮層及耳蝸組織BDNF/TrkB 通路蛋白的免疫印跡檢測(cè)

3 討 論

聽力損失是由各種外界有害刺激引發(fā)的耳蝸組織及聽皮層神經(jīng)可塑性損傷，其中氨基糖苷類抗生素暴露是造成耳聾的主要原因〔12,13〕，本文以肌內(nèi)注射慶大霉素的方法建立聽覺剝奪大鼠模型，結(jié)果顯示模型構(gòu)建成功。氨基糖苷類抗生素可誘導(dǎo)ROS自由基過量產(chǎn)生，引發(fā)炎癥反應(yīng)發(fā)生，增強(qiáng)氧化應(yīng)激，導(dǎo)致耳蝸及聽覺神經(jīng)損傷，造成聽力喪失，清除ROS，進(jìn)而降低過氧化反應(yīng)，抑制炎癥，可防治聽力損失癥狀〔14,15〕。紅景天苷是我國傳統(tǒng)中藥材紅景天的主要有效成分，具有顯著的抗氧化及消炎作用，可抑制永久性大腦中動(dòng)脈閉塞大鼠神經(jīng)元凋亡，保護(hù)神經(jīng)功能，還可明顯降低慶大霉素誘導(dǎo)的過氧化反應(yīng)，減輕耳蝸毛細(xì)胞損傷〔16,17〕。本文結(jié)果表明紅景天苷可清除慶大霉素暴露誘導(dǎo)產(chǎn)生的ROS，降低致炎細(xì)胞因子水平，抑制炎癥，減輕氧化應(yīng)激，緩解聽皮層神經(jīng)元與耳蝸組織損傷，改善聽皮層可塑性，提高大鼠聽覺能力，證實(shí)了紅景天苷對(duì)耳聾的治療作用。

BDNF在突觸可塑性、神經(jīng)元的發(fā)育、再生、修復(fù)等方面起到重要的調(diào)控作用，可促使下游TrkB蛋白磷酸化，減少ROS、炎性細(xì)胞因子合成產(chǎn)生，抑制炎癥進(jìn)展，降低氧化應(yīng)激水平，保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞免于凋亡損傷，維持連接毛細(xì)胞的螺旋神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元存活、突起生長(zhǎng)及分支，促進(jìn)其與毛細(xì)胞之間的突觸形成，減輕興奮毒素誘導(dǎo)的突觸病變、缺失，促使聽力恢復(fù)〔18～20〕，因此，激活BDNF/TrkB信號(hào)是防治耳聾的有效手段。本文結(jié)果顯示，BDNF/TrkB信號(hào)參與聽力喪失過程，紅景天苷可通過激活該信號(hào)抑制氧化應(yīng)激及炎癥反應(yīng)，

綜上，紅景天苷可上調(diào)BDNF蛋白表達(dá)，提高TrkB蛋白的磷酸化水平，顯著減少ROS及炎性因子產(chǎn)生，抑制炎癥發(fā)生及進(jìn)展，降低氧化應(yīng)激水平，減輕聽覺剝奪模型大鼠耳蝸組織損傷，減弱聽皮層神經(jīng)元變性凋亡，改善聽皮層可塑性，緩解大鼠聽覺喪失癥狀，激活BDNF/TrkB通路是其發(fā)揮藥理作用的分子機(jī)制之一，本文為紅景天苷在防治耳聾方面的臨床應(yīng)用及推廣提供了有力證據(jù)。