韋亮 祝美珍 孫詩杰 蘇萍 何宏盾

(廣西中醫(yī)藥大學，廣西 南寧 530000)

腦缺血損傷又稱缺血性腦卒中(ICVD)，是由于各種原因引起腦血管梗死不通，局部腦組織缺血缺氧進而引起神經細胞凋亡、細胞自噬等一系列病理過程，出現偏癱、失語等神經功能缺損癥狀，甚至危及生命〔1〕。ICVD是我國最常見的腦卒中類型，其發(fā)病率高、致死致殘率高，占我國腦卒中發(fā)病類型的69.6%～70.8%〔2〕。腦缺血發(fā)生后，及早地再灌復流是治療ICVD的重點與關鍵〔3〕。加快側支循環(huán)的建立可改變血流通過路徑并提供反向血流灌注，增加血液灌注，保持腦血容量，改善腦缺血癥狀〔4〕?；|細胞衍生因子(SDF)-1/CXC趨化因子受體(CXCR)4信號通路，被認為是能激活一條細胞間信號傳導及細胞遷移的信號通路，可以調節(jié)造血細胞、炎癥細胞和內皮祖細胞等多種細胞的遷移、分化、增殖及神經發(fā)生等生物學行為〔5〕，從而促進新的血管生成，增加腦血流量的灌注，改善腦損傷，起到腦保護的作用。干預和調控SDF-1、CXCR4的表達水平，可使SDF-1/CXCR4信號通路發(fā)揮其最大的生物學效應。本研究根據ICVD“腎陽不足-痰瘀互結-痹阻腦絡”的重要病機鏈鎖，基于ICVD的證候病機與分子病理，研究溫陽逐瘀湯對腎陽虛ICVD大鼠側支循環(huán)建立相關指標SDF-1、CXCR4表達的影響，探索其促進腦缺血組織側支循環(huán)建立的分子機制，為中醫(yī)藥防治ICVD提供新的研究思路。

1 材料與方法

1.1動物 192只SPF級SD雄性大鼠，鼠齡3～4個月，體重(250±25)g，購自廣西醫(yī)科大學動物實驗中心，許可證號：SYSK桂2014-0003。

1.2藥物 溫陽逐瘀湯：制附子10 g、肉桂5 g、杜仲15 g、巴戟天15 g、當歸10 g、熟地20 g、桃仁10 g、紅花10 g、水蛭8 g、姜半夏9 g、南山楂15 g、紅參10 g；每劑含137 g生藥，藥材購自廣西中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院；氫化可的松注射液，福安藥業(yè)集團湖北人民制藥有限公司，市售，批號H20058654。

1.3儀器及試劑 超低溫冰箱(澳柯瑪)、高速臺式冷凍離心機(德國 Eppendorf 公司)、垂直電泳儀(美國 BIO-RAD)、全自動實時熒光定量 PCR儀(瑞士 LightCycler96)、酶聯免疫分析試劑盒(武漢基因美，生產批號：GR2020-05)、二喹啉甲酸(BCA)蛋白濃度測定試劑盒〔北京索萊寶，貨號：PC0020-500微孔(50T)〕、高效 RIPA 裂解液(北京索萊寶，貨號：R0010-100ml)、預染彩虹蛋白marker〔北京索萊寶，貨號：PR1910-50T(250 μl)〕、山羊抗兔免疫球蛋白(Ig)G二抗(北京中杉金橋)、TRIZOL裂解液(美國Invitrogen)、SDF-1、CXCR4單克隆抗體(英國 abcam 公司)、反轉錄試劑盒(莫納生物科技有限公司)、擴增試劑盒(莫納生物科技有限公司)、SDF-1和CXCR4引物及內參(上海生工股份有限公司)、蘇木素-伊紅(HE)染色試劑盒(北京索萊寶科技有限公司) 。

1.4動物分組 將192只成年健康雄性SD大鼠按體重進行分層及編號，使用SPSS24.0統(tǒng)計軟件隨機數字表法進行隨機分組，先分為空白組48只和腎陽虛模型組144只，腎陽虛模型組肌肉注射氫化可的松注射液21 d后，建立腎陽虛模型，再將造模成功后的144只腎陽虛模型大鼠按體重進行隨機分組，分為假手術組、模型組、溫陽逐瘀湯組，每組各48只。

1.5模型制備

1.5.1腎陽虛模型 空白組正常喂養(yǎng)，腎陽虛模型組連續(xù)21 d早8∶00～9∶00進行腿部肌肉注射氫化可的松注射液，25 mg/kg〔6〕，自由飲食、飲水。每日造模前后測量觀察各組大鼠的體重、進食量、飲水量、一般狀態(tài)及二便并記錄。

1.5.2ICVD模型 將完成腎陽虛造模后的模型組、溫陽逐瘀湯組大鼠用10%水合氯醛麻醉后，參考Longa等〔7〕法制成大鼠急性ICVD模型。假手術組線栓插入大鼠右側頸總動脈(0.8±0.2)cm，此深度不足以阻斷大腦中動脈血流。參考 Longa〔7〕的評分法對造模后大鼠進行神經功能評分篩選出符合要求的ICVD模型。

1.6藥物干預 以體重60 kg成人每天服用溫陽逐瘀湯，參考《現代醫(yī)學實驗動物學》〔8〕中的標準方程進行換算，按體量1 ml/100 g進行灌胃；分別于每日上午9∶00～10∶00及下午16∶00～17∶00時進行灌胃，空白組、假手術組、模型組給予蒸餾水灌胃，溫陽逐瘀湯組予以溫陽逐瘀湯灌胃，藥物濃度含生藥材2 g/ml，直至各時間點取材。

1.7標本采集及處理 ①采血：對大鼠進行尾靜脈采血1 ml，用含肝素鈉采血管收集，置數小時后取血清，3 000 r/min離心10 min，-80℃保存；②取腦：使用10%水合氯醛麻醉后進行取腦，將用于HE檢測的腦組織浸于4%的多聚甲醛，而用于Western檢測和RT-PCR檢測的腦組織放入-80℃冰箱凍存。

1.8檢測方法 ①采用酶聯免疫吸附試驗(ELISA)檢測腎陽虛證模型造模后及灌胃后的腎陽虛特異性指標環(huán)磷酸腺苷(cAMP)、環(huán)磷酸鳥苷(cGMP)；②采用Western印跡和實時熒光定量PCR(RT-PCR)法檢測各時間點腦組織SDF-1、CXCR4的mRNA及蛋白表達水平；③HE染色法檢測各時間點缺血損傷側神經細胞形態(tài)學變化。

1.9統(tǒng)計學方法 采用SPSS24.0軟件進行獨立樣本t檢驗、單因素方差分析、SNK-q檢驗、重復測量資料方差分析、秩和檢驗。

2 結 果

2.1腎陽虛模型癥狀及指標

2.1.1癥狀及體征 空白組大鼠始終保持皮毛光澤，反應敏捷，二便正常；腎陽虛模型組大鼠從7 d開始出現皮毛色澤暗淡、枯槁欠光亮，體毛疏松，輕微脫毛現象，倦怠萎靡，懶動喜臥，行動緩慢，大便質軟；14 d后出現豎毛，脫毛明顯，反應遲鈍，畏冷蜷縮，弓背瞇眼，陰囊皺縮，睪丸回升，飲食減少，小便頻數，大便稀溏等癥狀；21 d后上述癥狀加重；與空白組相比，腎陽虛模型組大鼠體重呈緩慢增長，14 d、21 d明顯下降(P<0.01)，提示腎陽虛模型造模成功，見表1。

2.1.2腎陽虛證特異性指標cAMP、cGMP水平的變化 與空白組比較，腎陽虛模型組血清cAMP水平明顯降低，cGMP水平明顯升高，cAMP/cGMP比值明顯降低(P<0.01)，提示腎陽虛模型造模成功，見表1。

表1 空白組和腎陽虛模型組不同時間點體重及cAMP、cGMP比較

2.2大鼠神經功能缺損評分 空白組與假手術組大鼠的神經功能表現正常。同一時間點與假手術組相比，模型組和溫陽逐瘀湯組神經功能缺損評分顯著升高(P<0.05)；與模型組相比，溫陽逐瘀湯組在各時間點的神經功能缺損評分降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，提示ICVD模型成功，見表2。

表2 各組不同時間點神經功能缺損評分比較分)

2.3各組缺血側腦組織病理 空白組、假手術組：細胞排列規(guī)整，胞膜完整，形態(tài)結構基本正常；模型組：細胞排列紊亂稀疏，大量細胞壞死，呈明顯的缺血性損害改變；溫陽逐瘀湯組：細胞排列稀疏紊亂，但與模型組相比較為整齊，部分細胞壞死，呈三角形收縮并深染，胞膜消失，核仁呈紫藍色，有少量炎性細胞浸潤；隨著灌胃給藥時間的延長，與模型組相比，溫陽逐瘀湯組細胞明顯逐漸增多，胞膜相對完整，胞質呈淺紫色，胞核逐漸清晰可見，見圖1。

2.4各組大鼠腦組織SDF-1、CXCR4蛋白及mRNA表達水平比較 同一取材時間點相比，空白組、假手術組SDF-1、CXCR4蛋白及mRNA表達水平的差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；與假手術組相比，模型組、溫陽逐瘀湯組SDF-1、CXCR4蛋白及mRNA表達水平顯著升高(P<0.01)；模型組、溫陽逐瘀湯組SDF-1、CXCR4蛋白及mRNA表達水平均于7 d達到峰值，14、21 d表達逐漸下降，且SDF-1與CXCR4蛋白及mRNA表達趨勢相同；同一取材時間點相比，溫陽逐瘀湯組SDF-1與CXCR4蛋白及mRNA表達高于模型組，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。提示溫陽逐瘀湯可明顯上調SDF-1、CXCR4蛋白及mRNA表達水平，見表3、圖2、表4。

表3 各組不同時間點腦組織SDF-1、CXCR4蛋白表達水平

1～4:空白組，假手術組，模型組，溫陽逐閼湯組

表4 各組不同時間點腦組織SDF-1、CXCR4 mRNA相對量表達水平比較

3 討 論

ICVD發(fā)生后，盡早恢復缺血灶的血流量是治療的重要切入點，也是降低的致殘率、致死率的關鍵。臨床研究結果表明，ICVD發(fā)生后，隨著側支循環(huán)的開放，患者發(fā)生腦梗死的數量及梗死面積顯著減少，可明顯降低ICVD的復發(fā)率〔9,10〕。研究證實，ICVD大鼠缺血側腦組織中SDF-1及CXCR4的含量顯著高于對側未受損腦組織〔11〕。以SDF-1、CXCR4為主要轉導因子的SDF-1/CXCR4信號通路，在治療腦缺血損傷中發(fā)揮著重要的作用，其主要作用機制大致可分為以下三方面：①誘導干細胞和內源性祖細胞通過增加的梗死周圍的SDF-1和表達CXCR4來上調營養(yǎng)因子〔12〕。②調動內皮祖細胞等促進血管新生:被釋放的SDF-1可以促進成熟或未成熟的造血細胞、平滑肌細胞前體細胞和內皮前體細胞等促進血管細胞的生成，恢復缺血組織的血流灌注；而CXCR4也可以直接或間接地生成這些促血管生成細胞，從而一同達到血管新生的目的〔13,14〕。③提高機體抗缺氧能力〔15〕。

SDF-1屬于趨化因子蛋白家族中的一員，可作為趨化細胞因子參與細胞活化、分化和運輸〔16〕。SDF-1在缺血灶中表達的上調主要是從損傷后3 d開始，于7 d達到高峰，且能持續(xù)表達至30 d〔17〕。SDF-1有CXCR7、CXCR4兩大受體，但CXCR7是通過CXCR4才能發(fā)揮對SDF-1進行的信號轉導，所以認為CXCR4是SDF-1的唯一特異性受體〔18〕。CXCR4作為一類G蛋白耦聯受體，它由7個疏水性跨膜區(qū)組成，能表達于不同細胞膜上和細胞質中，能正向誘導內源性神經干細胞、祖細胞向組織損傷處遷移及歸巢，在受損的中樞神經系統(tǒng)的恢復上起到關鍵作用。

腦卒中多發(fā)于中老年人，其病機特點為本虛標實。中醫(yī)認為，腎為五臟六腑之本，腎氣為元氣之根。年老腎虛，氣虛無力暢行血脈，陽虛無力溫化津血，則痰瘀內生，痹阻腦脈而發(fā)為腦卒中。“腎陽不足-痰瘀互結-痹阻腦絡”是ICVD的主要病機，治宜謹守病機，無失氣宜，以溫陽通脈、逐瘀通絡為法。一則溫補腎陽、逐瘀通脈恢復局部缺血腦組織的血液供應，挽救缺血半暗帶組織；二則溫補腎陽，化瘀生新，促進血管新生，建立側支循環(huán)，進一步恢復腦部血流，改善腦缺血損傷預后、實現腦保護。

溫陽逐瘀湯方中以附子、肉桂共為君藥，同歸腎經，共奏補火助陽、溫腎固本之效；臣以杜仲、巴戟天、紅參補腎助陽、益氣培元，共助君藥溫補腎陽；佐以熟地滋陰活血、亦有陰中求陽之意；當歸、桃仁、紅花、水蛭補血活血、逐瘀通經；半夏、山楂行氣化痰。全方溫補腎陽、化痰逐瘀，切斷ICVD“腎陽不足-痰瘀互結-痹阻腦絡”的病機鏈鎖，獲得“溫腎陽-祛痰瘀-生新絡”的治療效應。

本研究結果證明，溫陽逐瘀湯可明顯改善腎陽虛ICVD大鼠畏寒蜷縮、四肢冰涼、大便稀溏、體質量下降等的陽虛表征及腎陽虛證特異性指標，可能系方中附子、肉桂、杜仲等歸腎經的溫陽藥，共奏溫腎固本之效，改善了大鼠腎陽虛證的癥狀；實驗灌胃溫陽逐瘀湯后，腎陽虛ICVD大鼠缺損的神經功能與模型組相比得以良好的改善，缺血組織腦細胞損傷程度明顯減輕，可能系方中當歸、紅花、桃仁、半夏等活血、化痰、祛瘀之品，復通腦脈，增加了缺血的腦組織的血流灌注量，從而修復損傷的腦細胞及神經功能；大鼠腦組織SDF-1、CXCR4的mRNA及蛋白表達水平明顯上調，可能系全方在溫補腎陽、逐瘀化痰的基礎上，活血生脈，導致參與血管新生因子表達上調，從而增加損傷區(qū)域的腦血流灌注量。

綜上所述，溫陽逐瘀湯可以明顯改善腎陽虛型ICVD大鼠的腎陽虛表現，降低ICVD大鼠神經功能缺損評分,其作用機制可能是通過上調缺血側腦組織中的SDF-1、CXCR4的mRNA及蛋白表達水平，促進缺血損傷局部血管新生，改善ICVD的神經功能損傷，實現腦保護，從而發(fā)揮其防治ICVD的作用。