吳灶璇 王桂良 肖歸 邱萍 徐林芳 龔敏 李興 文劍波

(1南方醫(yī)科大學(xué)附屬萍鄉(xiāng)醫(yī)院消化內(nèi)科，江西 萍鄉(xiāng) 337000；2海南醫(yī)學(xué)院護(hù)理學(xué)院)

胰腺癌是預(yù)后最差的消化系統(tǒng)惡性腫瘤之一，治療難度大，病死率高〔1〕。癌基因的異常擴(kuò)增和表達(dá)、抑癌基因的突變或失活及多個(gè)基因的協(xié)同作用等在胰腺癌的發(fā)生中起重要作用〔2〕。熱休克轉(zhuǎn)錄因子(HSF)1在癌細(xì)胞中，通過DNA修復(fù)、調(diào)節(jié)細(xì)胞周期、調(diào)節(jié)能量代謝、調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡和自噬等途徑，對(duì)促進(jìn)癌細(xì)胞的存活及增殖發(fā)揮重要作用〔3〕。自噬在癌形成過程中發(fā)揮重要作用，通過感受器和效應(yīng)器共同調(diào)節(jié)多途徑的生物學(xué)過程，在維持細(xì)胞自我平衡過程中起重要作用〔4〕。Beclin1是連接自噬與凋亡通道的關(guān)鍵分子，能誘導(dǎo)細(xì)胞自噬性死亡及凋亡、抑制炎癥擴(kuò)散、預(yù)防基因突變及抑制腫瘤細(xì)胞的增殖〔5〕。HSF1和Beclin1均與胰腺癌的發(fā)生發(fā)展相關(guān)，但二者在胰腺癌中表達(dá)的相關(guān)性及其影響胰腺癌發(fā)生發(fā)展的機(jī)制尚不清楚。本研究通過檢測(cè)HSF1和Beclin1 mRNA和蛋白在胰腺癌組織、癌旁組織中表達(dá)的情況，探討二者與胰腺癌生物學(xué)行為的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1患者與試劑 根據(jù)采用國(guó)際抗癌聯(lián)盟(UICC)和美國(guó)腫瘤聯(lián)合委員會(huì)(AJCC)2017年第6版分期標(biāo)準(zhǔn)，收集南方醫(yī)科大學(xué)附屬萍鄉(xiāng)醫(yī)院2015年1月至2020年9月6例新鮮切除的Ⅰ期和Ⅱ期胰腺癌及癌旁組織、196例石蠟標(biāo)本胰腺癌組織標(biāo)本，其中包括45例經(jīng)手術(shù)切除的Ⅰ期和Ⅱ期患者和151例不能手術(shù)而經(jīng)超聲內(nèi)鏡引導(dǎo)細(xì)針穿刺(EUS+FNA)診斷的Ⅲ期和Ⅳ期患者。正常胰腺組織來源于胰腺體尾部β細(xì)胞瘤鄰近胰腺組織及外傷后經(jīng)手術(shù)部分切除的胰腺組織。臨床病理學(xué)參數(shù)包括性別、年齡、腫瘤直徑、腫瘤位置、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、分化程度和TNM分期。研究方案已經(jīng)過南方醫(yī)科大學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。兔抗HSF1、磷酸化HSF1抗體、兔抗Beclin1多克隆抗體購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司。

1.2方法

1.2.1蘇木素-伊紅(HE)染色 組織固定、脫水，切片為5 μm厚的薄片，烤片后進(jìn)行二甲苯脫蠟，常規(guī)酒精水化，蘇木素染細(xì)胞核，伊紅染細(xì)胞質(zhì)，進(jìn)行酒精梯度脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片后進(jìn)行鏡下觀察。

1.2.2HSF1和Beclin1免疫組織化學(xué)染色 組織經(jīng)10%甲醛固定后脫水、包埋，切片，微波修復(fù)，3%過氧化氫封閉內(nèi)源性過氧化物酶，血清封閉。依次加入一抗、二抗，二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色，蘇木素復(fù)染，常規(guī)脫水，透明，中性樹膠封片。根據(jù)染色強(qiáng)度和陽性細(xì)胞百分比來評(píng)分進(jìn)行定性分析。出現(xiàn)棕黃色顆粒沉淀為陽性表達(dá)。強(qiáng)度評(píng)分：0(無染色)、1(淺黃色)、2(棕黃色)及3分(棕褐色)。比例積分：0(<10%陽性細(xì)胞)、1(≥10%且<25%陽性細(xì)胞)、2(≥25%且<50%陽性細(xì)胞)、3(≥50%且<75%陽性細(xì)胞)和4分(≥75%陽性細(xì)胞)。強(qiáng)度評(píng)分和比例積分相乘產(chǎn)生最終的染色評(píng)分：<7分定義為低表達(dá)，≥7分定義為高表達(dá)。采用 Image-pro plus6.0分析光密度進(jìn)行定量分析，以積分光密度(IOD)除以面積(Area)計(jì)算平均光密度(AOD)，即AOD = IOD/Area。

1.2.3RNA分離和實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(Rt-PCR) 以Trizole法提取RNA。使用MMLV逆轉(zhuǎn)錄，得到cDNA。引物合成及探針修飾由上海生物工程有限公司完成，HSF1擴(kuò)增引物：正向5′-CCATCCTGCGGGAGAGTGAA-3′，反向5′-GGCTCCGAGCCTGTCAGCA-3′(擴(kuò)增長(zhǎng)度為106 bp)。Beclin1擴(kuò)增引物：正向5′-GATTGAAGACACAGGAGGCAGT-3′，反向5′-GTGAGGACACCCAAGCAAGAC-3′(擴(kuò)增長(zhǎng)度為97 bp)。GAPDH擴(kuò)增引物：正向5′-GAAGATCAAGATCATTGCTCCT-3′；反向5′-CACCCTGTTGCTGTAGCCAAA-3′(擴(kuò)增長(zhǎng)度為102 bp)。反應(yīng)條件：95℃ 3 min行變性，95℃循環(huán)15 s，56℃ 10 s，72℃下進(jìn)行45 s，循環(huán)35次。然后計(jì)算HSF1 mRNA和Beclin1 mRNA的ΔCt值均數(shù)和標(biāo)準(zhǔn)差，所有標(biāo)本的mRNA的相對(duì)表達(dá)量均經(jīng)GAPDH校正。

1.2.4Western印跡 稱取80～100 mg癌組織，按1∶10的比例加入細(xì)胞裂解液，勻漿后離心，取上清液提取總蛋白，用酶標(biāo)儀定量。按每孔40 μg蛋白量上樣，聚丙烯酰胺凝膠電泳，電轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，封閉，PVDF膜置于一抗稀釋液(1∶1 000稀釋)中4℃過夜，洗膜，再置于二抗稀釋液(1∶5 000稀釋)中室溫孵育2 h，洗膜，加入化學(xué)發(fā)光底物，顯影，GAPDH作為內(nèi)參照，用Quantity One4.3.1凝膠圖像分析系統(tǒng)分析蛋白灰度值。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS19.0軟件進(jìn)行χ2檢驗(yàn)、秩和檢驗(yàn)、方差分析、Spearman相關(guān)性分析、Pearson相關(guān)性分析。采用Log-rank檢驗(yàn)比較生存率的差異，以單因素分析和Cox回歸分析預(yù)后獨(dú)立影響因素。

2 結(jié) 果

2.1HSF1、Beclin1 mRNA及蛋白在新鮮胰腺癌組織、癌旁組織和正常組織的表達(dá) 與癌旁組織和正常組織相比，癌組織中總HSF1 mRNA和蛋白、磷酸化(p)-HSF1蛋白及Beclin1 mRNA和蛋白表達(dá)均顯著升高(均P<0.05)。見圖1、表1。

圖1 HSF1和Beclin1蛋白在癌組織、 癌旁組織和正常組織中的表達(dá)

表1 HSF1和Beclin1 mRNA及蛋白在癌組織、 癌旁組織和正常組織中的表達(dá)

2.2HSF1蛋白在石蠟標(biāo)本胰腺癌組織、癌旁組織和正常組織表達(dá) HE染色顯示，正常組織和癌旁組織中可見典型的外分泌腺腺泡結(jié)構(gòu)，細(xì)胞排列規(guī)則。癌組織中無典型的腺泡樣結(jié)構(gòu)，細(xì)胞排列不規(guī)則，細(xì)胞大小不一，邊界不清，核大深染，無核仁，腺管呈條索狀；石蠟標(biāo)本癌組織中，總HSF1蛋白在癌組織中細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核均有表達(dá)，主要表達(dá)在細(xì)胞質(zhì)，部分表達(dá)在細(xì)胞核，p-HSF1部分表達(dá)在細(xì)胞質(zhì)，有較多的表達(dá)在細(xì)胞核。在石蠟標(biāo)本癌旁組織和正常組織中，總HSF1主要表達(dá)在細(xì)胞質(zhì)，而細(xì)胞核中表達(dá)較少，細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中p-HSF1表達(dá)極少。與癌旁組織和正常組織相比，總HSF1蛋白在胰腺癌中的表達(dá)顯著性升高。HSF1蛋白在不同分化程度的胰腺癌中表達(dá)趨勢(shì)是高分化<中分化<低分化，在不同分期的胰腺癌中表達(dá)趨勢(shì)是Ⅰ期<Ⅱ期<Ⅲ期<Ⅳ期。見圖2。

圖2 HSF1蛋白在石蠟標(biāo)本胰腺癌組織、癌旁組織和正常組織中表達(dá)(×400)

2.3Beclin1蛋白在石蠟標(biāo)本胰腺癌組織、癌旁組織和正常組織的表達(dá) Beclin1蛋白主要于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)表達(dá)，癌組織中Beclin1蛋白明顯高于癌旁組織和正常組織，癌旁組織和正常組織間無明顯差異，Beclin1蛋白在不同分化程度的胰腺癌中表達(dá)趨勢(shì)是高分化<中分化<低分化，在不同分期的胰腺癌中表達(dá)趨勢(shì)是Ⅰ期<Ⅱ期<Ⅲ期<Ⅳ期。見圖3。

圖3 Beclin1蛋白在石蠟標(biāo)本胰腺癌組織、癌旁組織和正常組織中表達(dá)(免疫組織化學(xué)染色，×400)

2.4HSF1和Beclin1蛋白表達(dá)構(gòu)成比與胰腺癌患者臨床病理學(xué)特征的關(guān)系 對(duì)構(gòu)成比分析，HSF1與Beclin1蛋白水平均與患者的年齡、性別、腫瘤直徑、腫瘤位置均不相關(guān)(P>0.05)，與分化程度、TNM分期、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均相關(guān)；HSF1表達(dá)與分化級(jí)別負(fù)相關(guān)，與TNM分期正相關(guān)，與遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移正相關(guān)，Beclin1蛋白表達(dá)與分化級(jí)別負(fù)相關(guān)，與TNM分期正相關(guān)，與遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移正相關(guān)(均P<0.05)。見表2。

表2 HSF1或Beclin1蛋白表達(dá)構(gòu)成比在胰腺癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系(n)

2.5HSF1和Beclin1蛋白表達(dá)豐度與胰腺癌組織中患者臨床病理學(xué)參數(shù)的關(guān)系 HSF1蛋白表達(dá)豐度與性別、年齡、腫瘤直徑和腫瘤位置不相關(guān)(P>0.05)，而與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和分化程度相關(guān)(P<0.05)。表達(dá)趨勢(shì)是：淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(+)>淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(-)，遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移(+)>遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移(-)，Ⅰ期<Ⅱ期<Ⅲ期<Ⅳ期，高分化<中分化<低分化；Beclin1蛋白表達(dá)豐度與性別、年齡、腫瘤直徑和腫瘤位置不相關(guān)(P>0.05)，而與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和分化程度相關(guān)(P<0.05)。表達(dá)趨勢(shì)是：淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(+)>淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(-)，遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移(+)>遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移(-)，Ⅰ期<Ⅱ期<Ⅲ期<Ⅳ期，高分化<中分化<低分化。見表3。

表3 HSF1蛋白或Beclin1蛋白表達(dá)豐度與胰腺癌 臨床病理參數(shù)的關(guān)系

2.6HSF1和Beclin1表達(dá)相關(guān)性 HSF1高表達(dá)患者中Beclin1高表達(dá)率為71.8%；HSF1低表達(dá)患者中Beclin1低表達(dá)率為80.0%，二者呈正相關(guān)(r=0.743,P<0.05)。HSF1和Beclin1表達(dá)豐度呈正相關(guān)(P<0.001)。見圖4。

2.7HSF1和Beclin1對(duì)胰腺癌預(yù)后的危險(xiǎn)因素分析 單因素分析顯示腫瘤分化程度、TNM分期、淋巴結(jié)狀態(tài)及Beclin1及HSF1表達(dá)水平與胰腺癌預(yù)后密切相關(guān)。進(jìn)一步多因素Cox回歸分析顯示淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期、分化程度、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、HSF1及Beclin1表達(dá)水平是胰腺癌預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。見表4。

2.8HSF1聯(lián)合Beclin1對(duì)胰腺癌患者生存的預(yù)測(cè)價(jià)值 手術(shù)治療的Ⅰ+Ⅱ期患者和不能手術(shù)的Ⅲ+Ⅳ期患者的生存率的順序均為：HSF1(低表達(dá))+Beclin1(低表達(dá))>HSF1(低表達(dá))+Beclin1(高表達(dá))>HSF1(高表達(dá))+Beclin1(低表達(dá))>HSF1(高表達(dá))+Beclin1(高表達(dá))。見圖5。

圖4 HSF1和Beclin1表達(dá)豐度的相關(guān)性

表4 HSF1和Beclin1對(duì)胰腺癌預(yù)后的危險(xiǎn)因素分析

圖5 HSF1聯(lián)合Beclin1對(duì)不同分期胰腺癌患者生存的預(yù)測(cè)價(jià)值

3 討 論

胰腺癌是一種惡性程度極高的腫瘤，其發(fā)生是個(gè)多基因、多步驟、多階段的演變過程，在演變過程中涉及很多基因的表達(dá)異?！?〕。炎癥、凋亡、應(yīng)激、自噬等病理過程也參與了癌癥的發(fā)生和發(fā)展〔6〕。HSF1是和應(yīng)激相關(guān)的一個(gè)非常重要的轉(zhuǎn)錄因子，在胰腺癌組織中，通過DNA修復(fù)、調(diào)節(jié)細(xì)胞周期、調(diào)節(jié)能量代謝、調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡和自噬等途徑，對(duì)促進(jìn)癌細(xì)胞遷移、侵襲、增殖和癌細(xì)胞新陳代謝發(fā)揮重要作用〔7〕。HSF1通過調(diào)節(jié)Smac激活的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(Caspase)抑制線粒體凋亡途徑，從而促進(jìn)胰腺癌的發(fā)生〔8〕。Ke等〔9〕發(fā)現(xiàn)AMP依賴的蛋白激酶(AMPK)激活的缺失會(huì)放大HSF1的活性，從而促進(jìn)胰腺癌的侵襲和轉(zhuǎn)移。自噬在腫瘤發(fā)生與發(fā)展中逐漸成為癌癥基因靶向治療的一個(gè)新熱點(diǎn)〔10〕。多種基因與自噬的發(fā)生有關(guān)，其中Beclin1是調(diào)節(jié)細(xì)胞自噬中最重要也是最關(guān)鍵的因子之一，HSF1能參與多條信號(hào)通路調(diào)控自噬相關(guān)基因調(diào)節(jié)自噬調(diào)節(jié)腫瘤的發(fā)生和發(fā)展〔11〕，其中對(duì)哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信號(hào)通路是一條關(guān)鍵的通路〔12〕。mTOR同時(shí)影響B(tài)eclin1的表達(dá)，通過與磷脂酰肌醇-3激酶(P13K)形成復(fù)合物來調(diào)控細(xì)胞自噬，這樣形成了由P13K、Beclin1、mTOR和HSF1為相互作用的自噬交互調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，參與癌細(xì)胞正常生理生長(zhǎng)、細(xì)胞周期演進(jìn)和自噬〔13〕。研究HSF1與自噬相關(guān)基因Beclin1的相關(guān)性具有重要意義。

本研究說明，正常胰腺和癌旁組織中HSF1以非激活的形式主要存在于細(xì)胞質(zhì)，而細(xì)胞核中很少，在致癌因素的刺激下，部分HSF1被磷酸化而激活轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核發(fā)揮促進(jìn)腫瘤的作用。HSF1的升高在胰腺癌的發(fā)生和進(jìn)展中起重要作用。HSF1在胰腺癌組織中表達(dá)升高的機(jī)制尚未完全闡明，一般認(rèn)為癌細(xì)胞在致癌因子的作用下，核因子(NF)-κB、MAPK、mTOR等通路激活，促進(jìn)HSF1 mRNA轉(zhuǎn)錄導(dǎo)致蛋白表達(dá)升高〔14〕。HSF1對(duì)惡性腫瘤具有多效性作用，對(duì)DNA修復(fù)、血管生成、代謝、遷移和侵襲及轉(zhuǎn)移中都發(fā)揮作用，還能促進(jìn)局部組織環(huán)境的改變以支持腫瘤發(fā)展。在之前的研究中，Beclin1在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤、肝細(xì)胞癌、食管癌、非小細(xì)胞肺癌、膀胱尿路上皮腫瘤和乳腺癌中檢測(cè)到下調(diào)〔15～20〕，而在結(jié)直腸癌、卵巢癌和胃癌中檢測(cè)到Beclin1上調(diào)〔21～23〕，說明不同癌組織Beclin1表達(dá)與臨床病理特征的相關(guān)性不同。本研究結(jié)果說明，Beclin1在胰腺癌組織中表達(dá)上調(diào)，且Beclin1水平的升高在胰腺癌進(jìn)展中起著重要作用。Beclin1在腫瘤中的作用是自噬和凋亡細(xì)胞死亡途徑復(fù)雜系列相互作用的結(jié)果。本研究結(jié)果說明，HSF1、Beclin1均是影響胰腺癌預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。HSF1高表達(dá)且Beclin1高表達(dá)利于腫瘤生長(zhǎng)，HSF1低表達(dá)且Beclin1低表達(dá)不利用腫瘤生長(zhǎng)。

綜上，HSF1、Beclin1在胰腺癌組織中表達(dá)升高，且兩者之間的表達(dá)呈正相關(guān)，能獨(dú)立或協(xié)同影響胰腺癌的病程進(jìn)展，其具體機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。