池魁 袁濤 孫歡歡 李燁 張金文

(河北醫(yī)科大學第二醫(yī)院 1血管外科，河北 石家莊 050000；2麻醉科)

動脈硬化屬于動脈非炎癥性及退行性的病變，常表現(xiàn)為動脈管壁出現(xiàn)增厚及變硬以及血管彈性降低〔1〕。在20世紀60年代，歐美等發(fā)達國家，動脈硬化大幅度增加，進而成為一種常見病〔2〕。隨著我國社會的發(fā)展，人們生活節(jié)奏、生活方式的改變及老齡化的加重，動脈硬化在我國發(fā)病率顯著升高〔3〕。目前，動脈硬化作為不良心血管事件出現(xiàn)的獨立危險因素，已成為老年人死亡的主要原因之一〔4〕。miRNA屬于短的單鏈RNA序列，在生物系統(tǒng)中廣泛表達，能夠控制基因在多種生理與病理過程中的表達，具有調(diào)控轉(zhuǎn)錄后的關(guān)鍵作用〔5〕。miRNA參與在細胞增殖、凋亡及胚胎發(fā)育等多種過程中〔6〕。但目前關(guān)于miR-29b與動脈硬化的相關(guān)性研究還未見報道。本研究探討miR-29b過表達對動脈硬化模型大鼠的干預作用及機制。

1 材料與方法

1.1材料 選取40只SD健康雌性大鼠，由上海斯萊克動物實驗中心所提供，月齡8～11個月，平均(9.5±1.2)個月，體重219～246 g，平均(231.5±11.07)g。在相對濕度30%～36%、溫度為(23.5±1.3)℃的環(huán)境下，對大鼠進行喂養(yǎng)1 w，光照12 h/d。本文研究獲醫(yī)院倫理委員會批準。

miR-29b(Sigma公司)；磷酸鹽緩沖液(PBS)及聚苯乙烯試管(Invitrogen公司)；一氧化氮(NO)、內(nèi)皮素(ET)-1及白細胞介素(IL)-8試劑盒(Abcam公司)；轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)-β1及單核細胞趨化蛋白(MCP)-1抗體(Millipore公司)；枸櫞酸緩沖液(Cell Signaling公司)。內(nèi)皮生長因子(VEGF)及鱗狀細胞癌抗原(SCC)抗體及蘇木素-伊紅(HE)染色試劑盒(碧云天公司)酶標儀(美國AI公司)

1.2建模及分組 將40只SD雄性大鼠隨機分為正常組，疾病模型組、miR-29b過表達組及miR-29b沉默組各10只。其中正常組不進行任何處理，自由飲食。疾病模型組、miR-29b過表達組及miR-29b沉默組建立動脈硬化大鼠模型，首先以高脂飼料進行喂養(yǎng)1 w，后在清潔室內(nèi)以1%戊苯巴比妥鈉，在大鼠腹腔進行麻醉，每只大鼠對左后肢進行消毒后，以腹腔溝中點向后肢內(nèi)側(cè)進行縱行切膚，在分離后將引動脈暴露，使用動脈夾在隱動脈遠近端在1.5～2.0 cm進行阻斷，使用胰島素注射器沿隱動脈血管的長軸在遠端及近端刺進阻斷部位血管，在血管充盈止，在5 min后將針頭及動脈夾進行壓迫止血，縫合好傷口后，出現(xiàn)內(nèi)膜損傷后，提示模型完成后。其中隨機選取10只大鼠為疾病模型組，不進行任何處理。余下20只miR-29b沉默組進行注射0.2 μl/gmiR-29b抑制劑，miR-29b過表達組進行注射0.2 μl/g miR-29b類似物。

1.3HE染色 待測標本首先進行脫蠟、水化等處理之后，將其在0.01 mol/L、95℃的枸櫞酸緩沖液中浸泡，同時進行熱修復，選擇在3%H2O2環(huán)境下培育10 min，滴入山羊血清，26℃環(huán)境中進行培養(yǎng)30 min，抽離封閉液后，添加一抗，將其放置在5℃的環(huán)境中過夜培養(yǎng)，第2天置入二抗，在37℃恒溫箱中培養(yǎng)30 min，清洗后進行二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色及封片。

1.4反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(RT-PCR)檢測miR-29b表達 首先提取細胞總RNA，檢測其RNA純度及含量，逆轉(zhuǎn)錄處理后獲得cDNA，設(shè)計引物序列，以2-△△Ct方法計算miR-29b表達，PCR引物以Primer Premier6.0軟件進行設(shè)計(Invitrogen公司合成)。其中miR-29b上游引物：5′-GCGCGCTAGCACCATTTG-3′，下游5′-CAGTGCAGGGTCCGAGGT-3′。

1.5VEGF、TGF-β1及MCP-1水平檢測 免疫組化法檢測VEGF、TGF-β1及MCP-1水平，以PBS作為陰性對照，以CK19>10 μg/L為陽性判斷標準，當細胞膜或細胞質(zhì)呈棕黃色或棕褐色為CK19染色陽性信號。將組織蠟塊進行石蠟切塊，將厚度切為4 μm，以常規(guī)脫蠟、脫水，進行抗原修復，除去離子水孵化，并滴加細胞間黏附分子(ICAM)-1為一抗，在4℃置放12 h，進行2次PBS清洗，同時滴加聚合梅輔助劑，在37℃下水浴，進行持續(xù)孵化，時間為20 min；2次PBS清洗，并進行滴加免疫球蛋白(Ig)G多聚體。在37℃下水浴，進行持續(xù)孵化，時間為30 min。

1.6NO、ET-1及IL-8水平檢測 以酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測NO、ET-1及IL-8水平，將50 mm碳酸鹽包緩沖液稀釋后在聚苯乙烯的反應孔內(nèi)加入，并進行抗原，加蓋處理，選擇4℃冰箱內(nèi)放置24 h，次日行3次洗滌，后拋干，將稀釋液(pH值為7.4 0.02 mol/L Tris-HCl緩沖液)稀釋的待測標本0.1 ml放入每個孔中，同時放入陽性和陰性對照標本，存放在攝氏度42℃環(huán)境中60 min，移除液體后，進行3次洗滌并拋干，在每個孔中放入NO、ET-1及IL-8抗體0.1 ml，存放60 min，移除液體后。進行3次洗滌并拋干，在每個孔中放入低物液(0.1 mol/L的Na2HPO4,0.05 mol/L的枸櫞酸)，混勻之后放入0.1 ml鄰苯二胺，進行20 min遮光，再一次放入2 mol/L H2SO40.05 ml放置在每個孔內(nèi)，終止反應。以酶標儀檢測A450值檢測NO、ET-1及IL-8水平。

1.7ROS、MDA及SOD水平檢測 應用黃嘌呤氧化酶法檢測ROS、MDA及SOD水平，取用聚苯乙烯試管，將其分為測量管、對照管。提取樣品后，于上清中加蒸餾水，體積是上清的10倍，將樣品配制為濃度1%。測量管、對照管內(nèi)均加1.0 ml試劑盒中的試劑，分別在試劑1、2、3、4中加0.1 ml，后在測量管加入樣品50 μl，在對照管內(nèi)加50 μl蒸餾水，待加樣后，將試管放旋渦混勻器開始充分混勻，于37℃恒溫水浴箱中保存40 min。顯色：在對照管、測量管中各加2 ml顯色劑，室溫放置10 min。使用蒸餾水調(diào)零分光光度計算，比色需要在波長550 nm，1 cm光徑條件下。

1.8統(tǒng)計學處理 采用SPSS21.0軟件進行F檢驗。

2 結(jié) 果

2.1HE染色 正常組組織結(jié)構(gòu)正常，內(nèi)膜較為光滑平整，且內(nèi)皮細胞排列有序，疾病模型組內(nèi)膜明顯增厚，細胞排列紊亂，可見較多遷移的平滑肌細胞；miR-29b沉默組內(nèi)膜較為明顯增厚，細胞排列嚴重紊亂，可見較多遷移的平滑肌細胞；miR-29b過表達組內(nèi)皮細胞排列出現(xiàn)有序，相比疾病模型組遷移的平滑肌細胞較少。見圖1。

2.2VEGF水平及miR-29b表達比較 與正常組相比，疾病模型組、miR-29b沉默組及miR-29b過表達組miR-29b表達明顯低，VEGF水平明顯高(P<0.05)；與疾病模型組相比，miR-29b沉默組miR-29b表達明顯低，VEGF水平明顯高，miR-29b過表達組miR-29b表達明顯高，VEGF水平明顯低(P<0.05)。見表1。

2.3NO、ET-1水平比較 與正常組相比，疾病模型組、miR-29b沉默組及miR-29b過表達組NO水平明顯低，ET-1水平明顯高(P<0.05)；與疾病模型組相比，miR-29b沉默組NO水平明顯低，ET-1水平明顯高，miR-29b過表達組NO水平明顯高，ET-1水平明顯低(P<0.05)。見表2。

圖1 各組組織HE染色(×200)

表1 各組VEGF水平及miR-29b表達比較

表2 各組NO、ET-1水平比較

2.4ROS、MDA及SOD水平比較 與正常組相比，疾病模型組、miR-29b沉默組及miR-29b過表達組ROS、MDA水平均明顯高，SOD水平明顯低(P<0.05)；與疾病模型組相比，miR-29b沉默組ROS、MDA水平均明顯高，SOD水平明顯低，miR-29b過表達組ROS、MDA水平均明顯低，SOD水平明顯高(P<0.05)。見表3。

2.5TGF-β1、MCP-1及IL-8水平比較 與正常組相比，疾病模型組、miR-29b沉默組及miR-29b過表達組TGF-β1、MCP-1及IL-8水平均明顯高(P<0.05)；與疾病模型組相比，miR-29b沉默組TGF-β1、MCP-1及IL-8水平均明顯高，miR-29b過表達組TGFβ1、MCP-1及IL-8水平均明顯低(P<0.05)。見表3。

表3 各組ROS、MDA、SOD及TGF-β1、MCP-1及IL-8水平比較

3 討 論

動脈硬化作為危害人類健康的一大類疾病，常多發(fā)于老年人群〔7〕。目前，關(guān)于動脈硬化的治療，常通過進行藥物干預，但長期進行西藥治療，不良反應較多，嚴重甚至能夠造成心動過緩及心律失常等〔8〕。miR在生物系統(tǒng)中廣泛表達，能夠控制基因在生理及病理過程中表達〔9〕。隨著對miR研究的不斷進步，發(fā)現(xiàn)在細胞周期的調(diào)節(jié)、分化、增殖與凋亡及血管生成中均有參與〔10〕。相關(guān)研究顯示，miR還在代謝疾病、癌癥及心血管疾病等多種人類疾病的病因中有著密切聯(lián)系〔11〕。

miR-29家族是在2001年被發(fā)現(xiàn)，其中包括miR-29a、miR-29b及miR-29c，在調(diào)節(jié)細胞增殖、分化、免疫反應、組織纖維化及神經(jīng)成熟、腫瘤形成和轉(zhuǎn)移等較多的生理過程中均有參與〔12〕。相關(guān)研究顯示，通過增加小鼠外源性miR-29b能夠抑制心臟纖維化，同時改善心功能〔13〕。在腎臟纖維化中，通過上調(diào)miR-29b表達，能夠顯著減輕腎臟纖維化。血清中的miR-29b表達量在腦血管疾病中較高，能夠促進血管平滑肌鈣化，同時促進內(nèi)皮細胞的增殖，使斑塊快速破裂。VEGF能夠促使內(nèi)皮細胞進行分裂與增殖，同時促進炎性細胞在血管壁進行黏附，進而加重動脈硬化病情〔14〕。本研究結(jié)果說明，miR-29b參與動脈硬化的發(fā)生發(fā)展，且過表達miR-29b能夠抑制動脈硬化病情進展。在動脈硬化中伴有明顯的血管內(nèi)皮損傷，當出現(xiàn)內(nèi)皮損傷時，內(nèi)皮細胞含量開始發(fā)生變化，其中ET-1與NO均由內(nèi)皮細胞所分泌，兩者均是能夠直接反映出現(xiàn)內(nèi)皮功能紊亂重要標志物〔15〕。相關(guān)研究顯示，當NO/ET-1出現(xiàn)失衡，將導致出現(xiàn)血管內(nèi)皮功能紊亂，進而出現(xiàn)動脈粥樣硬化〔16〕。ET-1在內(nèi)皮受損時含量將會明顯增加，能夠收縮血管、促進平滑肌增殖等，NO能夠舒張血管，抑制平滑肌增殖，是抑制動脈硬化的內(nèi)皮保護因子〔17〕。本研究結(jié)果說明，miR-29b過表達能夠減輕動脈硬化中血管內(nèi)皮損傷，改善內(nèi)皮功能。動脈硬化作為由多種因素所誘發(fā)的綜合性疾病，氧化應激在其中具有重要作用〔18〕。能夠在早期促進動脈硬化形成脂質(zhì)條紋、損傷血管內(nèi)皮細胞、促進炎癥因子的釋放等〔19〕。在氧化應激過程中能夠產(chǎn)生較多的氧自由基，對內(nèi)皮造成損傷。其中，ROS能夠反映出集體氧自由基總量，MDA能夠反映出機體內(nèi)脂質(zhì)過氧化程度,SOD能夠?qū)ρ踝杂苫M行清除。相關(guān)研究顯示，當機體內(nèi)出現(xiàn)ROS與MDA增多，SOD較少，能夠使血管內(nèi)皮出現(xiàn)氧化損傷，并促進動脈粥樣硬化的進展〔20〕。本研究結(jié)果說明，miR-29b過表達能夠減輕動脈硬化大鼠中氧化應激損傷。炎癥因子的表達在動脈硬化進展中有著關(guān)鍵作用。其中炎癥因子不僅能夠?qū)е卵軆?nèi)皮損傷加重，同時隨著病情的發(fā)展，能夠促進動脈硬化的加速形成〔21〕。其中TGF-β1能夠促進血管中內(nèi)皮細胞的分裂，當巨噬細胞受到刺激，進而釋放出大量的MCP-1，使得大量MCP-1在血管內(nèi)膜聚集，進而導致動脈硬化發(fā)生發(fā)展得到加重。IL-8為關(guān)鍵的慢性血管促炎因子，能夠通過趨化及激活中性粒細胞及分泌黏附分子，在動脈硬化過程中進行參與〔22〕。本研究結(jié)果說明，miR-29b過表達能夠抑制炎癥反應及動脈硬化的形成。

綜上，在動脈硬化模型大鼠中，miR-29b明顯參與其中，通過進行過表達miR-29b干預，能夠抑制動脈硬化病情進展，減輕炎癥反應及氧化應激損傷，改善內(nèi)皮功能，且能夠抑制動脈硬化的形成。