何金濤 軒弘源 羅舒文 吳瓊 俞琦 田維毅

(貴州中醫(yī)藥大學(xué)，貴州 貴陽 550025)

近年來，中國心血管疾病(CVD)患病率和死亡率呈現(xiàn)逐年上升的趨勢〔1〕。動脈粥樣硬化(AS)被認(rèn)為是一種慢性炎癥性疾病，是引發(fā)CVD常見的病理基礎(chǔ)〔2〕。巨噬細(xì)胞(Macrophage)可通過吞噬(胞吞)、增殖、遷移和分泌促炎因子等方式參與AS發(fā)生、發(fā)展及最后斑塊破裂的整個過程，并起著關(guān)鍵作用〔3，4〕。研究表明，調(diào)控巨噬細(xì)胞極化方向，可能是干預(yù)AS的一種有效途徑〔5〕。中藥在AS治療中具有巨大的潛質(zhì)，運(yùn)用中藥抑制巨噬細(xì)胞向M1型極化、促進(jìn)向M2型極化，表現(xiàn)出了較強(qiáng)的抗炎性并能增加AS斑塊的穩(wěn)定性〔6〕。黃連解毒湯(HLJDD)為經(jīng)典的中藥復(fù)方，記載于《外臺秘要》，由黃連、黃芩、黃柏和梔子四位中藥組成，具有清三焦火熱，解毒的功效?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)其具有抗炎、降脂的作用，并能抑制AS進(jìn)展〔7〕。本研究通過觀察HLJDD對載脂蛋白E基因敲除(ApoE-/-)小鼠AS模型主動脈病理、血清炎癥因子及巨噬細(xì)胞極化標(biāo)記物CD197、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)和CD206表達(dá)的影響，探討其通過抑制巨噬細(xì)胞極化和炎癥發(fā)揮抗AS作用的可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實(shí)驗動物與藥材 8周齡SPF級雄性ApoE-/-小鼠，體重18～22 g，購于北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗動物中心，許可證號：SCXK(京)〔2016-0010〕。中藥飲片黃連、黃芩、黃柏、梔子一次性購于北京同仁堂貴陽分店，經(jīng)貴州中醫(yī)藥大學(xué)生藥教研室專家鑒定為正品。

1.1.2主要試劑與儀器 總膽固醇(TC)、三酰甘油(TG)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)和高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)試劑盒購自中生北控生物科技有限公司；超敏C反應(yīng)蛋白(hs-CRP)、腫瘤壞死因子(TNF)-α、白細(xì)胞介素(IL)-6、IL-4和IL-10酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒、iNOS抗體、CD197山羊多克隆抗體、CD206兔多克隆抗體、驢抗山羊免疫球蛋白(Ig)G二抗和山羊抗兔IgG二抗購自英國Abcam公司；蘇木素染液、油紅O染液購自美國Sigma公司；FC型酶標(biāo)儀、-80℃超低溫冰箱、高速冷凍離心機(jī)購自Thermo公司；AU480型全自動生化分析儀購自美國Beckman Coulter公司。

1.2方法

1.2.1制備HLJDD水煎液 黃連解毒湯按原方配伍比例3∶2∶2∶3(即黃連9 g、黃芩6 g、黃柏6 g、梔子 9 g )進(jìn)行常規(guī)方法配制。調(diào)至濃度為2 g/ml，放置于4℃冰箱備用，每周制備一次。

1.2.2動物 AS模型建立〔8〕ApoE-/-小鼠24只，適應(yīng)性喂養(yǎng)1 w后開始給予含脂肪37%、蛋白質(zhì)19.7%、碳水化合物43.3%的滅菌(西方膳食型)高脂飼料飲食造模。另設(shè)同周齡野生型C57BL/6J小鼠6只為正常(Control)組，給予普通飼料。造模12 w，確定AS成模后，將AS模型小鼠隨機(jī)分為模型(Model)組、黃連解毒湯高劑量(HLJDD-H)組、黃連解毒湯低劑量(HLJDD-L)組，每組6只，HLJDD-H、HLJDD-L給藥劑量分別為10 g/(kg·d)、2.5 g/(kg·d)，給藥體積為0.1 ml/10 g，正常組和模型組給予同體積生理鹽水，灌胃6 w，每日1次。

1.2.3血清及主動脈標(biāo)本采集 給藥結(jié)束后禁食不禁水12 h，摘眼球取血，常溫靜置2 h，3 000 r/min離心10 min，分離血清后-20℃冰箱保存，用于生化指標(biāo)檢測。無菌條件下取心臟及主動脈，一部分存放于10%中性甲醛溶液固定，另一部分液氮速凍，置于-80℃冰箱備用。取材過程符合實(shí)驗動物倫理學(xué)要求。

1.2.4血脂檢測 采用全自動生化分析儀檢測各組小鼠血清中TC、TG、LDL-C和HDL-C的含量。

1.2.5主動脈蘇木素-伊紅(HE)染色 從10%中性甲醛中取出心臟及主動脈根部石蠟包埋，進(jìn)行常規(guī)HE染色，光學(xué)顯微鏡下觀察主動脈病理變化并拍照保存。

1.2.6主動脈油紅O染色 將主動脈根部進(jìn)行橫切制作冰凍切片，進(jìn)行常規(guī)油紅O染色，拍照并用Image Pro Plus軟件對斑塊面積進(jìn)行分析。

1.2.7免疫熒光染色 將主動脈放入多聚甲醛20 min，室溫下通透組織切片20 min，3%牛血清白蛋白(BSA)室溫封閉1 h，按1∶100滴加iNOS和CD206抗體，4℃過夜，按1∶2 000滴加二抗，室溫1 h，按1∶7 000滴加4，6-二氨基-2-苯基吲哚(DAPI)，染色15 min。封片，熒光顯微鏡下觀察并拍照記錄并用Image pro plus軟件進(jìn)行分析。

1.2.8免疫組化染色(IH) 將主動脈依次放入二甲苯Ⅰ、Ⅱ各10 min，無水乙醇Ⅰ、Ⅱ各5 min，梯度酒精各3 min，蒸餾水浸洗2 min。磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗，修復(fù)抗原。3%過氧化氫溶液避光孵育20 min。加一抗孵育15 h，加二抗孵育50 min。加二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色液，陽性信號顯示為棕色，蘇木素復(fù)染3 min，氨水返藍(lán)。依次放入梯度酒精、無水乙醇、二甲苯進(jìn)行脫水。封片，光學(xué)顯微鏡下觀察、拍照并用Image Pro Plus軟件進(jìn)行指標(biāo)分析。

1.2.9血清指標(biāo)檢測 采用ELISA檢測各組小鼠血清中hs-CRP、TNF-α、IL-6、IL-4和IL-10含量，嚴(yán)格依照試劑盒說明書進(jìn)行操作。

1.3統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS17.0軟件進(jìn)行t檢驗、單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1HLJDD對各組血脂水平的影響 與Control組比較，Model組TC、TG和LDL-C水平均顯著升高，HDL-C顯著降低(P<0.01)。與Model組相比，HLJDD-H和HLJDD-L組TC、TG、和LDL-C水平均明顯降低，HDL-C顯著升高(P<0.05)。見表1。

表1 各組血清中TC、TG、LDL-C、HDL-Chs-CRP、TNF-α及IL-6水平比較

2.2HLJDD對各組血清中炎癥因子水平的影響 與Control組比較，Model組hs-CRP、TNF-α和IL-6水平均明顯升高，IL-4、IL-10水平明顯降低(P<0.01)。與Model組相比較，HLJDD-H和HLJDD-L組hs-CRP、TNF-α和IL-6水平均明顯降低(P<0.05，P<0.01)，IL-4、IL-10水平均明顯升高(P<0.05)。見表1、表2。

2.3HE染色觀察主動脈病理形態(tài) 與Control組比較，Model組主動脈內(nèi)膜大面積增厚，形成明顯的泡沫細(xì)胞，部分區(qū)域出現(xiàn)特征性的AS斑塊。與Model組比較，HLJDD-H和HLJDD-L組主動脈斑塊及血管壁泡沫細(xì)胞明顯減少。其中，HLJDD-H組比HLJDD-L組顯效更為明顯。見圖1。

表2 各組血清中IL-4、IL-10水平比較

圖1 HE染色觀察各組主動脈病理變化(×40)

2.4油紅O染色觀察AS斑塊 與Control組比較，Model組主動脈存在大面積斑塊，且分布大量脂滴。與Model組比較，HLJDD-H和HLJDD-L組主動脈斑塊面積和脂滴都明顯減少，HLJDD-H組比HLJDD-L組減少更為明顯。見圖2。

2.5免疫熒光染色觀察HLJDD對主動脈巨噬細(xì)胞iNOS、CD206表達(dá)的影響 與Control組比較，Model組M1型極化標(biāo)志物iNOS表達(dá)量明顯升高，M2型極化標(biāo)志物CD206表達(dá)量顯著降低(P<0.01)。與Model組比較，HLJDD-H和HLJDD-L組iNOS表達(dá)明顯降低，CD206表達(dá)顯著升高(P<0.01)。HLJDD-H組影響更明顯。見表3、圖3、圖4。

圖2 油紅O染色觀察各組AS斑塊(×40)

表3 各組主動脈壁iNOS、CD206水平、主動脈CD197、CD206陽性表達(dá)率比較

圖3 免疫熒光觀察各組主動脈斑塊iNOS表達(dá)量的變化(×200)

2.6免疫組化觀察主動脈CD197、CD206分子表達(dá) 陽性細(xì)胞顯色為棕色，藍(lán)色為細(xì)胞核。與Model組相比，HLJDD-H和HLJDD-L組CD197明顯減少，CD206明顯增多(P<0.01，P<0.05)。見表3、圖5、圖6。

圖4 免疫熒光觀察各組主動脈斑塊CD206表達(dá)量的變化(×200)

圖5 免疫組化觀察各組主動脈CD197 變化(×400)

圖6 免疫組化觀察各組主動脈CD206 變化(×400)

3 討 論

AS屬于一種動脈壁慢性炎癥性疾病〔9〕，炎癥反應(yīng)在AS中扮演著重要角色。AS形成過程主要以脂質(zhì)和炎癥細(xì)胞積累導(dǎo)致壞死性巨噬細(xì)胞和泡沫細(xì)胞積聚為特征〔10〕，活化的巨噬細(xì)胞通過炎癥機(jī)制在AS中發(fā)揮重要作用〔11〕。巨噬細(xì)胞廣泛參與免疫系統(tǒng)調(diào)節(jié)，具有較強(qiáng)的可塑性，根據(jù)極化后功能表現(xiàn)被分為M1型和M2型。經(jīng)典的M1型巨噬細(xì)胞具有促炎作用，極化的M2型巨噬細(xì)胞具有抗炎作用〔12〕。大量聚集的內(nèi)源性脂質(zhì)被氧化成氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)，可誘導(dǎo)趨炎性因子，如γ-干擾素(IFN-γ)、TNF-α、CRP等，激活單核細(xì)胞或巨噬細(xì)胞向經(jīng)典的M1型巨噬細(xì)胞極化，并分泌活性氧(ROS)、iNOS和IL-6等發(fā)揮促炎活性。IL-4則激活巨噬細(xì)胞向M2型巨噬細(xì)胞分化，并分泌抗炎因子IL-10發(fā)揮抗炎活性，能夠起到組織修復(fù)和穩(wěn)定AS斑塊作用〔10〕。因此，如何抑制巨噬細(xì)胞向M1型極化，促使向M2型分化將是控制炎癥和AS發(fā)展的關(guān)鍵。

近年來，中草藥在AS的治療中表現(xiàn)出了多效應(yīng)、多靶點(diǎn)和多途徑的優(yōu)勢。中醫(yī)認(rèn)為AS的病機(jī)多為“熱邪”與“毒邪”蘊(yùn)積。HLJDD作為清熱解毒類代表方劑，具有清瀉三焦之火，清熱解毒的功效，方中黃連、黃芩、黃柏、梔子按君、臣、佐、使合理配伍，使清解上中下三焦火熱毒邪之力更強(qiáng)?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，組方中的有效成分黃芩苷、小檗堿、梔子苷等具有抗炎、抗氧化、調(diào)脂、保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞、穩(wěn)定斑塊的作用〔7，13〕。同時，實(shí)驗研究也發(fā)現(xiàn)，HLJDD確有調(diào)控炎癥反應(yīng)，干預(yù)AS的作用〔14〕。目前，HLJDD在臨床炎癥性疾病中得到較多應(yīng)用并顯示出了良好的治療效果。

本研究結(jié)果證實(shí)，HLJDD確有抗AS作用。iNOS在M1型巨噬細(xì)胞中出現(xiàn)高表達(dá)，能夠損傷內(nèi)皮細(xì)胞，促使炎癥進(jìn)一步發(fā)展及AS斑塊的形成〔15〕，CD206作為M2型巨噬細(xì)胞極化的重要標(biāo)志，其水平升高提示巨噬細(xì)胞產(chǎn)生了抑炎作用來調(diào)節(jié)AS炎癥發(fā)展。因此，本研究推測，HLJDD抗AS作用可能與其促進(jìn)巨噬細(xì)胞向M2型極化，抑制M1型極化有關(guān)。與課題組前期研究一致〔16，17〕，本研究結(jié)果也顯示，HLJDD發(fā)揮抗炎、抗AS作用存在一定的量效關(guān)系。本研究將為清熱解毒類方藥應(yīng)用于抗AS及相關(guān)炎癥性疾病積累科學(xué)依據(jù)。