劉倩峰 楊佩璇 龐超 李慶星 周金闊

(河北醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院 1口腔科，河北 石家莊 050031；2病理科)

口腔鱗狀細(xì)胞癌(OSCC)是頭頸部最常見的惡性腫瘤。手術(shù)是OSCC患者的一線治療方法。然而，外科治療使患者出現(xiàn)嚴(yán)重的口腔功能障礙，導(dǎo)致吞咽困難和構(gòu)音困難〔1〕。因此，OSCC探索早期診斷和治療方法成為近年來研究的重要方向。研究發(fā)現(xiàn)，一些腫瘤基因和抑癌基因可能在促進(jìn)或啟動(dòng)OSCC的發(fā)展中起著關(guān)鍵作用〔2〕。因此，闡明基因組和表觀基因組參與多步驟癌變和OSCC進(jìn)展的機(jī)制具有重要意義。MicroRNA-7-5P(miR-7-5p) 由具有發(fā)夾結(jié)構(gòu)的單鏈前體RNA-7-5P經(jīng)過Dicer酶加工后生成〔3〕，其在OSCC中的研究較少，研究表明miR-7在癌細(xì)胞中會(huì)發(fā)生啟動(dòng)子甲基化〔4〕。也有研究提出miR-7的異常表達(dá)參與了舌鱗狀細(xì)胞癌的增殖和凋亡〔5〕。但這些研究證據(jù)尚不充足，尤其是miR-7-5p在OSCC中的作用，有待進(jìn)一步探究。

周期素依賴性激酶(CDK)-10，是細(xì)胞分裂周期蛋白(Cdc)2激酶家族的一員，在細(xì)胞周期從G2期向M期發(fā)展過程中起重要作用〔6〕。研究發(fā)現(xiàn)CDK-10在多種腫瘤組織中的表達(dá)升高，提示CDK-10是一種抑癌基因〔7〕,然而，CDK-10在OSCC中表達(dá)模式及miR-7-5p對(duì)CDK-10調(diào)控作用尚不清楚。本研究重點(diǎn)探索miR-7-5p在OSCC中的表達(dá)及其調(diào)控CDK-10對(duì)細(xì)胞增殖、凋亡與周期影響。

1 資料與方法

1.1臨床標(biāo)本 收集河北醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院病理科68例OSCC患者的OSCC樣本組織和匹配的鄰近組織(距腫瘤邊緣至少2 cm)。OSCC患者術(shù)前均未接受放療或化療。另收集臨床健康志愿者50例，獲取OSCC患者術(shù)前及健康志愿者的空腹血清樣本。樣本均由病理學(xué)專家驗(yàn)證，立即在液氮中冷凍。本研究獲得醫(yī)院倫理審查委員會(huì)批準(zhǔn)，所有患者知情同意。

1.2血清miR-7-5p和CDK-10蛋白表達(dá)檢測(cè) 采用RT-qPCR分析血清miR-7-5p表達(dá)，酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)分析血清CDK-10蛋白表達(dá)。RNA分離與RT-qPCR分析，用QIAzol試劑(德國Duesseldorf，Qiagen)提取總RNA，用cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(文氏酵母，Waltham，MA)合成cDNA。按商品說明書，使用SYBR-綠色PCR試劑盒(Invitrogen，Carlsbad，CA)進(jìn)行RT-qPCR。U6 snRNA用于miR-7-5p的正常對(duì)照，GAPDH用于OXR1 mRNA的正常對(duì)照。ELISA檢測(cè)CDK-10蛋白參照試劑盒說明書進(jìn)行。

1.3細(xì)胞系與細(xì)胞培養(yǎng) OSCC細(xì)胞株SCC-25細(xì)胞在含10%胎牛血清(FBS)的DMEM中培養(yǎng)。收集對(duì)數(shù)期細(xì)胞，接種于6孔板(1×10/孔)中。當(dāng)細(xì)胞達(dá)到80%匯合時(shí)，按照制造商的程序，使用脂質(zhì)體2000(Invitrogen)將miR-7-5p-模擬物(mimics)(100 nmol/L)、miR-7-5p-抑制劑(inhibitor，100 nmol/L)和空白質(zhì)粒(100 nmol/L)轉(zhuǎn)染細(xì)胞，分別作為miR-7-5p過表達(dá)組、miR-7-5p抑制組、空白對(duì)照組，轉(zhuǎn)染48 h后取細(xì)胞。

1.4Western印跡分析 用細(xì)胞裂解試劑(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)裂解細(xì)胞，提取總蛋白。蛋白質(zhì)濃度用Bradford法測(cè)定。用10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠分離蛋白質(zhì)，并將其電轉(zhuǎn)移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜(GE Healthcare，Little Chalfont，Buckinghamshire，UK)上，在5%脫脂牛奶中室溫孵育1.5 h。含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(Caspase)3/8/9抗體，CDK-10抗體、B淋巴細(xì)胞瘤-2基因(Bcl-2)相關(guān)X蛋白(Bax)抗體、Bcl-2抗體和GAPDH(Sigma-Aldrich，目錄號(hào)：SAB2701826)在1∶1 000稀釋，然后在4℃下與膜一起孵育過夜。第2天將辣根過氧化物酶(HPR)-結(jié)合的二級(jí)抗體添加到膜中并孵育1 h。使用融合SL成像系統(tǒng)(Viber Lourmat，法國)顯色，以GAPDH為內(nèi)對(duì)照。膠片拍照，用凝膠圖像處理系統(tǒng)分析目標(biāo)帶的光密度(OD)值。

1.5雙熒光素酶報(bào)告分析 miR-7-5p和CDK-10的結(jié)合位點(diǎn)使用網(wǎng)站http://www.Target Scan.org預(yù)測(cè)，利用PmiRGLO雙熒光素酶miRNA靶向表達(dá)載體(E1330；Promega，Madison，WI)構(gòu)建miR-7-5p-CDK-10報(bào)告基因。分為空白對(duì)照組(轉(zhuǎn)染miR-7-5p NC)和miR-7-5p過表達(dá)組(轉(zhuǎn)染miR-7-5p mimics)，用Lipidosome2000(Invitrogen)共轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞用雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)(Promega)測(cè)定熒光素酶活性。

1.6MTT法和乳酸脫氫酶(LDH)活性檢測(cè) 細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h后，收集的細(xì)胞種在96孔板(2×10個(gè)/孔)。向每個(gè)孔中加入20 μl 5 g/L MTT溶液(Sigma，Saint Louis，MO)，孵育4 h，然后加入150 μl二甲基亞砜(DMSO)，再孵育15 min。在570 nm波長(zhǎng)處測(cè)量光吸收率。細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h后，收集的細(xì)胞種在96孔板(2×10個(gè)/孔)。根據(jù)試劑和說明書，檢測(cè)LDH活性，在450 nm波長(zhǎng)處測(cè)量光吸收率。

1.7免疫組化 取OSCC組織切片和癌旁組織切片進(jìn)行常規(guī)二甲苯脫蠟，經(jīng)各級(jí)濃度乙醇水化。取一定量pH6.0檸檬酸鹽緩沖液(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)，加入微波盒中，醫(yī)用微波爐中火加熱切片3 min×2次進(jìn)行抗原修復(fù)，涼至室溫40 min。每張切片加1滴3%過氧化氫(H2O2)，室溫下孵育10 min。加1滴稀釋倍數(shù)為1∶100的第一抗體(抗CDK-10突變單克隆兔抗體，美國Cell Signaling Technology公司)，4℃冰箱過夜。而后加HPR標(biāo)記的第二抗體(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)，37℃溫箱30～40 min。每張切片加1滴新鮮配制的二氨基聯(lián)苯胺(DAB)液顯色20 min，用淡蘇木素復(fù)染細(xì)胞核30 s，各級(jí)濃度乙醇快速脫水，二甲苯透明，中性樹脂封片，晾干后觀察。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS21.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)、χ2檢驗(yàn)、Spearman相關(guān)性分析。

2 結(jié) 果

2.1miR-7-5p和CDK-10在OSCC患者中的表達(dá)量 與正常志愿者血清比較，OSCC患者血清中miR-7-5p表達(dá)量顯著下降，CDK-10表達(dá)量顯著升高(P<0.05)。見表1。CDK-10在OSCC組織中細(xì)胞陽性率〔83.8%(57/68)〕明顯高于癌旁組織〔8.8%(6/68)〕。見圖1。OSCC患者血清中miR-7-5p與CDK-10呈負(fù)相關(guān)(r=-0.682,P<0.05)。見圖2。

表1 miR-7-5p和CDK-10表達(dá)

圖1 免疫組化法檢測(cè)OSCC組織和癌旁組織中CDK-10 表達(dá)(HE染色，陽性細(xì)胞為黃褐色或褐色，×200)

圖2 OSCC患者中miR-7-5p與CDK-10呈負(fù)相關(guān)

2.2miR-7-5p調(diào)控OSCC細(xì)胞中CDK-10表達(dá)量 miR-7-5p與CDK10結(jié)合位點(diǎn)見圖3。熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)結(jié)果顯示，與空白對(duì)照組(1.02±0.08)相比，miR-7-5p與野生型CDK10 3′UTR共轉(zhuǎn)染后，檢測(cè)到熒光素酶活性顯著降低(0.35±0.13，P<0.01)。而與突變型CDK10 3′UTR共轉(zhuǎn)染后，熒光素酶活性無明顯變化(1.00±0.00 vs 0.91±0.06，P>0.05)。體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)顯示，與空白對(duì)照組比較，miR-7-5p過表達(dá)組miR-7-5p顯著升高，CDK-10顯著降低(P<0.05)。與miR-7-5p抑制組比較，miR-7-5p過表達(dá)組miR-7-5p顯著升高，CDK-10顯著降低(P<0.05)。見表2。

2.3miR-7-5p調(diào)控OSCC細(xì)胞周期 與miR-7-5p抑制組比較，miR-7-5p過表達(dá)組S期、G2M期顯著升高，G0/G1期顯著降低(P<0.05)。見表3。

2.4miR-7-5p調(diào)控OSCC細(xì)胞caspase-3、caspase-8、caspase-9、Bax、Bcl-2和CDK-10的活性水平 與miR-7-5p抑制組和空白對(duì)照組比較，miR-7-5p過表達(dá)組caspase-3、8、9及Bax水平顯著升高，Bcl-2、CDK-10顯著降低(P<0.05)。見圖4、表4。

圖3 miR-7-5p與CDK-10結(jié)合位點(diǎn)

表2 miR-7-5p調(diào)控OSCC細(xì)胞中 CDK-10表達(dá)量

表3 miR-7-5p和CDK-10調(diào)控口腔鱗癌細(xì)胞 細(xì)胞周期(%，n=3)

1～3：空白對(duì)照組、miR-7-5p抑制組、miR-7-5p過表達(dá)組圖4 Western印跡檢測(cè)各組OSCC細(xì)胞蛋白表達(dá)

表4 miR-7-5p調(diào)控OSCC細(xì)胞caspase-3、caspase-8、caspase-9、Bax、Bcl-2和CDK-10的活性水平和光密度值

2.5MTT法和LDH活性檢測(cè)miR-7-5p調(diào)控OSCC細(xì)胞 與miR-7-5p抑制組和空白對(duì)照組比較，miR-7-5p過表達(dá)組LDH水平顯著升高，MTT顯著降低，(P<0.05)。見表5。

表5 MTT法和LDH活性檢測(cè)結(jié)果

3 討 論

OSCC是一種在世界范圍內(nèi)高度流行的癌癥，轉(zhuǎn)移和放化療耐受是OSCC致死的主要原因〔8〕，研究表明，miR-7-5p異常表達(dá)可促進(jìn)腫瘤發(fā)生發(fā)展，miR-7-5p是否發(fā)生啟動(dòng)子區(qū)域甲基化改變與侵襲性腫瘤的發(fā)生和發(fā)展有關(guān)〔9〕。CDK-10在體外和體內(nèi)研究中對(duì)細(xì)胞凋亡和腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關(guān),其甲基化同淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和臨床分期相關(guān)〔10〕。本研究結(jié)果顯示，miR-7-5p與CDK-10結(jié)合發(fā)生結(jié)合,CDK-10是miR-7-5p口腔鱗癌重要的靶點(diǎn)。這與miR-7-5p在其他腫瘤中的表達(dá)趨勢(shì)具有一致性；miR-7-5p可能是OSCC患者重要的靶點(diǎn)，其機(jī)制可能與CDK-10具有相關(guān)性。

研究表明，miRNAs可以作為腫瘤篩查、診斷和預(yù)后的生物標(biāo)志物〔11〕。有研究發(fā)現(xiàn)，miR-7-5P的穩(wěn)定過表達(dá)會(huì)伴隨著DNA甲基化和組蛋白修飾。miR-7-5p甲基化的發(fā)生也與患者治療后的進(jìn)展生存期和總體生存率有關(guān)〔12〕。也有研究表明，miR-7-5p在結(jié)直腸癌的腫瘤組織和細(xì)胞中也發(fā)生高度的甲基化，miR-7-5p可能是診斷結(jié)直腸癌的標(biāo)志物〔13〕。本研究中，在OSCC患者血清中miR-7-5p表達(dá)量顯著下降，說明miR-7-5p在OSCC的發(fā)生中起到重要作用。miR-7-5p主要通過影響細(xì)胞周期并促進(jìn)干細(xì)胞分化來調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖〔14〕，一項(xiàng)研究表明，miR-7-5p通過靶向Bcl-2調(diào)節(jié)人乳頭狀癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移，miR-7通過靶向Bax和Sirt2抑制帕金森病模型中神經(jīng)元細(xì)胞的凋亡〔15〕。也有研究發(fā)現(xiàn)，miR-7-5p抑制舌鱗狀細(xì)胞的增殖，遷移和侵襲〔16〕。本研究結(jié)果表明，miR-7-5p可能通過CDK-10調(diào)控細(xì)胞周期調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖與細(xì)胞凋亡；miR-7-5p對(duì)CDK-10的調(diào)節(jié)作用，這和通過調(diào)節(jié)caspase-3及Bax/Bcl2等典型細(xì)胞凋亡因子促進(jìn)細(xì)胞凋亡具有相似的作用，miR-7-5p可能是OSCC發(fā)生的重要潛在靶點(diǎn)。

CDK-10被證明能促進(jìn)細(xì)胞增殖，具有抑癌作用〔17〕。有研究發(fā)現(xiàn)CDK-10在膽管腫瘤和細(xì)胞系中的表達(dá)均下調(diào)，CDK-10過表達(dá)或敲除分別抑制或促進(jìn)細(xì)胞增殖、集落形成和遷移〔18〕。研究證實(shí)，基因啟動(dòng)子高頻甲基化是造成惡性腫瘤中CDK-10表達(dá)下調(diào)的重要原因〔19〕，也有轉(zhuǎn)錄組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)研究中發(fā)現(xiàn)，癌細(xì)胞或表現(xiàn)出加劇分裂的細(xì)胞中CDK-10的表達(dá)上調(diào)〔20〕。本研究發(fā)現(xiàn)miR-7-5p過表達(dá)可以減少OSCC細(xì)胞增殖和增加LDH水平，抑制miR-7-5p可以增加OSCC細(xì)胞增殖和減少LDH水平，這與miR-7-5p表達(dá)與caspase-3、8、9、Bax、Bcl-2、CDK-10之間的關(guān)系的結(jié)果具有一致性，說明，CDK-10可能是調(diào)控miR-7-5p促進(jìn)OSCC細(xì)胞增殖和凋亡的重要靶點(diǎn)。

綜上，OSCC患者血清中miR-7-5p表達(dá)量顯著下降，CDK-10表達(dá)量顯著升高，CDK-10可能是miR-7-5p調(diào)控OSCC細(xì)胞增殖、凋亡與周期的重要靶點(diǎn)。miR-7-5p有希望成為OSCC預(yù)后和診斷的評(píng)定指標(biāo)。 但本研究也有一定不足，樣本量較少，實(shí)驗(yàn)方案較為簡(jiǎn)單，統(tǒng)計(jì)可能存在較大誤差，我們將在后續(xù)研究中繼續(xù)改進(jìn)和進(jìn)一步探究。