周密 楊麗 陳海濱 宋俊華 楊水生

(1長沙市第四醫(yī)院內(nèi)分泌科，湖南 長沙 410000；2湖南省人民醫(yī)院)

糖尿病作為一種臨床較為常見的慢性疾病，其發(fā)生發(fā)展會誘發(fā)一系列的并發(fā)癥，嚴(yán)重威脅患者身體健康〔1〕。糖尿病腎病是較為常見的糖尿病并發(fā)癥〔2，3〕，老年人群為糖尿病腎病主要發(fā)病群體，近年來，我國每年新增糖尿病腎病病例數(shù)連年上升〔4，5〕。糖尿病腎病臨床治療難度較高，有些患者可能會進(jìn)一步發(fā)展為終末期腎臟病，對患者生命安全造成威脅〔6，7〕。目前臨床醫(yī)學(xué)尚無特效的治療糖尿病腎病的手段，許多專家學(xué)者開始致力于糖尿病腎病新的治療靶點(diǎn)的研究〔8～10〕。本研究建立糖尿病腎病大鼠模型，靶向調(diào)控微小RNA-194-1(miR-194-1)表達(dá)，觀察效果。

1 材料與方法

1.1材料 選取40只SD健康雄性大鼠，由華蘭生物工程股份有限公司提供，8～10月齡，平均(9.0±0.8)月齡；體重218～243 g，平均體重(232.5±6.7)g。在相對濕度50%～55%、溫度(22.7±2.1)℃的環(huán)境中喂養(yǎng)1 w，光照12 h/d。主要試劑：大鼠抗小鼠miR-194-1抗體(Gibco公司)；小鼠抗大鼠血肌酐(SCr)、尿素氮(BUN)抗體(Dako公司)；大鼠抗小鼠過氧化氫酶(CAT)、終末氧化蛋白產(chǎn)物(AOPP)抗體(Selleck公司)；兔抗小鼠白細(xì)胞介素(IL)-6、IL-1β抗體(Sigma公司)；小鼠抗兔磷酸化雷帕霉素靶蛋白(p-mTOR)抗體(Invitrogen公司)；小鼠抗兔磷酸化核糖體40S小亞基S6蛋白激酶(p-S6K1)抗體(Hyclone公司)。

1.2方法

1.2.1建模及分組 隨機(jī)選取10只大鼠為正常組，不做處理。其余30只建立糖尿病腎病模型：隔夜禁食16 h，對30只建模大鼠一次性腹腔注射60 mg/kg STZ。5 d后檢測大鼠血糖，血糖>16.7 mmol/L、尿糖、尿蛋白陽性視為糖尿病腎病模型建立成功。共建模成功27只，將27只糖尿病腎病模型大鼠隨機(jī)分為模型組、上調(diào)miR-194-1組、下調(diào)miR-194-1組各9只。下調(diào)miR-194-1組大鼠尾部靜脈注射30 mg/kg antagomiR-194-1，上調(diào)miR-194-1組大鼠尾部靜脈注射30 mg/kg agomiR-194-1，正常組、模型組大鼠尾部靜脈注射等量生理鹽水。

1.2.2空腹血糖(FBG)、糖化血紅蛋白(HbA1c)、總膽固醇(TC)、三酰甘油(TG)水平檢測 取各組大鼠腹部靜脈血3 ml，2 000 r/min離心處理15 min后分離上清液，在-80℃環(huán)境中保存待檢。血糖檢測儀檢測FBG、HbA1c水平。CHOD-PAP法檢測TC水平，GPO-PAP法檢測TG水平，檢測過程按照TC單試劑測定試劑盒、TG檢測試劑盒操作說明書進(jìn)行。

1.2.3miR-194-1表達(dá)檢測 RT-PCR檢測miR-194-1表達(dá)。Trizol法提取細(xì)胞總RNA，檢測RNA純度、含量，逆轉(zhuǎn)錄處理后獲得cDNA，采用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)引物序列，2-ΔΔCt方法計(jì)算miR-194-1表達(dá)，內(nèi)參U6。

1.2.4腎重指數(shù)檢測、腎組織蘇木素-伊紅(HE)染色 稱量、記錄各組大鼠體重，麻醉后頸椎脫臼法處死，取腎組織稱重，對腎重指數(shù)進(jìn)行計(jì)算。將大鼠腎組織固定在4%甲醛中，完全浸泡，1 d后常規(guī)石蠟包埋、切片。切片脫蠟、脫水處理后梯度酒精復(fù)水3 min，蘇木素染色，清洗后分化、酒精脫水，伊紅染色后再次梯度酒精脫水，封片后顯微鏡觀察。

1.2.5酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測SCr、BUN、IL-6、IL-1β、CAT、AOPP水平 設(shè)定1空白孔、10標(biāo)準(zhǔn)孔，標(biāo)本稀釋后封板，37℃培養(yǎng)箱靜置0.5 h后充分洗板，拍干后個孔添加50 μl酶標(biāo)液(空白孔除外)，封膜孵育0.5 h后洗板，拍干后各孔添加50 μl顯色A液、B液并搖晃均勻，室內(nèi)遮光靜置20 min，添加50 μl終止液，450 nm波長測吸光度，檢測SCr、BUN、IL-6、IL-1β、CAT、AOPP水平。

1.2.6Western印跡檢測p-mTOR、p-S6K1相對表達(dá)量 提取50 μg蛋白煮沸變性，十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)后轉(zhuǎn)膜、封閉(室內(nèi)1.5 h)，添加一抗(1∶2 000)后孵育1 d，次日Western液充分清洗后添加二抗(1∶5 000)進(jìn)行孵育，1 h后再次使用Western液清洗，顯色、曝光、成像后檢測條帶灰度值，檢測p-mTOR、p-S6K1相對表達(dá)量。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS21.0軟件行F檢驗(yàn)、獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1各組腎組織病理圖HE染色 如圖1所示，正常組腎組織細(xì)胞大小平均，形態(tài)規(guī)則；模型組、上調(diào)miR-194-1組腎組織細(xì)胞大小、形態(tài)均不規(guī)則，腎小球結(jié)構(gòu)受損，且細(xì)胞排列較為雜亂；下調(diào)miR-194-1組腎組織細(xì)胞結(jié)構(gòu)較為完整，細(xì)胞大小、形態(tài)較規(guī)則，細(xì)胞排列較為整齊。

圖1 各組腎組織病理HE染色(×400)

2.2各組miR-194-1表達(dá)比較 如表1所示，與正常組比較，其他3組miR-194-1表達(dá)較高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與模型組、上調(diào)miR-194-1組比較，下調(diào)miR-194-1組miR-194-1表達(dá)較低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.3各組FBG、HbA1c、TC、TG水平比較 如表1所示，與正常組比較，其他3組FBG、HbA1c、TC、TG水平較高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與模型組、上調(diào)miR-194-1組比較，下調(diào)miR-194-1組FBG、HbA1c、TC、TG水平較低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.4各組腎重指數(shù)、SCr、BUN水平比較 如表2所示，與正常組比較，其他3組腎重指數(shù)、SCr、BUN水平較高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與模型組、上調(diào)miR-194-1組比較，下調(diào)miR-194-1組腎重指數(shù)、SCr、BUN水平較低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表1 各組miR-194-1表達(dá)及FBG、HbA1c、TC、TG水平比較

表2 各組腎重指數(shù)、SCr、BUN水平比較

2.5各組IL-6、IL-1β、CAT、AOPP水平比較 如表3所示，與正常組比較，其他3組IL-6、IL-1β、AOPP水平較高，CAT水平較低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與模型組、上調(diào)miR-194-1組比較，下調(diào)miR-194-1組IL-6、IL-1β、AOPP水平較低，CAT水平較高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表3 各組IL-6、IL-1β、CAT、AOPP水平及p-mTOR、p-S6K1相對表達(dá)量比較

2.6各組p-mTOR、p-S6K1相對表達(dá)量比較 如表3、圖2所示，與正常組比較，其他3組p-mTOR、p-S6K1相對表達(dá)量較高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與模型組、上調(diào)miR-194-1組比較，下調(diào)miR-194-1組p-mTOR、p-S6K1相對表達(dá)量較低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

1～4：正常組、模型組、上調(diào)miR-194-1組、下調(diào)miR-194-1組圖2 各組p-mTOR、p-S6K1表達(dá)

3 討 論

微小RNA(miRNA)在大多數(shù)生物中大量存在，miR-194-1為miRNA家族的重要組成部分，在糖尿病腎病中呈現(xiàn)異常高表達(dá)〔11～13〕。糖尿病腎病發(fā)生主要原因?yàn)闄C(jī)體異常、持續(xù)的高血糖狀態(tài)，并且其不斷發(fā)展還會導(dǎo)致機(jī)體血脂水平異?！?4,15〕。本文研究結(jié)果說明，糖尿病腎病的發(fā)生發(fā)展伴隨著血糖、血脂水平異常，下調(diào)miR-194-1表達(dá)能夠有效抑制糖尿病腎病模型大鼠血糖、血脂水平，從而發(fā)揮干預(yù)效果。糖尿病腎病的發(fā)生發(fā)展會對機(jī)體腎功能造成嚴(yán)重的威脅〔16,17〕。SCr、BUN是臨床常用的評價機(jī)體腎功能損傷狀況的指標(biāo)。彭靜〔18〕通過動物實(shí)驗(yàn)表示，糖尿病腎病的發(fā)生發(fā)展會使動物模型腎重指數(shù)明顯上升，造成較為嚴(yán)重的腎臟損傷。本文研究結(jié)果說明，糖尿病腎病的發(fā)生發(fā)展導(dǎo)致腎重指數(shù)上升及機(jī)體腎功能損傷，下調(diào)miR-194-1表達(dá)能夠改善大鼠腎重指數(shù)，使糖尿病腎病大鼠腎功能得到有效提升。

糖尿病腎病的發(fā)生發(fā)展伴隨著機(jī)體腎臟組織炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激反應(yīng)〔19,20〕。IL-6、IL-1β是常用的評價機(jī)體炎癥反應(yīng)的指標(biāo)，二者水平變化與機(jī)體炎癥反應(yīng)密切相關(guān)。CAT是機(jī)體防御系統(tǒng)匯總的重要酶類清除劑，能夠清除過氧化氫，減輕細(xì)胞損傷。AOPP是常用的體現(xiàn)機(jī)體氧化應(yīng)激反應(yīng)嚴(yán)重程度的產(chǎn)物。本文研究結(jié)果說明，下調(diào)miR-194-1表達(dá)能夠有效減輕糖尿病腎病大鼠腎臟組織炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激損傷嚴(yán)重程度，從而起到腎臟保護(hù)作用。

有研究表示，mTOR/S6K1信號通路在糖尿病腎病發(fā)生發(fā)展過程中起到重要作用〔21〕。mTOR/S6K1通路蛋白表達(dá)變化與機(jī)體腎組織細(xì)胞損傷、自噬具有密切聯(lián)系，本文研究結(jié)果顯示，糖尿病腎病模型大鼠p-mTOR、p-S6K1表達(dá)較高，下調(diào)miR-194-1表達(dá)的糖尿病腎病大鼠p-mTOR、p-S6K1表達(dá)下調(diào)，可能是因?yàn)橄抡{(diào)miR-194-1表達(dá)能夠靶向調(diào)控mTOR/S6K1信號通路，抑制p-mTOR、p-S6K1表達(dá)，從而起到改善糖尿病腎病大鼠腎組織細(xì)胞自噬活性、減輕腎組織損傷的作用。

綜上所述，下調(diào)糖尿病腎病模型大鼠miR-194-1表達(dá)，能夠改善大鼠血糖、血脂水平，改善糖尿病腎病模型大鼠腎臟病變狀況及腎功能，減輕炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激損傷嚴(yán)重程度，發(fā)揮腎臟保護(hù)作用，出現(xiàn)這一干預(yù)效果可能是由于下調(diào)miR-194-1表達(dá)能夠靶向調(diào)控mTOR/S6K1信號通路，從而起到減輕腎組織損傷的作用，為糖尿病腎病的臨床治療提供了新的研究方向。