陳科全 葉展暉 許研 董旻昱

(廣州醫(yī)科大學(xué) 1附屬第一醫(yī)院消化內(nèi)科，廣東 廣州 510000；2附屬第二醫(yī)院消化內(nèi)科；3廣州市干部健康管理中心消化科)

結(jié)直腸癌是世界上常見的惡性腫瘤，由于早期結(jié)直腸癌臨床表現(xiàn)無特異性癥狀及體征，當(dāng)出現(xiàn)癥狀再進(jìn)行檢查時(shí)很多患者病程已處于晚期，而晚期結(jié)直腸癌患者5年生存率不足10%〔1～3〕。因此，在基因水平發(fā)現(xiàn)及深入研究與結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展的相關(guān)基因，對(duì)結(jié)直腸癌的早期防治和晚期診治都具有重要的意義。

四三肽重復(fù)序列(TPR)蛋白最早是酵母的細(xì)胞分裂周期蛋白中的一個(gè)蛋白相互作用的組件〔4〕，含TPR模體的蛋白質(zhì)在許多生理過程中起作用，其中包括細(xì)胞周期、細(xì)胞應(yīng)激、線粒體及微體膜的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)、轉(zhuǎn)錄和腫瘤發(fā)生等〔4～6〕。四三肽重復(fù)結(jié)構(gòu)域(TTC)12，也被稱為TPARM，是利用生物信息學(xué)方法篩選出的一個(gè)新的人類基因，位于NCAM1和DRD2基因之間，定位于人染色體11q23.2。TPARM是一種含有TPR 模體的蛋白質(zhì)，有研究報(bào)道TPARM 的mRNA在結(jié)腸癌、胃癌、成神經(jīng)細(xì)胞瘤、畸胎瘤中表達(dá)增加，而且TPR蛋白結(jié)構(gòu)域的突變可能參與了這些腫瘤的發(fā)生發(fā)展〔7〕。在急性淋巴白血病研究中發(fā)現(xiàn)TPARM基因啟動(dòng)子特異性高甲基化導(dǎo)致其表達(dá)減少，因此推測TPARM可能參與急性淋巴細(xì)胞白血病的發(fā)生〔8〕。此外， Thomas等〔9〕的研究發(fā)現(xiàn)TPARM基因突變會(huì)導(dǎo)致其功能受到影響，可能會(huì)導(dǎo)致運(yùn)動(dòng)纖毛功能障礙導(dǎo)致黏液纖毛清除功能受損和早期反復(fù)呼吸道感染，也會(huì)增加原發(fā)性纖毛運(yùn)動(dòng)障礙疾病發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)，而TPARM可能參與動(dòng)力蛋白的組裝，因此，TPARM可能也影響腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。本研究檢測結(jié)直腸癌細(xì)胞株SW480內(nèi)TPARM表達(dá)的情況及其對(duì)細(xì)胞增殖、凋亡、侵襲和遷移的影響，探討TPARM在結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展中的作用。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1主要試劑 RPMI1640細(xì)胞培養(yǎng)基、胎牛血清、胰蛋白酶購自美國的Gibco公司；Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染試劑購自美國Invitrogen公司；Trizol試劑、定量聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自中國天根生化科技公司；細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒(CCK)8購自美國 Bimake公司,二喹啉甲酸(BCA)蛋白試劑盒購自中國碧云天生物研究所；預(yù)染蛋白marker、電化學(xué)發(fā)光(ECL)試劑盒購自美國Thermo Fisher公司；TPARM抗體、山羊抗兔二抗購自英國Abcam公司，髓細(xì)胞白血病序列(Mcl)-1、B淋巴細(xì)胞瘤(Bcl)-xl、Bcl-2、Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bax)、周期蛋白依賴性激酶(CDK)2、CDK4、CDK6抗體購自美國CST公司；細(xì)胞凋亡檢測試劑盒購自于中國凱基生物科技發(fā)展有限公司；Transwell小室和基質(zhì)膠購于美國Corning公司。

1.1.2主要儀器 細(xì)胞超凈臺(tái)、恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱、RT-PCR儀為美國Thermo Fisher Scientific公司產(chǎn)品；多功能酶標(biāo)儀為美國Biotek公司產(chǎn)品；流式細(xì)胞儀為美國Becton Dickinson公司產(chǎn)品；蛋白電泳儀為美國Bio-Rad公司產(chǎn)品；定量PCR儀為瑞士Roche公司產(chǎn)品。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)及分組處理 人結(jié)腸癌細(xì)胞株SW480購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心，將細(xì)胞復(fù)蘇后培養(yǎng)于體積分?jǐn)?shù)為10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基中，并置于37℃、體積分?jǐn)?shù)為5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞生長至70%以上后消化傳代以進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。取對(duì)數(shù)生長期的SW480細(xì)胞分組轉(zhuǎn)染，按照Lipofectamine2000試劑盒說明書步驟操作。實(shí)驗(yàn)分為3組，NC組：SW480細(xì)胞不做任何處理；TPARM-siRNA組：SW480細(xì)胞轉(zhuǎn)染TPARM-siRNA(TPARM-siRNA序列，正義鏈：5′-GCUGAAGGCAAUUAUGAAATT-3′，反義鏈：5′-UUUCAUAAUUGCCUUCAGCTT-3′)；Scr-siRNA組：SW480細(xì)胞轉(zhuǎn)染Scr-siRNA。轉(zhuǎn)染后在37℃、體積分?jǐn)?shù)為5% CO2常規(guī)培養(yǎng)48 h，再收集各組細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2.2實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-qPCR)檢測TPARM mRNA的表達(dá) 取對(duì)數(shù)生長期的上述3組SW480細(xì)胞，用Trizol試劑分別進(jìn)行消化裂解獲取總的RNA，RNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA,然后進(jìn)行RT-qPCR。根據(jù)試劑盒說明書配制反應(yīng)體系，分別比較上述3組細(xì)胞的TPARM的mRNA表達(dá)量。以磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)作為內(nèi)參對(duì)照計(jì)算TPRAM mRNA表達(dá)水平(GAPDH和TPARM的序列為：GAPDH正義鏈：5′-GTCAACGGATTTGGTCGTATT-3′，反義鏈：5′-CTCCTGGAAGATGGTGATGGG-3′；TPARM正義鏈：5′-AGTATCATCAGTGACAACGAGG-3′，反義鏈：5′-GAACAGACACACAGACCATTTC-3′)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取其均值。

1.2.3Western印跡法檢測TPARM、Mcl-1、Bcl-xl、Bcl-2、Bax、CDK2、CDK4、CDK6蛋白的表達(dá) 取對(duì)數(shù)生長期的上述3組SW480細(xì)胞，用放射免疫沉淀法RIPA裂解液冰上裂解細(xì)胞提取總蛋白，在質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離后，轉(zhuǎn)移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，室溫下封閉1 h，4℃敷一抗過夜，Tris鹽緩沖液吐溫洗滌3次，每次10 min,室溫敷二抗2 h，洗滌后用ECL檢測試劑顯影條帶，使用ImageJ軟件對(duì)條帶進(jìn)行定量。

1.2.4CCK8法檢測各組SW480細(xì)胞增殖情況 取對(duì)數(shù)生長期的上述3組SW480細(xì)胞，離心5 min(1 000 r/min)，制備成單細(xì)胞懸液，將細(xì)胞以5 000個(gè)/孔鋪于96孔培養(yǎng)板中，每組設(shè)置5個(gè)平行孔，放置在37℃，體積分?jǐn)?shù)為5% CO2培養(yǎng)箱中，分別于培養(yǎng) 0、24、48、72 h后分別取出，向各待測孔中加入10 μl CCK8溶液，再繼續(xù)培養(yǎng)2 h后，在酶聯(lián)免疫檢測儀進(jìn)行450 nm處吸光度值測定，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.5平板克隆形成實(shí)驗(yàn)觀察各組SW480細(xì)胞增殖情況 取對(duì)數(shù)生長期的上述3組SW480細(xì)胞，離心5 min(1 000 r/min)，制備成單細(xì)胞懸液，將細(xì)胞接種于12孔培養(yǎng)板中，輕搖混勻，在37℃、體積分?jǐn)?shù)為5% CO2常規(guī)培養(yǎng)14 d使細(xì)胞形成集落,將各孔培養(yǎng)基棄去，用磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗3次，加入4%多聚甲醛固定20 min后，棄去固定液，加入結(jié)晶紫染色20 min。在光學(xué)顯微鏡下觀察細(xì)胞增殖形成的集落，計(jì)算克隆形成率=(各組克隆數(shù)/各組細(xì)胞數(shù))×100%。重復(fù)上述實(shí)驗(yàn)步驟3次。

1.2.6流式細(xì)胞術(shù)(FCM)檢測各組SW480細(xì)胞凋亡情況 取適量對(duì)數(shù)生長期的上述3組SW480細(xì)胞，接種細(xì)胞至6孔細(xì)胞培養(yǎng)板，24 h后，收集1×105～5×105個(gè)細(xì)胞，加入500 μl的膜聯(lián)蛋白V異硫氰酸熒光素、懸浮細(xì)胞，每組細(xì)胞加入5 μl的膜聯(lián)蛋白V異硫氰酸熒光素和5 μl的碘化丙啶(PI)染色液，室溫、避光、反應(yīng)5～15 min后，在1 h內(nèi)進(jìn)行流式細(xì)胞儀的觀察和檢測，并經(jīng)FlowJo軟件分析結(jié)果。

1.2.7Transwell小室侵襲實(shí)驗(yàn)檢測各組SW480細(xì)胞侵襲能力 將Transwell小室內(nèi)鋪上1∶10稀釋的基質(zhì)膠。取適量對(duì)數(shù)生長期的上述3組SW480細(xì)胞，消化、離心后用不含用FBS的培養(yǎng)基制備成單細(xì)胞懸液，將200 μl密度為5×105個(gè)/ml的細(xì)胞鋪于小室中，650 μl含20% FBS的培養(yǎng)基加入下室，置于37℃培養(yǎng)箱48 h后取上室，使用4%多聚甲醛固定15 min，用棉簽將小室上未穿過聚碳酸酯膜輕柔擦拭，用PBS清洗3次，室溫下 0.1%結(jié)晶紫染色30 min后用PBS清洗干凈，用棉簽擦拭小室殘留的結(jié)晶紫和PBS后晾干，后于倒置顯微鏡下隨機(jī)觀察3個(gè)視野中細(xì)胞數(shù)。重復(fù)上述實(shí)驗(yàn)步驟3次。

1.2.8劃痕實(shí)驗(yàn)檢測各組SW480細(xì)胞遷移能力 取適量對(duì)數(shù)生長期的上述3組SW480細(xì)胞，消化、離心后制備成單細(xì)胞懸液，將SW480細(xì)胞接種到6孔板上，細(xì)胞貼壁后用200 μl槍頭垂直于孔背面標(biāo)記線的垂線做劃痕，用PBS清洗3次后加入無血清培養(yǎng)基置于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，分別取劃痕后0、48 h培養(yǎng)板于顯微鏡下觀察劃痕彌合情況并拍照。重復(fù)上述實(shí)驗(yàn)步驟3次。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS21.0軟件行方差分析、t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1TPARM-siRNA對(duì)SW480細(xì)胞中TPARM的mRNA和蛋白表達(dá)水平的影響 NC組和Scr-siRNA組TPARM mRNA和蛋白的表達(dá)水平無顯著性差異(P>0.05)；而TPARM-siRNA組分別與NC組和Scr-siRNA組比較，TPARM mRNA和蛋白表達(dá)水平明顯降低(P<0.05)，見圖1、表1。

圖1 Western印跡檢測下調(diào)TPARM后 SW480細(xì)胞中TPARM的蛋白水平

表1 TPARM-siRNA轉(zhuǎn)染后對(duì)SW480細(xì)胞中TPARM的 mRNA和蛋白表達(dá)水平的影響

2.2下調(diào)TPARM對(duì)SW480細(xì)胞增殖水平的影響 NC組和Scr-siRNA組細(xì)胞增殖無顯著性差異(P>0.05),而TPARM-siRNA組分別與NC組和Scr-siRNA組比較，相對(duì)細(xì)胞活力和克隆形成率明顯降低(P<0.05)，見表2、圖2。

表2 TPARM-siRNA轉(zhuǎn)染后對(duì)SW480細(xì)胞中增殖水平的影響

圖2 平板克隆法檢測下調(diào)TPARM后SW480細(xì)胞增殖水平的變化(結(jié)晶紫染色)

2.3下調(diào)TPARM對(duì)SW480細(xì)胞周期相關(guān)蛋白表達(dá)水平的影響 NC組、Scr-siRNA組CDK2、CDK4及CDK6蛋白表達(dá)水平無顯著性差異(P>0.05)，而TPARM-siRNA組分別與NC組和Scr-siRNA組比較，CDK2、CDK4及CDK6蛋白的表達(dá)水平明顯下降(P<0.05)，見表2、圖3，提示敲低TPARM能影響結(jié)腸癌SW480細(xì)胞的G1/S期，從而抑制結(jié)腸癌SW480的增殖作用。

2.4下調(diào)TPARM對(duì)SW480細(xì)胞凋亡的影響 NC組和Scr-siRNA組細(xì)胞凋亡無顯著性差異(P>0.05)；而分別與NC組和Scr-siRNA組比較，TPARM-SiRNA組SW480細(xì)胞凋亡率均增加(P<0.05)，見圖4、表3。

2.5下調(diào)TPARM對(duì)SW480細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 NC組、Scr-siRNA組的Mcl-1、Bcl-xl、Bcl-2及Bax蛋白表達(dá)水平無顯著性差異(P>0.05)，而TPARM-siRNA組分別與NC組和Scr-siRNA組比較， Bcl-2、Bcl-xl、Mcl-1蛋白的表達(dá)水平明顯下降，Bax蛋白的表達(dá)量明顯增加(P<0.05)，見表3、圖5。

圖3 Western印跡法檢測下調(diào)TPARM后SW480細(xì)胞中 周期蛋白CDK2、CDK4、CDK6的水平

圖4 流式細(xì)胞術(shù)檢測下調(diào)TPARM后對(duì)SW480細(xì)胞凋亡率的影響

表3 TPARM-siRNA轉(zhuǎn)染后對(duì)SW480細(xì)胞凋亡水平的影響

圖5 Western印跡檢測轉(zhuǎn)染TPARM-siRNA后 SW480細(xì)胞凋亡蛋白Mcl-1、Bcl-xl、Bcl-2、Bax表達(dá)

2.6下調(diào)TPARM對(duì)SW480細(xì)胞侵襲、遷移能力的影響 NC組、Scr-siRNA組SW480細(xì)胞的侵襲能力無顯著性差異(P>0.05)，而TPARM-siRNA組SW480細(xì)胞分別與NC組和Scr-siRNA組SW480細(xì)胞比較，侵襲能力明顯下降(P<0.05)。NC組、Scr-siRNA組SW480細(xì)胞的遷移能無顯著性差異(P>0.05)，而TPARM-siRNA組SW480細(xì)胞分別與NC組和Scr-siRNA組SW480細(xì)胞比較，遷移能力明顯下降(P<0.05)。見圖6、圖7、表4。

圖6 Transwell小室侵襲實(shí)驗(yàn)檢測下調(diào)TPARM后SW480細(xì)胞侵襲能力的變化(結(jié)晶紫染色，×100)

圖7 劃痕實(shí)驗(yàn)檢測下調(diào)TPARM后SW480細(xì)胞遷移能力的變化(×40)

表4 TPARM-siRNA轉(zhuǎn)染后對(duì)SW480細(xì)胞侵襲、 遷移的影響

3 討 論

結(jié)直腸癌為消化道常見惡性腫瘤之一，而晚期結(jié)直腸癌患者5年生存率較低〔10〕。對(duì)結(jié)直腸癌的研究仍然存在很多未知領(lǐng)域〔11～14〕，因此結(jié)直腸癌發(fā)生的相關(guān)基因及分子機(jī)制的研究有助于進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)潛在的診斷和治療結(jié)直腸癌的新靶點(diǎn)。TPARM是一種能編碼蛋白質(zhì)的基因，其結(jié)構(gòu)包括TPR結(jié)構(gòu)域和ARM結(jié)構(gòu)域，結(jié)構(gòu)域的突變能促進(jìn)腫瘤的發(fā)生。本研究利用TPARM-siRNA轉(zhuǎn)染SW480，初步結(jié)果顯示TPARM mRNA和蛋白表達(dá)明顯受到抑制,驗(yàn)證了TPARM-siRNA的轉(zhuǎn)染效率。在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中敲低TPARM后，通過CCK8、平板克隆實(shí)驗(yàn)、流式細(xì)胞術(shù)檢測、Western印跡法檢測、Transwell小室侵襲實(shí)驗(yàn)及劃痕實(shí)驗(yàn)初步了解TPARM在結(jié)直腸癌細(xì)胞中的生物學(xué)行為，推測其可能通過促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖和抑制其凋亡，同時(shí)促進(jìn)其侵襲、遷移能力。因此由初步實(shí)驗(yàn)結(jié)果判斷，TPARM可能在結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要的作用，可能是潛在的癌基因。

細(xì)胞周期依賴性激酶(CDKs)是真核生物細(xì)胞周期有序驅(qū)動(dòng)的核心調(diào)控子，參與細(xì)胞周期調(diào)控的CDKs中CDK2、CDK4和CDK6主要作用于細(xì)胞周期的G1期和S期,參與DNA復(fù)制的啟動(dòng)和誘發(fā)有絲分裂。CDK2蛋白已被證實(shí)在結(jié)腸癌組織中較正常組織明顯升高,有研究發(fā)現(xiàn)，CDK2是結(jié)腸癌細(xì)胞中姜黃素的直接靶標(biāo)，姜黃素能通過抑制CDK2活性阻滯結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖〔15〕。本研究發(fā)現(xiàn)，敲低TPARM后CDK2、CDK4、CDK6蛋白表達(dá)水平明顯下降，考慮TPARM可能通過影響結(jié)腸癌細(xì)胞周期中的G1期和S期來影響結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖水平。

Bcl-2家族是與細(xì)胞凋亡密切相關(guān)的一個(gè)家族，美國藥物管理局現(xiàn)已批準(zhǔn)以Bcl-2為設(shè)計(jì)靶點(diǎn)的藥物用于癌癥治療〔16〕。Bcl-2家族中抗凋亡的蛋白包括有Bcl-2、Bcl-xl、Bcl-w、Mcl-1等，它們通過抑制促凋亡蛋白發(fā)揮抗細(xì)胞凋亡的作用；與之作用相反的促凋亡的蛋白有Bcl-2拮抗/殺傷因子(Bak)、Bax、Bcl-2家族凋亡調(diào)節(jié)劑(Bok)等，通過在線粒體膜上形成線粒體膜通道釋放細(xì)胞色素C,激活下游半胱氨酸蛋白酶(caspases)來發(fā)揮促進(jìn)細(xì)胞凋亡的作用。Bcl-2常作為腫瘤藥物靶標(biāo),有研究發(fā)現(xiàn)，抑制Bcl-2的表達(dá)可以明顯抑制肺癌細(xì)胞的細(xì)胞遷移和集落形成,體內(nèi)及體外實(shí)驗(yàn)都明顯降低了肺癌細(xì)胞的生長〔17〕,也有研究證實(shí)在治療急性髓細(xì)胞白血病中，抑制Mcl-1為靶向的藥物具有很大的治療價(jià)值〔18〕。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，敲低TPARM后Mcl-1、Bcl-xl、Bcl-2的蛋白表達(dá)水平下降，Bax表達(dá)升高，考慮TPARM抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的凋亡與其影響B(tài)cl-2家族部分蛋白的表達(dá)相關(guān)。

綜上，TPARM在結(jié)直腸癌中可能具有重要作用，與結(jié)腸癌細(xì)胞增殖增加及凋亡減少相關(guān)，為TPARM在結(jié)直腸癌中發(fā)揮重要作用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)；結(jié)合臨床研究TPARM的功能、基因調(diào)控機(jī)制及其與結(jié)直腸癌患者病情及預(yù)后之間的關(guān)系，探尋新的結(jié)直腸癌診斷標(biāo)志點(diǎn)及治療新靶點(diǎn)。