向梅 張挺

(武漢市武昌醫(yī)院 武漢科技大學(xué)附屬武昌醫(yī)院，湖北 武漢 430063)

脊髓損傷(SCI)是一種導(dǎo)致永久性殘疾的嚴(yán)重創(chuàng)傷。其病理過程分為兩個階段：原發(fā)性損傷是由脊髓組織直接破壞引起的；繼發(fā)性損傷包括軸突破壞、神經(jīng)元死亡、炎癥、血腦屏障破壞、缺氧和缺血〔1,2〕。繼發(fā)性損傷期間的這些事件導(dǎo)致神經(jīng)元死亡和功能障礙，導(dǎo)致SCI后有限的功能恢復(fù)〔3〕。因此，目前對于中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)損傷的治療主要側(cè)重于通過減少神經(jīng)元死亡和修復(fù)功能性神經(jīng)進而預(yù)防或減少繼發(fā)性SCI〔4，5〕。

橄欖苦苷(OE) 屬于環(huán)烯醚類葡萄糖苷，廣泛存在于木犀科植物中，在油橄欖葉中含量尤為豐富，具有器官保護、降血脂、降血壓、降血糖、解毒、抗氧化、抗炎及抗腫瘤等多種藥理作用〔6～9〕。近年來OE對神經(jīng)損傷的保護作用逐漸引起了人們的關(guān)注。研究說明OE在人膠質(zhì)母細胞瘤細胞中具有有效的抗氧化特性，可以對神經(jīng)元發(fā)揮其保護作用〔10〕；另外其對大鼠神經(jīng)元損傷具有保護作用，該作用與抑制炎性反應(yīng)有關(guān)〔11〕。本研究旨在闡明OE是否可通過抑制免疫炎癥反應(yīng)進而發(fā)揮對SCI大鼠神經(jīng)元的保護作用。

1 材料與方法

1.1實驗動物及材料 OE購自隴南田園油橄欖科技開發(fā)有限公司(純度>98%)，成年雌性SD大鼠購自上海SLAC實驗動物有限公司(中國，220～250 g，n=45)隨機分為3組，假手術(shù)(Sham)組、SCI組和SCI+OE組，水合氯醛(3.5 ml/kg)腹腔麻醉，SCI組和SCI+OE組行T9椎板切除術(shù)，用血管夾(Oscar，中國)造成中度擠壓傷，30 g力作用1 min，Sham組僅行T9椎板切除術(shù)。術(shù)后護理包括每日兩次膀胱排空和腹腔注射頭孢唑啉鈉(50 mg/kg)。術(shù)后SCI+OE組每天灌胃給予OE(50 mg/kg)〔12〕。Sham組和SCI組給予等量生理鹽水。

1.2行為分析 對各組大鼠術(shù)后7、14、21和28 d進行脊髓損傷(BBB)評分、斜面測試實驗及足跡試驗，并對收集到的足跡進行分析和評估。

1.3組織學(xué)染色 在SCI后第28天，大鼠麻醉并經(jīng)心臟灌注0.9%氯化鈉，然后用4%多聚甲醛(PFA)固定。收集包含病變部位的T7～T9脊髓段，在4%PFA中固定48 h，然后石蠟包埋進行石蠟切片。取厚5 μm的橫切面按廠家說明書對進行蘇木素-伊紅(HE)染色和尼氏(Nissl)染色。圖像均采用光學(xué)顯微鏡(日本東京奧林巴斯)獲得。HE染色后切片病理評分標(biāo)準(zhǔn):0分=無損壞;1分=灰質(zhì)中有1～5個嗜酸性神經(jīng)元;2分=灰質(zhì)中有6～10個嗜酸性神經(jīng)元;3分=灰質(zhì)中有10個以上嗜酸性神經(jīng)元;4分=腦灰質(zhì)梗死面積占1/3以內(nèi);5分=腦灰質(zhì)梗死面積占1/3～1/2；6分=腦灰質(zhì)梗死面積占1/2以上。Nissl染色計數(shù)每次觀察3個視野。

1.4免疫熒光染色 傷后3 d取脊髓組織標(biāo)本，收集包含病變部位的T7～T9脊髓段。所有脊髓用4%PFA固定，沖洗，石蠟包埋。切割厚度為5 μm的橫切面，在二甲苯中脫蠟，并用乙醇洗滌重新水化。切片在室溫下與10%正常山羊血清在含0.1%tritonx-100的磷酸鹽緩沖液(PBS)中孵育1 h。然后將它們與適當(dāng)?shù)囊患壙贵w在同一緩沖液中于4℃孵育過夜。一級抗體孵育后，將切片洗滌4×10 min，然后在室溫下與Alexa Fluor 488/594山羊抗兔/鼠二級抗體孵育1 h。切片用PBS沖洗3次，并與4,6-二氨基-2-苯基吲哚(DAPI)孵育10 min，最后在PBS中洗滌并用蓋玻片密封。熒光顯微鏡(日本東京奧林巴斯公司)對圖像進行拍攝，對每只動物病變部位30～40個隨機切片的進行計數(shù)。每組重復(fù)3次。

1.5Western印跡 傷后3 d，使用含有1 mmol/L PMSF的RIPA裂解緩沖液(Beyotime，中國上海)從脊髓提取總蛋白(收集包含病變部位的T7～T9脊髓段)，然后使用增強的BCA蛋白分析試劑盒(Beyotime，中國上海)使用微孔板讀取器(分子器件Flexstation 3，美國)測量蛋白濃度。通過十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離40 ng組織蛋白并轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜(Bio-Rad，California，USA)。用5%脫脂乳封閉2 h后，用抗酶切的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(Cleaved-caspase)-3(1∶500)、腫瘤壞死因子(TNF)-α(1∶200)、白細胞介素(IL)-1β(1∶500)、甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)(1∶5 000)孵育細胞膜。然后，用3次TBS洗滌膜5 min，并用辣根過氧化物酶結(jié)合的二級抗體處理。用TBST洗滌3次后，用電化學(xué)發(fā)光加試劑(Invitrogen，Carlsbad，USA)觀察印跡。每組重復(fù)3次。

1.6統(tǒng)計學(xué)方法 使用SPSS22.0軟件進行t檢驗、單因素方差分析、SNK-q檢驗。

2 結(jié) 果

2.1OE可促進SCI后的運動功能恢復(fù) SCI組和SCI+OE組0、7、14、21、28 d BBB評分、斜面試驗顯著低于Sham組(P<0.05)。SCI+OE組14、21、28 d BBB評分、斜面試驗顯著高于SCI組(P<0.05)。見表1、2。與Sham組清晰足跡相比，SCI組后肢出現(xiàn)明顯的拖拽(紅色足跡)，而SCI+OE組顯示出相當(dāng)一致的后肢軌跡，幾乎沒有絆倒(圖1)，其運動功能得到了明顯的改善。

表1 各組不同時間BBB評分比較分)

表2 各組不同時間斜面試驗比較

圖1 各組運動功能

2.2OE可明顯改善SCI引起的形態(tài)學(xué)改變 HE染色顯示，SCI組神經(jīng)元腫脹較對照相比明顯加重；而SCI+OE組與SCI組相比其神經(jīng)元腫脹程度明顯減輕。Nissl染色顯示，SCI組Nissl小體在胞質(zhì)內(nèi)聚集，與Sham組相比染色較深，而SCI+OE組染色明顯較SCI組變淺。BBB評分及Nissl染色計數(shù)均顯示SCI+OE組較SCI組脊髓損傷引起的形態(tài)學(xué)改變得到明顯改善(P<0.01)。見圖2、表3。

圖2 OE可改善SCI引起的形態(tài)學(xué)改變

表3 BBB評分及Nissl染色細胞數(shù)

2.3OE可降低SCI引起的神經(jīng)元炎癥反應(yīng) 與Sham組比較，星形膠質(zhì)細胞激活的標(biāo)志物膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)及小膠質(zhì)細胞激活的標(biāo)志物(Iba1)在SCI組中呈現(xiàn)明顯高表達(P<0.001)；而SCI+OE組與SCI組相比以上兩種標(biāo)志物均明顯減少(P<0.01)。見圖3、表4。

圖3 3組脊髓切片免疫熒光染色(×200)

表4 3組脊髓中GFAP及Iba1表達水平

2.4OE可通過抑制免疫炎癥反應(yīng)進而減輕神經(jīng)元細胞過度凋亡 SCI組與Sham組相比，Cleaved-caspase-3、TNF-α、IL-1β(P<0.05)明顯增加。SCI+OE組與SCI組相比，Cleaved-caspase-3、TNF-α及IL-1β明顯下降(P<0.01)。見圖4、圖5、表5。

圖4 OE可通過抑制免疫炎癥反應(yīng)進而減輕神經(jīng)元細胞過度凋亡(免疫熒光染色，×200)

圖5 各組Cleaved-caspase-3、TNF-α、IL-1β蛋白表達

表5 3組神經(jīng)元細胞中Cleaved-caspase-3、 TNF-α及IL-1β蛋白表達

3 討 論

SCI是一種嚴(yán)重的中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病，據(jù)統(tǒng)計美國每年有 8 000～11 000例新發(fā)SCI患者〔13〕，其發(fā)病與炎癥反應(yīng)息息相關(guān)。

OE一種無毒的多酚類裂環(huán)烯醚萜苷類化合物〔14，15〕，其具有多種藥理作用，已被廣泛應(yīng)用于臨床各類疾病的治療及預(yù)防中。在神經(jīng)保護方面，其作用同樣較為顯著，Pantano等〔16〕的研究說明在 小鼠中添加OE和多酚類化合物可顯著改善高脂血癥小鼠的認知功能，表明OE對行為表現(xiàn)和神經(jīng)病理學(xué)有一定的影響，可以產(chǎn)生類神經(jīng)保護作用。另外OE具有不同程度的抗炎活性。一項動物實驗研究表明OE可以通過抑制Toll樣受體(TLR)和絲裂原激活蛋白激酶(MAPK)信號傳導(dǎo)來減少炎癥反應(yīng)，并且可以用作抗炎藥進行臨床應(yīng)用〔17〕；Horcajada等〔18〕的研究證明OE可明顯減慢豚鼠自發(fā)性骨關(guān)節(jié)炎病變的進程，減少其免疫炎癥反應(yīng)，對骨關(guān)節(jié)具有重要的保護作用。

據(jù)報道，運動功能學(xué)測定在SCI的評估中具有明確的有效性和可靠性〔19〕。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)OE可在一定程度上促進SCI大鼠運動功能的恢復(fù)；OE可改善大鼠神經(jīng)元腫脹程度。

有研究表明膠質(zhì)細胞的狀態(tài)對SCI后運動功能的評估具有重要的意義和價值，其過度激活表明炎癥反應(yīng)的增強〔20〕。本研究結(jié)果說明SCI可引起神經(jīng)元炎癥反應(yīng)，OE可改善SCI引起的神經(jīng)元炎癥過度激活狀態(tài)；SCI可致神經(jīng)元細胞凋亡增加，而OE可降低該凋亡現(xiàn)象，因此認為OE可通過抑制免疫炎癥反應(yīng)進而減輕神經(jīng)元細胞過度凋亡，從而發(fā)揮其對SCI的保護作用，但其具體作用機制仍需進一步研究加以證實。