馬逸群 邵麗詩 張婭 夏春娟 時(shí)琛 王家平 宋超 王世平 萬珊杉

(1漢中市三二○一醫(yī)院影像科，陜西 漢中 723000；2昆明醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院影像科；3云南昆鋼醫(yī)院放射科)

心臟和腎臟疾病可通過不同的機(jī)制相互影響，在病理狀態(tài)下其中一個(gè)臟器的損傷會導(dǎo)致另一個(gè)臟器的急性或慢性損傷，即心腎綜合征(CRS)〔1,2〕。Bagshaw等〔3〕將之分為5種亞型，其中Ⅳ型(慢性CRS)是指在長期慢性腎臟疾病的基礎(chǔ)上出現(xiàn)的慢性心臟損傷。CRS在全球的發(fā)病率日益提高，目前臨床針對CRS主要的治療方式為藥物保守治療，尚缺乏特異的治療方法〔4〕。隨著再生醫(yī)學(xué)的發(fā)展，干細(xì)胞研究對慢性腎臟病(CKD)的治療提供了新的思路，已有的研究表明骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)可對慢性腎臟病起到有效的治療效果，同時(shí)對CRS起到較好的改善效果〔5〕。實(shí)驗(yàn)表明經(jīng)腎動脈移植干細(xì)胞的歸巢效果優(yōu)于外周靜脈，本實(shí)驗(yàn)采用經(jīng)腎動脈移植BMSCs與雷米普利灌胃對CRS大鼠的治療效果比較，探索CRS更為有效的治療方法。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動物、試劑及儀器 雄性清潔級SD大鼠42只，由昆明醫(yī)科大學(xué)提供。培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)、磷酸鹽緩沖液(PBS)、青鏈霉素、胰蛋白酶-0.25%乙二胺四乙酸(EDTA，美國Gibco公司)；雷米普利(北京賽諾菲制藥有限公司)；離心管、細(xì)胞培養(yǎng)瓶(無錫NEST公司)；彩色多普勒超聲診斷儀(美國GE公司)；CKX41倒置相差顯微鏡(日本Olympus 公司)；透射電子顯微鏡(日本Hitachi公司)；CO2培養(yǎng)箱(美國Thermo公司)。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1BMSCs的培養(yǎng) 選擇2只6周齡雄性SD大鼠〔體重(120±10)g〕提取BMSCs。脫頸處死，于75%乙醇中浸泡10 min，取雙側(cè)股骨置于含有PBS的培養(yǎng)皿中并剪斷干骺端，用DMEM培養(yǎng)基反復(fù)沖洗骨髓腔至沖洗液變透亮；收集大鼠的細(xì)胞懸液于15 ml離心管中，1 000 r/min離心8 min，棄上清液，用PBS吹打重懸后再以1 000 r/min離心8 min后棄上清液，以10%FBS與1%青鏈霉素的完全培養(yǎng)液重懸細(xì)胞；將細(xì)胞懸液接種在塑料培養(yǎng)瓶中并置于37℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中孵育。24 h后首次換液，此后每3 d換液1次。1 w后于倒置顯微鏡下觀察BMSCs生長融合至80%～90%時(shí)按照1∶3傳代。取P4-P6 BMSCs備用。

1.2.2模型的制作與分組 將32只10周齡大鼠〔體重(200±15)g〕建立慢性腎臟病模型。用10%水合氯醛(3 ml/kg)腹腔注射麻醉，按照文獻(xiàn)所述方法〔6〕建立左側(cè)輸尿管梗阻慢性腎臟病模型，此后第8周收集尾靜脈血及尿液檢測腎功能，以血肌酐、血尿素氮、尿白蛋白升高表示慢性腎臟病模型構(gòu)建成功。然后隨機(jī)分為雷米普利治療組(A組)，BMSCs移植組(B組)，雷米普利與BMSCs聯(lián)合治療組(C組)，Ⅳ型CRS對照組(CRS組)各8只；剩余8只健康鼠為生理鹽水對照組(N組)。

1.2.3各組的治療方法 制備雷米普利溶液，A組8只大鼠按照5.0 mg/(kg·d)劑量灌胃。取傳代至P4-P6、生長至80%～90%融合的BMSCs，用L-DMEM培養(yǎng)基將BMSCs制成細(xì)胞懸液后(3×106/ml)分別收集于16支1.5 ml EP管中,每支0.5 ml，于-4℃保存。B組大鼠麻醉后仰臥位固定，備皮、消毒后，用超聲探頭沿腹主動脈找到左腎動脈分叉處，在超聲引導(dǎo)下以胰島素針吸取配好的BMSCs分別經(jīng)皮穿刺至左腎動脈分叉處，確定無外漏后注射BMSCs 0.5 ml，術(shù)后將大鼠送回飼養(yǎng)籠中單只飼養(yǎng)；C組在雷米普利灌胃后立即采用上述方法給與腎動脈移植BMSCs；CRS組和N組在每次操作的同時(shí)采用等量的生理鹽水灌胃。

1.2.4生化指標(biāo)的收集與檢測 各組在治療后第1周末將大鼠置于單只代謝籠內(nèi)，收集24 h尿液并行尾靜脈采血，用全自動生化儀檢測血尿素氮(BUN)、血肌酐(Scr)與24 h尿蛋白。

1.2.5心臟與腎臟的病理檢測 脫頸處死大鼠后取心臟和腎臟，用10%的甲醛固定后石蠟包埋，行HE染色和Masson染色，觀察心臟及腎臟組織的病理結(jié)構(gòu)改變。每組Masson染色結(jié)果隨機(jī)選擇10個(gè)視野，采用Image Pro6.0計(jì)算心肌組織中膠原容積分?jǐn)?shù)(CVF)。

1.2.6心、腎細(xì)胞TUNNEL檢測 用石蠟包埋的各組大鼠心、腎組織并切片，按照試劑盒說明嚴(yán)格操作進(jìn)行細(xì)胞凋亡檢測，凋亡細(xì)胞核呈棕黃色，記為陽性。

1.2.7透射電鏡檢測 取新鮮腎臟與心臟組織，體積約為1 mm×1 mm×1 mm，迅速放入TEM固定液中常溫固定2 h，0.1 mmol/L PBS漂洗3次，每次15 min，再以1%鋨酸·0.1 mol/L磷酸緩沖液室溫固定2 h，使用丙酮梯度脫水后用滲透過夜并包埋，將樣本插入包埋板并置于37℃烤箱過夜，再以60℃烤箱聚合48 h，采用切片機(jī)將樣本切為60～80 nm切片，并用鈾鉛雙染色，室溫過夜后置于TEM下觀察。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS18.0軟件進(jìn)行方差分析、LSD-t法、秩和檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1一般狀況 各組大鼠在注射ADR后1 w左右均出現(xiàn)不同程度的腹瀉伴食欲下降，第5周開始逐漸出現(xiàn)不同程度的腹水及水腫表現(xiàn)。建模過程中B組1只大鼠死亡、C組2只大鼠死亡，剔除后重新建模并補(bǔ)充實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

2.2超聲引導(dǎo)下移植BMSCs 于超聲引導(dǎo)下沿大鼠腹主動脈下行，找到左側(cè)腎動脈分叉處，用胰島素針吸取BMSCs，在超聲引導(dǎo)下經(jīng)皮穿刺，針頭至左腎動脈分叉處注射BMSCs。見圖1。

2.3血、尿生化檢測結(jié)果 A、B、C、CRS組經(jīng)治療后腎功能均有所改善，在治療后第1周末B組與C組BUN、Scr、24 h尿白蛋白總量均明顯低于CRS組(P<0.05)，其中C組各檢測指標(biāo)相對A組下降更為明顯(P<0.01)，而相對于B組雖有下降但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

圖1 超聲引導(dǎo)下穿刺結(jié)果(箭頭所示為針頭位置)

表1 各組治療后第1周末血、尿生化指標(biāo)結(jié)果

2.4腎臟與心臟的病理檢查結(jié)果 N組腎固有細(xì)胞、腎間質(zhì)未見明顯異常；心肌細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)完整。CRS組可見腎小球硬化，腎小管上皮細(xì)胞空泡變，系膜細(xì)胞和基質(zhì)增生，腎小球毛細(xì)血管袢閉塞，間質(zhì)內(nèi)可見大量炎細(xì)胞浸潤；心肌細(xì)胞可見大量心肌細(xì)胞水腫壞死，基質(zhì)內(nèi)見可見大量炎細(xì)胞浸潤。A組腎小球可見局灶節(jié)段性硬化，個(gè)別腎小球粘連，部分腎小管上皮細(xì)胞再生，間質(zhì)內(nèi)炎細(xì)胞浸潤較CRS組有所減少；心肌細(xì)胞排列正常，少數(shù)細(xì)胞腫脹，間質(zhì)內(nèi)炎細(xì)胞浸潤較CRS組明顯減少。B組可見腎小球硬化，腎小管蛋白管型；心肌心態(tài)基本正常，心肌間質(zhì)水腫較輕、炎細(xì)胞較少。C組可見部分腎小球毛細(xì)血管襻擴(kuò)張，腎小管萎縮不明顯，部分?jǐn)U張的腎小管內(nèi)可見蛋白管型，間質(zhì)內(nèi)炎細(xì)胞較少，呈小灶狀浸潤；心肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整、個(gè)別出現(xiàn)腫脹，基質(zhì)水腫較輕、其內(nèi)炎細(xì)胞浸潤較少。與N組比較，A、B、C、CRS組CVF顯著升高(P<0.05)；與C組比較，A、B、CRS組CVF顯著升高(P<0.05)。見表2、圖2。

2.5心臟、腎臟組織的透射電鏡檢查結(jié)果 N組細(xì)胞核形態(tài)規(guī)則，大部分線粒體形態(tài)良好，嵴清晰；CRS組細(xì)胞核形態(tài)欠規(guī)則，線粒體變形、溶解；A組相對于CRS組細(xì)胞核形態(tài)較規(guī)則，線粒體腫脹但溶解較少；B組細(xì)胞核較規(guī)則，線粒體腫脹明顯，可見溶解的線粒體；C組細(xì)胞核規(guī)則，線粒體腫脹程度明顯降低，溶解的線粒體較少，嵴可見。N組顯示心肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整，細(xì)胞核形態(tài)規(guī)則，呈圓形，核仁清，染色質(zhì)分布較為均勻，肌節(jié)形態(tài)整齊、邊界較清，線粒體形態(tài)正常，呈長橢圓形，無自噬小泡；CRS組肌節(jié)排列紊亂，較多肌節(jié)斷裂溶解，間質(zhì)纖維化并有大量炎細(xì)胞浸潤，細(xì)胞核形態(tài)不規(guī)則、部分細(xì)胞核破裂，核內(nèi)染色質(zhì)呈塊狀聚集，大量線粒體腫脹或溶解、嵴斷裂、空泡化嚴(yán)重，有明顯的自噬小泡形成；A組心肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)稍腫脹、形態(tài)結(jié)構(gòu)基本完整，基質(zhì)中可見少量炎細(xì)胞浸潤，部分線粒體膜損傷且有較多自噬小泡形成；B組心肌細(xì)胞線粒體腫脹、形態(tài)結(jié)構(gòu)基本完整，肌節(jié)間隙較大，基質(zhì)中少量炎細(xì)胞浸潤線粒體損傷較輕，自噬小泡數(shù)量降低；C組心肌細(xì)胞形態(tài)完整、稍腫脹，細(xì)胞核形態(tài)呈圓形，核仁較清晰，染色質(zhì)呈團(tuán)塊狀分布，線粒體形態(tài)稍腫脹，自噬小泡數(shù)量較少。見圖3。

表2 各組心臟及腎臟病理、 心肌CVF及心肌TUNNEL結(jié)果

圖2 各組心臟及腎臟病理結(jié)果及心肌CVF

2.6心臟與腎臟的細(xì)胞凋亡檢查結(jié)果 TUNNEL結(jié)果表明，N組腎組織切片可見腎小球腎小管結(jié)構(gòu)完整，幾乎未見凋亡細(xì)胞；與N組相比，A、B、C組凋亡細(xì)胞明顯增多，其中A組最多，C組相對較少，B組凋亡細(xì)胞數(shù)量介于二者之間，且腎組織的凋亡細(xì)胞主要分布在腎小管區(qū)域。見表2、圖4。

圖4 各組心肌TUNEL結(jié)果(×200)

3 討 論

CRS包括心臟和腎臟的多種疾病，指一個(gè)器官的功能障礙導(dǎo)致另一器官的急性或慢性功能障礙〔7〕。CRS的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，包括交感神經(jīng)過度興奮、腎素-血管緊張素-醛固醇系統(tǒng)(RAAS)過度激活、氧化應(yīng)激、炎性反應(yīng)、血流動力學(xué)異常等。Ⅳ型CRS又稱慢性心腎綜合征，其主要特征是由CKD導(dǎo)致心臟的慢性功能不全。隨著CKD的進(jìn)展，高血壓、肺水腫等反應(yīng)可引起心臟負(fù)荷增加，同時(shí)電解質(zhì)紊亂、交感神經(jīng)興奮、缺血缺氧等進(jìn)一步加重心肌損傷并最終導(dǎo)致心功能下降〔8〕。目前臨床針對CRS常用的治療方式是利尿、透析、血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑/血管緊張素受體拮抗劑(ACEI/ARB)等，雷米普利是常用的ACEI類藥物，可有效抑制RAAS的激活，同時(shí)增加緩激肽的水平，舒張血管、調(diào)節(jié)血壓，對CKD誘導(dǎo)的心室肥大和心肌纖維化具有較好的修復(fù)作用。已有的研究證明5.0 mg/(kg·d)劑量的雷米普利灌胃對大鼠心臟疾病的治療效果較佳〔9〕，本實(shí)驗(yàn)采用5.0 mg/(kg·d)為治療劑量。隨著再生醫(yī)學(xué)的發(fā)展，干細(xì)胞逐漸被應(yīng)用于細(xì)胞生物學(xué)工程。BMSCs作為干細(xì)胞家族的主要成員，以其易分離性、多能性和無倫理爭議的特點(diǎn)已被應(yīng)用于組織修復(fù)和再生領(lǐng)域〔10〕?，F(xiàn)已證明BMSCs可抑制損傷組織中的炎癥反應(yīng)，同時(shí)在多種趨化因子的綜合作用下向靶器官和靶組織遷移，并定向分化為相應(yīng)組織細(xì)胞，參與受損器官或組織的修復(fù)過程〔11,12〕。實(shí)驗(yàn)證明，BMSCs對靶器官的修復(fù)作用主要表現(xiàn)在移植早期，且移植后第1周末與第2周末的修復(fù)作用無顯著差異〔13,14〕，故本實(shí)驗(yàn)的檢測點(diǎn)選擇在BMSCs移植后第1周末。

以往研究表明〔15〕經(jīng)腎動脈移植BMSCs的歸巢效果優(yōu)于外周靜脈與腎包膜下直接注射，對CKD的治療效果更佳，故本實(shí)驗(yàn)采用經(jīng)腎動途徑移植BMSCs。BUN和Scr是衡量CRS嚴(yán)重程度的靈敏指標(biāo)，腎臟受損患者常在早期出現(xiàn)BUN、Scr可顯著升高，經(jīng)有效的治療后隨著腎功能的恢復(fù)，二者又可下降。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果推測BMSCs在治療早期可通過歸巢分化及旁分泌等多種機(jī)制對CKD大鼠腎臟電荷屏障起到較好的修復(fù)作用。

本研究結(jié)果證實(shí)了BMSCs對CRS的修復(fù)作用不僅表現(xiàn)在對心肌本身的修復(fù)，同時(shí)也體現(xiàn)在對腎臟的修復(fù)。Chen等〔16〕證明了間充質(zhì)干細(xì)胞可改善受損的腎臟腎小球肥大，腎小管上皮細(xì)胞空泡化等改變，同時(shí)減輕腎小球內(nèi)細(xì)胞外基質(zhì)沉積，減輕腎小球與腎小管間質(zhì)纖維化并降低受損腎臟腎固有細(xì)胞的凋亡率。已有的研究證明間充質(zhì)干細(xì)胞主要通過兩種機(jī)制起到抗凋亡的作用，分別為：①間充質(zhì)干細(xì)胞分泌各種生長因子，例如胰島素樣生長因子(IGF)-1、血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子(VEGF)和肝細(xì)胞生長因子(HGF)等〔17～19〕；②間充質(zhì)干細(xì)胞及其分泌的外泌體增加了抗凋亡基因的表達(dá)并促進(jìn)mRNA轉(zhuǎn)移到受損細(xì)胞中〔20,21〕。受損的線粒體可通過激活細(xì)胞的自噬過程對心肌造成損傷〔22〕，本研究結(jié)果證明，BMSCs可通過抑制凋亡從而對CRS進(jìn)程中的心臟與腎臟起到較好的修復(fù)作用。同樣證實(shí)了雷米普利對CRS的治療效果主要通過改善心肌重塑實(shí)現(xiàn)，而BMSCs對CRS患者心肌重塑和抑制細(xì)胞凋亡與自噬均有作用。