陳夢宇 張金武 杜杰 肖騁

(咸寧市中心醫(yī)院 湖北科技學(xué)院附屬第一醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，湖北 咸寧 437000)

腦卒中又稱為“中風(fēng)”，是臨床上常見的一種急性腦血管疾病，由于腦部血管裂開或阻塞導(dǎo)致的血液不能正常流入大腦組織引起腦組織損傷，引起缺血性或出血性腦卒中，其發(fā)病率、死亡率和致殘率較高，是威脅患者生命健康安全的頭號殺手〔1〕。葛花是豆科野葛或甘葛藤的花，主要生產(chǎn)地集中在河南、四川、廣東、浙江和安徽等地，常用于治療解酒醒脾、不思飲食、吐血、狀熱、頭暈等癥狀〔2～4〕。葛花具有降低血糖、抗炎和抗腫瘤等功效，黃酮類是葛花含量較高的活性成分〔5〕，葛花總黃酮(TFG)減緩小鼠腦組織的炎癥反應(yīng)，抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡，減緩腦部缺血再灌注損傷，對腦組織起到保護(hù)作用〔6〕，但是對糖氧剝奪(OGD)誘導(dǎo)人腦血管內(nèi)皮細(xì)胞的研究尚不明確。Toll樣受體(TLR)4/髓樣分化的初級應(yīng)答(MyD88)/核因子(NF)-κB通路是參與炎癥反應(yīng)的經(jīng)典通路，與多種疾病的發(fā)展密切相關(guān)〔7〕。張業(yè)昊等〔8〕研究結(jié)果顯示，黃芩苷通過調(diào)控TLR4/NF-κB信號通路減緩缺氧復(fù)氧誘導(dǎo)人腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞(HBMEC)炎性損傷。本研究探討TFG通過TLR4/MyD88/NF-κB通路減輕OGD對人腦血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷的機制。

1 材料與方法

1.1細(xì)胞和主要試劑 HBMEC購于美國ATCC公司；胎牛血清購于美國Hyclone公司；高糖DMEM培養(yǎng)基、DMEM培養(yǎng)基購于美國Gibco BRL公司；TFG(含量50.57%)購于南京澤朗醫(yī)藥公司；pcDNA、TLR4購于上海吉瑪公司；Lipofectamine2000試劑盒購于美國Invitrogen公司；噻唑藍(lán)(MTT)試劑盒、凋亡試劑盒購于北京索萊寶公司；B細(xì)胞淋巴瘤(Bcl)-2相關(guān)X蛋白(Bax)抗體、裂解的胱天蛋白酶(Cleaved cas)3抗體、TLR4抗體、MyD88抗體、p-NF-κB抗體、NF-κB抗體、GAPDH抗體購于美國Santa Cruz公司；辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的IgG抗體購于北京中山金橋公司；超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、白細(xì)胞介素(IL)-6、IL-10、腫瘤壞死因子(TNF)-α試劑盒購于南京建成生物研究所。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)和分組 復(fù)蘇HBMEC在含有10%胎牛血清、雙抗的高糖DMEM培養(yǎng)基內(nèi)，并在條件為37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。觀察細(xì)胞的生長狀態(tài)，待細(xì)胞生長至80%時，加入胰酶消化，每2 d換1次培養(yǎng)基。

取對數(shù)生長期的HBMEC接種在96孔板中，沖洗2次更換為無糖培養(yǎng)基，然后將細(xì)胞培養(yǎng)板放置在95%N2、5%CO2培養(yǎng)中培養(yǎng)6 h，建立OGD細(xì)胞模型，將細(xì)胞分為對照(Control)組、OGD模型(OGD)組、OGD模型+TFG低、高劑量(OGD+TFG-L、OGD+TFG-H)組、OGD+TFG+pcDNA組和OGD+TFG+TLR4組。Control組在正常條件下培養(yǎng)，不做任何處理，其余5組進(jìn)行OGD處理，OGD+TFG-L組、OGD+TFG-H組：TFG低、高劑量濃度為10、100 mg/L處理；OGD+TFG+pcDNA組、OGD+TFG+TLR4組：將pcDNA、TLR4轉(zhuǎn)染至細(xì)胞，并采用濃度為100 mg/L TFG處理。細(xì)胞轉(zhuǎn)染時采用Lipofectamine2000試劑盒說明書進(jìn)行。

1.3MTT檢測細(xì)胞活力 取1.2各組HBMEC調(diào)整密度為5.0×104/ml，并接種在96孔板中，在37℃、5% CO2培養(yǎng)箱固定培養(yǎng)48 h，然后在每孔內(nèi)加入20 μl的MTT試劑，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，在每孔內(nèi)加入150 μl二甲基亞砜(DMSO)試劑，結(jié)晶充分溶解后，在酶標(biāo)儀490 nm處檢測細(xì)胞吸光度值，計算細(xì)胞活力。

1.4流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡 取1.2各組HBMEC培養(yǎng)48 h后，采用預(yù)冷的磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗2遍，按照凋亡試劑盒說明書步驟，分別加入膜聯(lián)蛋白V-異硫氰酸熒光素(Annexin V-FITC)試劑10 μl，再加入碘化丙啶(PI)試劑5 μl，在暗室中反應(yīng)15 min，1 h內(nèi)在流式細(xì)胞儀上檢測細(xì)胞凋亡情況。

1.5Western印跡檢測Bax、Cleaved cas3和TLR4/MyD88/NF-κB通路相關(guān)蛋白表達(dá) 取1.2各組HBMEC提取總蛋白后，按照二喹啉甲酸(BCA)法檢測定量蛋白。取45 μg蛋白樣品進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，電泳結(jié)束后轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，脫脂奶粉封閉培養(yǎng)2 h，加入一抗Bax、Cleaved cas3、TLR4、MyD88、p-NF-κB、NF-κB和GAPDH，4℃過夜培養(yǎng)，加入HRP標(biāo)記的IgG抗體，室溫培養(yǎng)2 h，加入發(fā)光液顯影、曝光。Quantity One軟件掃描蛋白條帶灰度值，以GAPDH作為內(nèi)參，計算分析目的蛋白表達(dá)。

1.6酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)檢測細(xì)胞SOD、GSH-Px、IL-6、IL-10和TNF-α表達(dá) 取1.2各組HBMEC，PBS清洗2遍，裂解震蕩，離心后收集細(xì)胞上清液，按照SOD、GSH-Px、IL-6、IL-10和TNF-α試劑盒說明書，檢測SOD、GSH-Px、IL-6、IL-10和TNF-α表達(dá)。

1.7統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS20.0軟件進(jìn)行t檢驗、方差分析。

2 結(jié) 果

2.1TFG對OGD誘導(dǎo)HBMEC增殖和凋亡的影響 與Control組相比，OGD組細(xì)胞活力顯著降低，細(xì)胞凋亡率、Bax、Cleaved cas3蛋白表達(dá)顯著增加(均P<0.05)；與OGD組相比，OGD+TFG-L組、OGD+TFG-H組細(xì)胞活力顯著增加，細(xì)胞凋亡率、Bax、Cleaved cas3蛋白表達(dá)顯著降低(均P<0.05)。見圖1、圖2、表1。

圖1 TFG對OGD誘導(dǎo)HBMEC凋亡的影響

1～4:Control組、OGD組、OGD+TFG-L組、OGD+TFG-H組圖2 Western印跡檢測相關(guān)蛋白表達(dá)

表1 TFG對OGD誘導(dǎo)HBMEC增殖和 凋亡的影響

2.2TFG對OGD誘導(dǎo)HBMEC氧化應(yīng)激的影響 與Control組相比，OGD組SOD、GSH-Px活性顯著降低(P<0.05)；與OGD組相比，OGD+TFG-L組、OGD+TFG-H組SOD、GSH-Px活性顯著升高(P<0.05)。見表2。

2.3TFG對OGD誘導(dǎo)HBMEC炎癥反應(yīng)的影響 與Control組相比，OGD組IL-6、IL-10、TNF-α表達(dá)顯著升高(P<0.05)；與OGD組相比，OGD+TFG-L組、OGD+TFG-H組IL-6、IL-10、TNF-α表達(dá)顯著降低(P<0.05)。見表2。

2.4TFG對OGD誘導(dǎo)HBMEC TLR4/MyD88/NF-κB通路的影響 與Control組相比，OGD組TLR4、MyD88、p-NF-κB蛋白表達(dá)顯著升高(P<0.05)；與OGD組相比，OGD+TFG-L組、OGD+TFG-H組TLR4、MyD88、p-NF-κB蛋白表達(dá)顯著降低(P<0.05)。見表3、圖3。

表2 TFG對OGD誘導(dǎo)HBMEC氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)、TLR4/MyD88/NF-κB通路的影響

表3 TFG通過TLR4/MyD88/NF-κB通路對OGD誘導(dǎo)HBMEC增殖、凋亡、氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)的影響

2.5TFG通過TLR4/MyD88/NF-κB通路對OGD誘導(dǎo)HBMEC增殖、凋亡的影響 與OGD+TFG+pcDNA組相比，OGD+TFG+TLR4組細(xì)胞活力顯著降低，TLR4蛋白表達(dá)、細(xì)胞凋亡率、Bax、Cleaved cas3蛋白表達(dá)顯著升高(P<0.05)。見表3、圖4、圖5。

2.6TFG通過TLR4/MyD88/NF-κB通路對OGD誘導(dǎo)HBMEC氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)的影響 與OGD+TFG+pcDNA組相比，OGD+TFG+TLR4組SOD、GSH-Px活性顯著降低(P<0.05)，IL-6、IL-10、TNF-α表達(dá)顯著升高(P<0.05)。見表3。

1～4:Control組，OGD組，OGD+TFG-L組，OGD+TFG-H組圖3 TFG對OGD誘導(dǎo)HBMEC TLR4/ MyD88/NF-κB通路的影響

圖4 葛花總黃酮通過TLR4/MyD88/NF-κB通路對 OGD誘導(dǎo)HBMEC凋亡的影響

1～2:OGD+TFG+pcDNA組，OGD+TFG-TLR4組圖5 Western印跡檢測TLR4、Bax、 Cleaved cas3蛋白表達(dá)

3 討 論

腦卒中是腦部血管疾病常見的疾病，大約占全部腦血管疾病的70%，目前關(guān)于治療腦卒中尚無有效的方法〔9〕。腦血管內(nèi)皮細(xì)胞缺氧或缺血能夠促進(jìn)炎癥因子的分泌、促進(jìn)細(xì)胞氧化自由基損傷，因此，如何改善腦血管內(nèi)皮細(xì)胞功能紊亂引起的腦卒中至關(guān)重要〔10，11〕。葛花作為中國的傳統(tǒng)醫(yī)藥，具有多種活性成分，如黃酮類、揮發(fā)油類和皂苷類等〔12，13〕。康樂等〔14〕研究結(jié)果顯示，TFG可以減緩大鼠局灶性腦缺血再灌注炎性反應(yīng)，保護(hù)腦組織免受損傷。TFG能夠減低胰島素抵抗，改善大鼠的認(rèn)知功能，減緩大鼠海馬神經(jīng)元的炎性損傷〔15〕。本研究結(jié)果說明，TFG可以抑制OGD誘導(dǎo)HBMEC的凋亡、氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)，并促進(jìn)細(xì)胞增殖。

TLR4是一種跨膜蛋白，廣泛存在各種細(xì)胞內(nèi)，能夠識別病原分子引起炎癥反應(yīng)，且活化的TIR結(jié)構(gòu)域激活MyD88依賴性途徑，引起NF-κB被活化〔16，17〕。研究發(fā)現(xiàn)，TLR4、MyD88和NF-κB p65蛋白表達(dá)在小鼠膠質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)下調(diào)，利用siRNA干擾技術(shù)，發(fā)現(xiàn)TLR4 siRNA抑制小鼠膠質(zhì)細(xì)胞的自噬和腦部出血引起的炎性損傷〔18〕。韓晨陽等〔19〕研究顯示，丁苯酚通過抑制抑制HMGB1/TLR4/NF-κB通路減緩糖氧剝奪導(dǎo)的HBMEC的炎癥反應(yīng)和細(xì)胞凋亡。本研究結(jié)果說明，TFG可以調(diào)控TLR4/MyD88/NF-κB通路的表達(dá)。在HBMEC轉(zhuǎn)染TLR4后，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)TLR4可以抑制OGD誘導(dǎo)HBMEC的增殖，促進(jìn)細(xì)胞的凋亡、氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)，說明TFG通過調(diào)控TLR4/MyD88/NF-κB通路減輕OGD誘導(dǎo)HBMEC損傷。