彭燕瓊 彭毅 楊彬 廖倩 王月 杜榮 胡漢華 孫環(huán) 馬艷

(1武漢市第一醫(yī)院公共衛(wèi)生科，湖北 武漢 430000；2湖北省腫瘤醫(yī)院消化科；3武漢市第一醫(yī)院康復(fù)醫(yī)學(xué)科)

絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松(PMOP)是中老年婦女常見(jiàn)的一種全身性代謝性骨科疾病，病理特征以骨密度(BMD)減少，骨微結(jié)構(gòu)破壞，骨脆性增加，骨強(qiáng)度降低為主，導(dǎo)致患者易發(fā)生骨折，明顯增加中老年婦女病殘、病死率〔1，2〕。丹參素是中藥丹參中的多酚類活性成分，具有減輕細(xì)胞凋亡、抑制炎癥的作用，可上調(diào)骨保護(hù)素(OPG)的表達(dá)，增強(qiáng)成骨細(xì)胞增殖分化，抑制其凋亡，促進(jìn)牙槽骨成骨形成，并增加骨質(zhì)疏松大鼠BMD，改善其臨床癥狀〔3，4〕，但其藥理機(jī)制目前還未研究清楚。轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF)-β/Smad信號(hào)通路在成骨分化過(guò)程中起著直接而關(guān)鍵的作用，上調(diào)TGF-β1表達(dá)，可提高Smad3磷酸化水平，增強(qiáng)成骨細(xì)胞功能，促使骨形成，減輕骨量丟失，明顯改善糖皮質(zhì)激素及卵巢功能減退引起的骨質(zhì)疏松癥狀，因此TGF-β/Smad信號(hào)可作為骨質(zhì)疏松的一個(gè)重要治療靶點(diǎn)〔5～7〕。丹參素是否可調(diào)控卵巢去勢(shì)骨質(zhì)疏松大鼠TGF-β/Smad信號(hào)通路的表達(dá)，目前還未見(jiàn)報(bào)道。本文丹擬分析參素對(duì)卵巢去勢(shì)骨質(zhì)疏松大鼠TGF-β/Smad信號(hào)通路的影響。

1 材料與方法

1.1動(dòng)物 SD大鼠購(gòu)自廣州相觀生物科技有限公司，許可證號(hào)SCXK(粵)2018-0043，清潔級(jí)，雌性，體重(200±20)g，所有大鼠在安靜、通風(fēng)良好的動(dòng)物房中飼養(yǎng)，室內(nèi)環(huán)境保持清潔級(jí)，溫度25℃，相對(duì)濕度55%，12 h/12 h間斷照明，大鼠自由進(jìn)食、飲水。

1.2主要試劑及儀器 丹參素，純度：≥98%，貨號(hào)E-1147，購(gòu)自上海同田生物技術(shù)股份有限公司；雌激素(戊酸雌二醇片)，國(guó)藥準(zhǔn)字J20130009，購(gòu)自拜耳醫(yī)藥保健有限公司;大鼠OPG酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測(cè)試劑盒、大鼠核因子κB受體活化因子配體(RANKL)ELISA檢測(cè)試劑盒，貨號(hào)E2015-1102B、E20151102B，購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司；兔源抗TGF-β1一抗、抗p-Smad3一抗、抗Smad3一抗、抗GAPDH一抗、羊抗兔二抗，貨號(hào)ab215715、ab40854、ab63403、ab181602、ab150077，購(gòu)自美國(guó)Abcam公司；RIPA裂解液、BCA試劑盒，貨號(hào)為P0013K、P0011，購(gòu)自上海碧云天公司等。雙能X線骨密度測(cè)量?jī)x，型號(hào)LUNAR-Prodigy，購(gòu)自美國(guó)GE公司；骨科生物力學(xué)測(cè)試儀，型號(hào)MX-0580，購(gòu)自江蘇摩信工業(yè)系統(tǒng)有限公司；灰化爐，型號(hào)F30400-60，購(gòu)自賽默飛世爾科技公司；酶標(biāo)儀，型號(hào)XElx800，購(gòu)自美國(guó) Perkin Elmer 公司；蛋白電泳儀、轉(zhuǎn)膜儀，型號(hào)1659001、Trans-Blot Turbo，購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司；低溫高速離心機(jī)，型號(hào)Centrifuge 5424R，購(gòu)自德國(guó)Eppendorf股份公司；凝膠成像儀，型號(hào)GIS-500，購(gòu)自Miulab公司等。

1.3方法

1.3.1動(dòng)物模型制備及分組給藥 參考文獻(xiàn)〔8〕制備大鼠模型：腹腔注射30 mg/kg的5%戊巴比妥鈉溶液，對(duì)SD大鼠進(jìn)行麻醉，俯臥位固定于操作臺(tái)，經(jīng)背部開(kāi)腹，移除雙側(cè)卵巢，止血后縫合、消毒，5 w后，檢測(cè)大鼠股骨BMD明顯降低，表明模型制備成功。共建模64只，成功60只，隨機(jī)分為模型組、丹參素低劑量組、丹參素中劑量組、丹參素高劑量組、雌激素組，每組12只，另取12只SD大鼠僅做背部開(kāi)腹處理，不移除雙側(cè)卵巢，設(shè)為假手術(shù)組。

參照文獻(xiàn)，以生理鹽水溶解丹參素和雌激素，制備為1、2、4 mg/ml的丹參素〔9〕溶液及0.009 mg/ml的雌激素〔10〕溶液，藥物處理組以10 ml/kg的劑量灌胃，假手術(shù)組與模型組大鼠以同劑量生理鹽水灌胃，每天1次，持續(xù)28 d。

1.3.2大鼠股骨BMD檢測(cè)及標(biāo)本收集 末次給藥結(jié)束后24 h，采用注射器經(jīng)尾靜脈取血2 ml，靜置10 min，4℃，1 000 r/min，離心15 min，收集上清液，得到血清，儲(chǔ)存在-80℃冰箱中備用；以吸入乙醚的方法麻醉大鼠，處死分離兩側(cè)股骨，去除附著組織后，置于生理鹽水中漂洗干凈，右側(cè)股骨備用，采用BMD測(cè)量?jī)x檢測(cè)大鼠左側(cè)股骨BMD，然后截?cái)喙晒?，用刮匙刮取斷面處約0.5 g骨組織，置于RIPA裂解液中，以勻漿機(jī)制備為勻漿液，4℃，1 000 r/min，離心20 min，取上清液，采用BCA法測(cè)定其中總蛋白濃度(具體步驟參照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行)，然后將各組蛋白濃度調(diào)整相同后，儲(chǔ)存在-80℃冰箱中備用。

1.3.3大鼠股骨骨生物力學(xué)檢測(cè) 將1.3.2中的右側(cè)股骨放置在骨科生物力學(xué)測(cè)試儀的兩個(gè)支撐點(diǎn)上，保持水平，跨度為20 mm，然后下壓探頭至股骨中段，速率為10 mm/min，直至其斷裂，以儀器自帶的軟件記錄并分析數(shù)據(jù)，獲得骨生物力學(xué)指標(biāo)彈性模量、最大載荷、屈服載荷的數(shù)值。

1.3.4大鼠骨礦物鹽含量檢測(cè)1.3.2中的左側(cè)股骨放置在烤箱中烘烤，直至重量不再變化，記錄最后一次重量，記為干重，然后將其轉(zhuǎn)移至灰化爐中灰化，650℃，36 h，取出灰分稱量，得出灰分重量，骨礦物鹽含量=灰分重量/干重。

1.3.5大鼠RANKL、OPG水平檢測(cè) 取出1.3.2中血清，置于冰水浴中解凍，以ELISA試劑盒檢測(cè)其中RANKL、OPG水平，具體步驟參照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.3.6大鼠骨組織TGF-β/Smad通路蛋白表達(dá)檢測(cè) 取出1.3.2中蛋白樣品液，煮沸變性后，各組取15 μl上樣，進(jìn)行電泳，濕轉(zhuǎn)，電轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，置于5%脫脂奶粉溶液中室溫孵育1 h，封閉，分別以兔源抗TGF-β1一抗、抗p-Smad3一抗、抗Smad3一抗、抗GAPDH一抗溶液于4℃孵育過(guò)夜(稀釋比例分別為1∶2 000、1∶2 500、1∶1 000、1∶5 000)，TBST溶液洗膜，以羊抗兔二抗溶液于室溫孵育2 h(稀釋比例為：1∶2 000)，TBST溶液洗膜，以增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法顯色，使用凝膠成像儀對(duì)蛋白條帶拍照，并采用ImageJ軟件分析圖片，得出蛋白相對(duì)表達(dá)水平。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS24.0軟件單因素方差分析、LSD-t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1丹參素對(duì)大鼠股骨BMD的影響 與假手術(shù)組相比，模型組BMD明顯降低(P<0.05)。與模型組相比，丹參素低、中、高劑量組和雌激素組BMD升高，且丹參素各組之間呈劑量依賴性，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，丹參素高劑量組和雌激素組BMD差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)表1。

2.2丹參素對(duì)大鼠股骨生物力學(xué)的影響 與假手術(shù)組相比，模型組彈性模量、最大載荷、屈服載荷明顯降低(P<0.05)。與模型組相比，丹參素低、中、高劑量組和雌激素組彈性模量、最大載荷、屈服載荷升高，且丹參素各組之間呈劑量依賴性，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；丹參素高劑量組和雌激素組彈性模量、最大載荷、屈服載荷差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)表1。

表1 各組股骨BMD及彈性模量、最大載荷、屈服載荷比較

2.3丹參素對(duì)大鼠股骨骨礦鹽含量的影響 與假手術(shù)組相比，模型組骨礦鹽含量明顯降低(P<0.05)。與模型組相比，丹參素低、中、高劑量組和雌激素組骨礦鹽含量升高，且丹參素各組之間呈劑量依賴性，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；丹參素高劑量組和雌激素組骨礦鹽含量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)表2。

2.4丹參素對(duì)大鼠血清RANKL和OPG水平的影響 與對(duì)照組相比，模型組血清OPG水平明顯降低，RANKL水平明顯升高(P<0.05)。與模型組相比，丹參素低、中、高劑量組和雌激素組血清OPG水平升高，RANKL水平降低，且丹參素各組之間呈劑量依賴性，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；丹參素高劑量組和雌激素組血清RANKL、OPG水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)表2。

2.5各組骨組織TGF-β/Smad通路蛋白表達(dá)比較 與假手術(shù)組相比，模型組骨組織TGF-β/Smad通路TGF-β1蛋白表達(dá)、p-Smad3/Smad3顯著降低(P<0.05)。與模型組相比，丹參素低、中、高劑量組和雌激素組骨組織TGF-β1蛋白表達(dá)、p-Smad3/Smad3升高，且丹參素各組之間呈劑量依賴性，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；丹參素高劑量組和雌激素組骨組織TGF-β1蛋白表達(dá)、p-Smad3/Smad3差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)表2、圖1。

表2 各組股骨骨礦鹽含量、血清RANKL、OPG水平及骨組織TGF-β/Smad通路蛋白相對(duì)表達(dá)比較

1～6：假手術(shù)組、模型組、丹參素低劑量組、丹參素中劑量組、丹參素高劑量組、雌激素組圖1 免疫印跡檢測(cè)各組骨組織TGF-β/Smad 通路蛋白表達(dá)

3 討 論

女性步入老年進(jìn)程時(shí)，卵巢功能衰退，體內(nèi)雌激素水平降低，破壞機(jī)體骨代謝平衡，上調(diào)RANKL表達(dá)，促進(jìn)骨吸收，下調(diào)OPG表達(dá)，抑制骨形成，進(jìn)而引發(fā)骨量減少，BMD降低，最終導(dǎo)致PMOP〔11～13〕。去除雙側(cè)卵巢是復(fù)制PMOP動(dòng)物模型常用的方法，操作簡(jiǎn)便，成功率高〔14〕。本文結(jié)果表明，摘除大鼠雙側(cè)卵巢，可下調(diào)OPG表達(dá)，上調(diào)RANKL表達(dá)，降低BMD，減輕骨礦化，破壞骨生物力學(xué)，造成骨丟失，揭示模型建立成功。

骨質(zhì)疏松的臨床治療藥物以維生素D、鈣劑、雌激素等為主，其中雌激素是治療PMOP最常用的藥物，但其長(zhǎng)期療效并不理想，且可增加乳腺癌和心血管疾病的患病風(fēng)險(xiǎn)，因而，尋找一種安全有效的新型藥物具有重要的臨床意義〔10，15,16〕。丹參素是提取自丹參的有效成分之一，對(duì)炎癥反應(yīng)、細(xì)胞增殖分化、骨代謝過(guò)程具有調(diào)節(jié)作用，可降低RANKL/OPG比值，抑制破骨細(xì)胞形成，防治牙槽骨吸收，并促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖，增強(qiáng)骨形成，明顯改善骨質(zhì)疏松狀〔17,18〕。本文結(jié)果表明丹參素可下調(diào)RANKL表達(dá)，促進(jìn)OPG表達(dá)，增強(qiáng)骨礦化，提高骨密度，改善骨生物力學(xué)損傷癥狀，并隨劑量升高而作用增強(qiáng)，進(jìn)一步證實(shí)了丹參素對(duì)骨質(zhì)疏松的療效。

TGF-β/Smad信號(hào)對(duì)骨代謝平衡具有關(guān)鍵的調(diào)控作用，是治療骨質(zhì)疏松的一個(gè)重要治療靶點(diǎn)。研究顯示，在骨質(zhì)疏松病理進(jìn)程中，TGF-β/Smad信號(hào)傳導(dǎo)受到抑制，淫羊藿和女貞子水煎液可上調(diào)TGF-β1表達(dá)，增強(qiáng)Smad3磷酸化，抑制骨吸收，促進(jìn)骨形成，緩解糖皮質(zhì)激素性骨質(zhì)疏松大鼠骨生物力學(xué)特性及小梁結(jié)構(gòu)的損傷〔19〕。郝喆等〔20〕發(fā)現(xiàn)，敲除卵巢去勢(shì)小鼠白細(xì)胞介素(IL)-31基因，可明顯激活TGF-β/Smad信號(hào)，抑制成骨細(xì)胞凋亡，促進(jìn)成骨形成，顯著抑制骨質(zhì)疏松的進(jìn)展，改善其臨床癥狀。本文結(jié)果表明，丹參素可激活該通路，促使Smad3磷酸化，提高卵巢去勢(shì)骨質(zhì)疏松大鼠骨密度，改善其骨量減少癥狀。

綜上所述，丹參素可上調(diào)TGF-β表達(dá)，增強(qiáng)Smad3磷酸化，調(diào)控RANK-OPG通路表達(dá)，降低RANKL/OPG比值，增強(qiáng)骨礦化，促使骨形成，提高BMD，緩解骨生物力學(xué)受損，改善卵巢去勢(shì)骨質(zhì)疏松大鼠骨量丟失癥狀，激活TGF-β/Smad信號(hào)可能是其藥理機(jī)制。但未對(duì)TGF-β/Smad信號(hào)下游調(diào)控機(jī)制進(jìn)行深入研究，且亦未激活或抑制該通路進(jìn)行對(duì)照驗(yàn)證，需后續(xù)進(jìn)行深入研究。