黃俊霞 郭志鵬 張秀珍 朱建業(yè) 金道遠 王旭

(1漯河醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校第二附屬醫(yī)院麻醉科，河南 漯河 462300；2河南省人民醫(yī)院麻醉與圍術(shù)期醫(yī)學(xué)科)

癌癥是全球范圍內(nèi)最大的公共衛(wèi)生問題，是繼心血管疾病之后人類的第二死因，死亡人數(shù)遠遠超過人體免疫功能喪失病毒/后天免疫功能喪失綜合征、結(jié)核病和瘧疾的總和〔1〕。其中，乳腺癌是導(dǎo)致女性死亡的主要原因，僅2018年乳腺癌新增病例高達210萬例，嚴(yán)重威脅著女性的健康與生命〔2〕。

咪達唑侖(MDZ)具有抗焦慮、鎮(zhèn)靜、催眠、抗驚厥等藥理作用〔3〕。此外，MDZ可誘導(dǎo)多種癌細胞凋亡，緩解惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展，比如下咽鱗狀細胞癌、結(jié)腸癌、非小細胞肺癌、肝癌等，但在乳腺癌中的應(yīng)用尚無報道。本研究探討MDZ對乳腺癌細胞MDA-MB-231增殖、凋亡、干樣特性及蛋白激酶B(AKT)的影響。

1 材料與方法

1.1細胞 人乳腺癌細胞MDA-MB-231(中國科學(xué)院細胞庫，貨號：TCHu227)。

1.2試劑 MDZ注射液，湖北宜昌人福藥業(yè)有限責(zé)任公司；RPMI1640培養(yǎng)基、10%胎牛血清、青/鏈霉素溶液，美國Cellgro公司；生理鹽水、磷酸鹽緩沖液(PBS)、4%多聚甲醛溶液，南京森貝伽生物科技有限公司；干細胞培養(yǎng)基、0.1%結(jié)晶紫溶液，上海源葉生物公司；膜聯(lián)蛋白V-異硫氰酸熒光素(Annexin V-FITC)細胞凋亡檢測試劑盒，上海碧云天生物技術(shù)有限公司；二喹啉甲酸(BCA)試劑盒、RIPA裂解液、0.1%Triton X-100溶液，上海威奧生物科技有限公司；八聚體結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子(OCT)4、 性別決定區(qū)γ框蛋白(SOX2)、AKT等相關(guān)抗體，賽默飛世爾科技(中國)有限公司。

1.3儀器 Gallios流式細胞儀，美國貝克曼庫爾特公司；HH-M4無菌水浴鍋、WJ-80A-II CO2恒溫培養(yǎng)箱，上海赫田科學(xué)儀器有限公司；ZYP-220雙目偏光顯微鏡，上海兆儀光電科技有限公司；KH-19A 多功能高速冷凍離心機；SW-CJ-2D超凈工作臺，青島聚創(chuàng)環(huán)保集團有限公司。

1.4細胞培養(yǎng)及分組 將凍存的人乳腺癌細胞MDA-MB-231取出，采用無菌水浴鍋融化，培養(yǎng)于含有10%胎牛血清、1%青鏈霉素溶液的RPMI1640培養(yǎng)基中，置于37℃、5%CO2的恒溫箱中培養(yǎng)，待細胞融合度達80%及以上時，進行消化傳代，取對數(shù)生長期的細胞進行實驗，根據(jù)在細胞中加入的MDZ濃度，進行分組(0.0、7.5、15.0、30.0、75.0、150.0、300.0、600.0、1 200.0 μmol/L)，其中0.0 μmol/L MDZ組為對照組，加入等體積的生理鹽水溶液。

1.5CCK8法檢測細胞活力 取對數(shù)生長期細胞，調(diào)整濃度5×105/ml，取100 μl細胞懸液接種于96孔板，放置37℃、5% CO2培養(yǎng)箱24 h，分別加入不同濃度的MDZ 0.0、7.5、15.0、30.0、75.0、150.0、300.0、600.0、1 200.0 μmol/L，每組設(shè)置5個復(fù)孔，24 h后，每孔加入10 μl的CCK8試劑，孵育1 h后，用酶標(biāo)儀于450 nm處測吸光度值OD。根據(jù)說明書指示計算細胞的相對活力，篩選合適劑量。

1.6克隆形成檢測細胞增殖 取對數(shù)生長期細胞，重懸離心后，調(diào)整密度為5×105/ml，分別加入1.5篩選出的合適濃度的MDZ(0、75、150、300 μmol/L)，放置37℃、5% CO2培養(yǎng)箱24 h，用PBS洗滌2次，用4%多聚甲醛溶液固定，用0.1%結(jié)晶紫溶液染色處理后。在Epson Perfection V200掃描儀下拍照并統(tǒng)計。

1.7流式檢測細胞凋亡 取1.6加入合適劑量培養(yǎng)24 h后的細胞，用PBS洗滌、離心、重懸細胞后，依次加入5 μl Annexin V-FITC及5 μl碘化丙啶(PI)染液混勻，室溫下避光反應(yīng)10 min，洗去染色液，運用流式細胞儀檢測。

1.8Western印跡檢測凋亡相關(guān)蛋白的表達 取1.6加入合適劑量培養(yǎng)24 h后的細胞，用冷的PBS洗滌、稀釋后，加入裂解液反應(yīng)，離心后，根據(jù)BCA試劑盒說明，進行蛋白定量、聚丙烯酰胺凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜，加入半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(Caspase)-3、Caspase-9相應(yīng)抗體，進行免疫反應(yīng)后，顯色并檢測分析。

1.9顯微觀察干細胞成球 取1.6加入合適劑量培養(yǎng)24 h后的細胞，消化、離心后轉(zhuǎn)移至干細胞培養(yǎng)基，重懸細胞并計數(shù)，細胞鋪板后，培養(yǎng)10 d,在顯微鏡下觀察成球數(shù)量及狀態(tài)。

1.10Western印跡檢測干細胞標(biāo)志物 取1.6加入合適劑量培養(yǎng)24 h后的細胞，PBS洗滌，加入裂解液，收集上清液。按照BCA試劑盒說明，進行蛋白定量、電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉后，選用OCT4、 SOX2相應(yīng)抗體，進行一抗、二抗、顯色等操作。

1.11Western印跡檢測AKT磷酸化(p-AKT) 取1.6加入合適劑量培養(yǎng)24 h后的細胞，PBS洗滌，加入裂解液，收集上清液。按照BCA試劑盒說明，進行蛋白定量、電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉后，選用AKT相應(yīng)抗體，進行一抗、二抗、顯色等操作。

1.12免疫熒光檢測AKT的核轉(zhuǎn)位 取1.6加入合適劑量培養(yǎng)24 h后的細胞，PBS洗滌，加入4%多聚甲醛固定細胞，PBS洗滌，加入0.1%Triton X-100透化細胞，PBS洗滌，加入5%牛血清白蛋白封閉，加入AKT抗體反應(yīng)過夜，加入FITC試劑，避光反應(yīng)30 min，PBS洗滌，加入4′，6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)試液染核，室溫避光反應(yīng)5 min后，采用熒光顯微鏡進行觀察。

1.13統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS20.0軟件進行方差分析。

2 結(jié) 果

2.1MDZ對乳腺癌細胞MDA-MB-231活力的影響 0.0、7.5、15.0、30.0、75.0、150.0、300.0、600.0、1 200.0 μmol/L咪噠唑侖處理后，MDA-MB-231細胞活力分別為(100±6)%、(99±5)%、(97±6)%、(94±7)%、(85±6)%、(53±7)%、(31±8)%、(13±4)%和(7±5)%。與對照組相比，咪噠唑侖濃度不高于75.0 μmol/L對MDA-MB-231細胞活力的影響無明顯差異。隨咪噠唑侖濃度的增加，對細胞活力的抑制作用明顯(P<0.05)。提示咪噠唑侖抑制乳腺癌細胞MDA-MB-231的生長。選擇0.0、75.0、150.0、300.0 μmol/L劑量組，進行后續(xù)實驗。

2.2MDZ對乳腺癌細胞MDA-MB-231增殖的影響 與對照組〔(65±6)%〕相比，MDZ 75 μmol/L組克隆形成率〔(64±7)%〕無明顯差異，MDZ 150、300 μmol/L組的染色細胞較少，克隆細胞形成率明顯降低〔(27±9)%、(15±8)%，P<0.05〕。見圖1。提示MDZ抑制MDA-MB-231細胞增殖，緩解乳腺癌的病程。

圖1 MDZ對乳腺癌細胞MDA-MB-231增殖的影響(結(jié)晶紫染色，×100)

2.3MDZ對乳腺癌細胞MDA-MB-231凋亡的影響 與對照組相比，MDZ 75 μmol/L組對MDA-MB-231細胞凋亡率的影響無明顯差異，MDZ 150、300 μmol/L組細胞凋亡率均顯著升高(P<0.05)；與對照組相比，MDZ 75 μmol/L組凋亡蛋白表達水平無明顯差異，150、300 μmol/L組凋亡蛋白Cleaved Caspase3/Caspase3、Cleaved Caspase9/Caspase9表達水平均顯著升高(P<0.05)。見表1、圖2、圖3。

2.4MDZ對乳腺癌細胞MDA-MB-231腫瘤干樣特性的影響 與對照組相比，MDZ 75 μmol/L組干細胞成球數(shù)目及直徑無明顯差異(P>0.05)，MDZ 150、300 μmol/L組干細胞成球數(shù)量及直徑明顯減少(P<0.05)。與對照組相比，MDZ 75 μmol/L組SOX2、OCT4表達無明顯差異，MDZ 150、300 μmol/L組SOX2、OCT4表達明顯減少(P<0.05)。見表1、圖4、圖5。

表1 MDZ對乳腺癌細胞MDA-MB-231凋亡及腫瘤干樣特性的影響

圖2 MDZ對乳腺癌細胞MDA-MB-231凋亡的影響

1～4：對照組,MDZ 75 mol/L組,MDZ 150 mol/L組,MDZ 300 mol/L組；圖5、圖6同圖3 Western印跡檢測各組相關(guān)蛋白表達

圖4 各組乳腺癌腫瘤干細胞成球數(shù)目的變化(×100)

圖5 Western印跡檢測各組MDA-MD-231 細胞中SOX2和OCT4蛋白表達

2.5MDZ對乳腺癌細胞MDA-MB-231 AKT的影響 與對照組相比，MDZ 75 μmol/L組p-AKT表達水平無明顯差異，MDZ 150、300 μmol/L組p-Akt表達明顯減少(P<0.05)。與對照組比較，MDZ 75 μmol/L組熒光集中于細胞核、細胞核內(nèi)AKT+熒光的水平無顯著差異，MDZ 150、300 μmol/L組細胞核內(nèi)熒光較少、AKT+熒光的水平明顯減少(P<0.05)。見表2、圖6、圖7。

表2 MDZ對乳腺癌細胞AKT的影響

圖6 Western印跡檢測各組MDA-MB-231 細胞中AKT蛋白磷酸化

圖7 免疫熒光染色檢測各組MDA-MB-231 細胞核中AKT蛋白表達(×400)

3 討 論

乳腺癌是乳腺上皮細胞在致癌因子的誘導(dǎo)下，發(fā)生增殖失控，進而腫瘤惡變的現(xiàn)象。乳腺癌細胞具有易脫落，隨血液、淋巴液進行全身擴散轉(zhuǎn)移的特點，是導(dǎo)致患者死亡的主要原因。隨著社會進步和醫(yī)療水平的提高，乳腺癌的治療包括手術(shù)、放、化療、分子靶向、免疫治療等方式。但仍有副作用顯著、預(yù)后較差、復(fù)發(fā)率高等現(xiàn)象，具有一定的局限性〔4〕。據(jù)統(tǒng)計，乳腺癌的發(fā)病率及死亡率呈逐年上升趨勢，并且越來越年輕化，嚴(yán)重威脅女性健康，因此，尋找高效低毒的抗乳腺癌藥物具有重要意義。

腫瘤干細胞(CSC)具有腫瘤啟動的能力，通過分裂進行擴增與分化，促使腫瘤形成，是腫瘤復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的主要原因〔10〕。Islam等〔11〕研究發(fā)現(xiàn)，丁香酚通過抑制乳腺癌干細胞和NF-κB信號通路增強順鉑抗癌活性；Bashmail等〔12〕報道指出百里醌通過抑制腫瘤相關(guān)干細胞來增強紫杉醇的抗乳腺癌活性。其中，SOX2是典型的腫瘤細胞干性調(diào)控因子，能夠與腫瘤細胞膜上的糖蛋白配體結(jié)合，促進絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)或AKT信號通路激活，進一步提高腫瘤細胞的轉(zhuǎn)錄失常風(fēng)險。此外，SOX2能夠誘導(dǎo)腫瘤細胞的變形，促進腫瘤的發(fā)展〔13〕。而OCT4通過結(jié)合轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子配體，進一步提高腫瘤細胞上游轉(zhuǎn)錄的活性，激活轉(zhuǎn)錄啟動子和增強子〔14〕。此外，OCT4能夠提高腫瘤干細胞的比例，誘導(dǎo)癌細胞內(nèi)AKT信號通路的上調(diào)，進一步激活下游多種腫瘤相關(guān)分子，并參與到乳腺癌的發(fā)生過程〔15〕。本研究與上述研究一致，提示MDZ抑制乳腺癌細胞腫瘤干樣特性，降低腫瘤細胞的自我更新及分化，緩解乳腺癌的發(fā)生發(fā)展。AKT是調(diào)控細胞增殖和凋亡的重要信號通路。Kang等〔3〕報道顯示MDZ激活Caspase、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激通路，抑制Akt通路，誘導(dǎo)小鼠睪丸間質(zhì)細胞TM3凋亡；Hou等〔16〕研究指出rApoptin通過磷酸化Nur77和Akt誘導(dǎo)人乳腺癌細胞凋亡；Tan等〔17〕研究表明，豬苓菌通過Akt調(diào)控的抗凋亡和促凋亡信號，增強Caspase-3的表達，抑制乳腺癌細胞增殖，促進其凋亡。本研究與上述研究一致，提示MDZ通過下調(diào)p-AKT水平及抑制AKT核轉(zhuǎn)位，緩解乳腺癌的進程。

綜上，MDZ誘導(dǎo)乳腺癌細胞MDA-MB-231凋亡并抑制腫瘤細胞惡性增殖、干樣特性，其機制可能是通過下調(diào)SOX2、OCT4表達，減少癌細胞內(nèi)AKT信號通路的調(diào)節(jié)，從而抑制p-AKT水平及AKT核轉(zhuǎn)位。因此，MDZ具有抑制乳腺癌的潛力及深入研究的價值。