王曉偉 余小柱 郭二霞 王會(huì)霞 高華山

(1平頂山學(xué)院，河南 平頂山 467092；2平頂山市中醫(yī)院；3平頂山市第五人民醫(yī)院)

糖尿病腎病是造成終末期腎衰竭的主要因素，主要表現(xiàn)為腎功能降低和蛋白尿增加〔1〕。細(xì)胞自噬活化與糖尿病腎病的好轉(zhuǎn)有重要關(guān)系，而細(xì)胞自噬受條件影響對(duì)細(xì)胞凋亡既可以促進(jìn)也可以抑制，磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)蛋白增加可激活哺乳動(dòng)物雷帕霉素蛋白(mTOR)通路，進(jìn)而抑制細(xì)胞自噬作用〔2〕。中晚期腎病的病理學(xué)基礎(chǔ)主要是腎臟纖維化〔3〕。沉默信息調(diào)節(jié)因子(SIRT)1存在于細(xì)胞核中，廣泛表達(dá)于哺乳動(dòng)物的成熟器官中，對(duì)細(xì)胞損傷和器官具有較好的保護(hù)作用〔4〕。熱休克蛋白(Hsp)90屬于保守性較高的伴侶分子，廣泛存在于生物體內(nèi)，可通過結(jié)合功能蛋白保證蛋白分子能正常折疊并維持其功能〔5〕。蛇床子素是從中藥蛇床子中提取出的主要活性成分，具有抗氧化、抗凋亡及抗炎作用，且對(duì)肝細(xì)胞的增殖分化具有明顯的促進(jìn)作用〔6〕。因此本文研究蛇床子素通過PI3K/Akt/mTOR通路對(duì)糖尿病腎病大鼠纖維化及HsP90及SIRT1的影響。

1 材料與方法

1.1動(dòng)物 48只雄性SD大鼠，SFP級(jí)，體重(200±20)g，動(dòng)物許可證號(hào)：SYXK(京)2019-0054。

1.2試劑與儀器 蛇床子素(廣東海賽特藥業(yè)有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字Z20191001)；PI3K抗體(Cell Signaling公司)；Akt抗體(Affinit公司)；兔抗SIRT1多克隆抗體(美國(guó)LSBio公司)；尿微量白蛋白酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)試劑盒(武漢伊萊瑞特生物科技有限公司)；Anti-Hsp90α和β抗體(Abcam公司)；電泳儀和聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)儀(美國(guó)伯樂公司)。

1.3分組與造模 將大鼠隨機(jī)分為6組，每組8只，一組為正常組，其余5組均給予造模。所有大鼠均正常飼養(yǎng)，喂養(yǎng)3 d后，將除正常組外的所有大鼠均給予腹腔注射55 mg/kg鏈脲佐菌素，正常組給予等體積的檸檬酸緩沖鹽。給藥后對(duì)大鼠飲食、飲水量和24 h的尿量進(jìn)行觀察，并于72 h后于大鼠尾尖采血，測(cè)定空腹時(shí)血糖，檢測(cè)尿糖情況，連續(xù)3 d，當(dāng)大鼠空腹血糖高于16.7 mmol/L或隨機(jī)血糖大于22.2 mmol/L，表示尿糖為強(qiáng)陽性，尿量比正常組尿量多150%，且連續(xù)3 d達(dá)到上述標(biāo)準(zhǔn)，表示糖尿病大鼠造模成功。將造模后大鼠隨機(jī)分為5組：模型組、不同劑量治療組(分別灌胃蛇床子素1、10、20和50 mg/kg)，正常組和模型組分別給予相同體積的生理鹽水。

1.4觀察參數(shù) 分別于給藥前和給藥8 w后，測(cè)定大鼠血糖變化；收集大鼠24 h的尿液，測(cè)定24 h尿微量白蛋白；取血檢測(cè)大鼠血肌酐(Scr)、血尿素氮(BUN)，并計(jì)算肌酐清除率(Ccr)。采用Western印跡檢測(cè)方法，取大鼠腎組織，勻漿，加磷酸鹽緩沖液(PBS)離心后裂解，將總蛋白提取出來，并用二喹啉甲酸(BCA)蛋白試劑盒對(duì)蛋白的濃度進(jìn)行測(cè)定。然后以actin為內(nèi)參，通過電泳，轉(zhuǎn)模，抗體賦予和顯色成像測(cè)定PI3K和Akt蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.5RT-聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)檢測(cè) 取腎組織勻漿后提取總RNA，通過逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA并以該cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增條件為95℃變性30 s、預(yù)變性5 s，然后60℃退火，30 s，循環(huán)40次。計(jì)算SIRT1、Hsp90α和Hsp90β mRNA表達(dá)情況。

1.6Western印跡檢測(cè) 取腎臟組織，勻漿后離心提取總蛋白，測(cè)定蛋白濃度。然后進(jìn)行電泳、轉(zhuǎn)模、抗體孵育過夜，電化學(xué)發(fā)光(ECL)化學(xué)發(fā)光法成像，測(cè)定大鼠SIRT1、Hsp90α和Hsp90β 蛋白表達(dá)情況。采用ImageJ軟件進(jìn)行半定量。

1.7腎臟組織病理染色 實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，取部分腎臟組織，多聚甲醛固定，脫水，包埋石蠟，切片，蘇木素-伊紅(HE)染色，用后置光學(xué)顯微鏡觀察腎臟的病理情況。

1.8腎纖維化檢測(cè) 采用Western印跡檢測(cè)纖維化相關(guān)蛋白：腎臟Ⅳ型膠原蛋白、纖聯(lián)蛋白(FN)、基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)抑制劑(TIMP)-1和MMP-9，具體步驟如下：勻漿，裂解，提取總蛋白，BCA法測(cè)定蛋白濃度，電泳、轉(zhuǎn)模、加抗體室溫孵育2 h，以磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)為內(nèi)參，ECL化學(xué)發(fā)光法顯影，采用ImageJ軟件進(jìn)行半定量。

1.9統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS22.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1各組血糖和尿微量白蛋白水平變化 模型組血糖和尿微量白蛋白均顯著高于正常組(P<0.05)，蛇床子素不同劑量組上述參數(shù)與模型組相比均顯著降低(P<0.05)，且具有劑量依賴性。見表1。

表1 各組血糖、尿微量白蛋白、Scr、BUN、Ccr、PI3K及Akt水平變化

2.2各組Scr、BUN和Ccr水平變化 模型組Scr和BUN水平顯著高于正常組，Ccr水平顯著低于正常組水平(均P<0.05)；與模型組相比，蛇床子素不同劑量組Scr和BUN水平均降低，Ccr水平均增加，當(dāng)劑量達(dá)到20和50 mg/(kg·d)時(shí)顯著(P<0.05)。見表1。

2.3各組PI3K和Akt蛋白表達(dá) 模型組PI3K和Akt水平顯著高于正常組(P<0.05)，蛇床子素不同劑量組與模型組相比，PI3K和Akt水平均降低，且具有劑量依賴性，劑量達(dá)到10、20、50 mg/(kg·d)時(shí)PI3K明顯降低(P<0.05)，劑量達(dá)到1、10、20、50 mg/(kg·d)時(shí)，Akt明顯降低(P<0.05)。見表1、圖1。

2.4各組SIRT1、Hsp90α和Hsp90β mRNA表達(dá)模型組SIRT1 mRNA表達(dá)水平顯著低于正常組(P<0.05)，蛇床子素不同劑量組與模型組相比，SIRT1 mRNA表達(dá)水平均顯著增加(P<0.05)；各組Hsp90α和Hsp90β mRNA表達(dá)水平均無顯著差異(P>0.05)。見表2。

1～6：正常組、模型組、蛇床子素1、10、20、50 mg/kg組圖1 各組PI3K和Akt蛋白表達(dá)

表2 各組SIRT1、Hsp90α和Hsp90β mRNA及腎臟Ⅳ型膠原蛋白、FN、TIMP-1、MMP-9蛋白表達(dá)

2.5各組SIRT1、Hsp90α和Hsp90β蛋白表達(dá) 模型組SIRT1 蛋白表達(dá)水平顯著低于正常組(P<0.05)，蛇床子素不同劑量組與模型組相比，SIRT1 蛋白表達(dá)水平均顯著增加(均P<0.05)；各組Hsp90α和Hsp90β 蛋白表達(dá)水平均無顯著差異(P>0.05)。見表2、圖2。

1～6：正常組、模型組、蛇床子素1、10、20、50 mg/kg組圖2 各組SIRT1、Hsp90α和Hsp90β蛋白表達(dá)

2.6各組腎纖維化情況 與正常組相比，模型組腎臟Ⅳ型膠原蛋白、FN和TIMP-1水平顯著增加，MMP-9顯著降低，蛇床子素不同劑量組腎臟Ⅳ型膠原蛋白、FN和TIMP-1水平均顯著低于模型組，MMP-9水平顯著高于模型組水平(P<0.05)，且呈現(xiàn)劑量依賴性。見表2、圖3。

1～6：正常組、模型組、蛇床子素1、10、20、50 mg/kg組圖3 各組腎纖維化相關(guān)蛋白表達(dá)水平

2.7各組腎臟組織病理情況 與正常組比較，模型組腎小球肥大，腎小球數(shù)量增加，伴有腎小球系膜擴(kuò)張和基底膜厚度增加，腎小管有空泡變形。蛇床子素不同劑量組腎小球肥大、增生及系膜擴(kuò)張和基底膜變后現(xiàn)象均較輕，其中高劑量治療組改善最顯著。見圖4。

圖4 各組腎臟組織病理(HE染色，×400)

3 討 論

糖尿病腎病是糖尿病主要的慢性微血管并發(fā)癥，主要病理包括腎小球基底膜便后和系膜擴(kuò)張、腎小球硬化、腎小管空泡變性及腎間質(zhì)纖維化〔7〕。研究發(fā)現(xiàn)腎臟細(xì)胞自噬對(duì)糖尿病腎病具有改善作用，影響自噬作用的信號(hào)通路有多種，通過增加上游PI3K/Akt蛋白表達(dá)水平可激活mTOR通路，進(jìn)而對(duì)細(xì)胞自噬起到一定的調(diào)節(jié)作用〔8，9〕。以往研究結(jié)果顯示蛇床子素可以降低糖尿病模型大鼠p-Akt蛋白的表達(dá)水平，而使用PI3K抑制劑后對(duì)p-Akt蛋白的表達(dá)水平有抑制作用，證明蛇床子素對(duì)PI3K/Akt/mTOR通路具有抑制作用〔10〕。與本研究結(jié)果一致。

Scr是內(nèi)生肌酐，在反映患者腎損傷方面準(zhǔn)確度較高，是腎功能變化的重要參考指標(biāo)，其被腎小球率過后可隨尿液被排出，且與尿量無關(guān)，患者腎損傷時(shí)Scr水平增加〔11〕。BUN屬于體內(nèi)蛋白代謝產(chǎn)物，在血液中以小分子形式存在，經(jīng)腎小球過濾進(jìn)原尿，之后大部分又被腎小管重吸收，當(dāng)腎受損時(shí)，導(dǎo)致血中BUN水平升高〔12〕。Ccr是評(píng)價(jià)腎功能的重要參數(shù)，可用于評(píng)估腎小球的濾過率〔13〕。本研究結(jié)果提示，蛇床子素抑制了PI3K/Akt/mTOR通路，激活腎臟細(xì)胞自噬保護(hù)機(jī)制，改善腎臟病理及腎功能。

腎臟Ⅳ型膠原蛋白和FN可導(dǎo)致腎間質(zhì)纖維化和腎小球硬化〔14，15〕。MMP-9與腎纖維化具有密切關(guān)系，細(xì)胞外基質(zhì)累積會(huì)引起腎小球硬化和腎纖維化，而MMP-9對(duì)細(xì)胞外基質(zhì)的降解具有促進(jìn)作用〔7，16〕。TIMP對(duì)MMP-9的活性具有抑制作用，進(jìn)而維持細(xì)胞外基質(zhì)降解和沉積兩者之間的平衡〔17～19〕。本研究結(jié)果提示，蛇床子素可通過PI3K/Akt/mTOR通路對(duì)改善糖尿病腎病大鼠纖維化。

SIRT1是乙?；附M蛋白家族的基因，廣泛表達(dá)于成熟器官中，可調(diào)節(jié)能量代謝，具有抗氧化、抗感染及抗細(xì)胞凋亡作用，可通過調(diào)節(jié)信號(hào)通路保護(hù)細(xì)胞，維持器官功能，降低細(xì)胞損傷〔20，21〕。Hsp90具有良好的蛋白折疊及功能維護(hù)作用，可有效抵抗熱應(yīng)激和氧化作用對(duì)蛋白功能的影響，包括Hsp90α和Hsp90β兩個(gè)亞型，其在內(nèi)皮細(xì)胞、細(xì)胞骨架和細(xì)胞核中均有存在〔22〕。本研究結(jié)果提示，蛇床子素上調(diào)糖尿病腎病大鼠SIRT1表達(dá)水平。主要原因是蛇床子素可以通過抑制PI3K/Akt/mTOR通路降低腎臟細(xì)胞損傷，起到抗感染和抗氧化作用，進(jìn)而保護(hù)腎臟細(xì)胞〔23〕。

綜上，蛇床子素可以降低糖尿病腎病大鼠尿微量白蛋白，降低腎組織病理損傷，可能與PI3K/Akt/mTOR通路有關(guān)，且可以上調(diào)SIRT1表達(dá)水平，降低腎纖維化，對(duì)HSP90表達(dá)水平無明顯關(guān)系。