張永健 郭學(xué)海 高秀鳳 王斌 趙宏陽 張敬

(開灤總醫(yī)院林西醫(yī)院 1普外科，河北 唐山 063103；2消化內(nèi)科)

原發(fā)性胃癌是常見的胃腸道惡性腫瘤之一，發(fā)病率居我國第2位，死亡率居惡性腫瘤第3位，具有高發(fā)病率和高死亡率的特點(diǎn)〔1,2〕。胃癌的發(fā)病機(jī)制目前尚不明確，大多數(shù)患者在確診時(shí)已屬于胃癌中晚期，治療效果和愈后不佳，因此，胃癌的發(fā)生發(fā)展和浸潤轉(zhuǎn)移機(jī)制的研究對于患者的治療和愈后有重要意義。胃癌主要的治療方式為手術(shù)治療，輔以放化療，早期胃癌患者通過早期手術(shù)可明顯提高治療效果，5年生存率可達(dá)50%以上，但是晚期胃癌往往治療效果不佳，因此早發(fā)現(xiàn)和早治療對于胃癌患者的預(yù)后和減少經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)有重要意義〔3,4〕。目前胃癌臨床領(lǐng)域中缺少公認(rèn)的預(yù)后標(biāo)志物，尤其對于中晚期胃癌患者，一線化療方案的無進(jìn)展生存時(shí)間僅6～9個(gè)月〔5〕。研究發(fā)現(xiàn)惡性腫瘤發(fā)病機(jī)制之一為細(xì)胞周期調(diào)節(jié)紊亂，細(xì)胞S期激酶相關(guān)蛋白(Skp)2是F-box蛋白家族成員之一，在細(xì)胞周期調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用，在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展中有重要意義〔6,7〕。研究發(fā)現(xiàn)Skp2不僅參與降解蛋白酶體，并且與致癌有關(guān)的轉(zhuǎn)錄基因c-myc的泛素化相關(guān)，是目前研究的重點(diǎn)和熱點(diǎn)〔8〕。p27是近年來研究較為熱門的抑制癌癥發(fā)生發(fā)展的調(diào)控基因，p27通過阻止各種細(xì)胞經(jīng)過G1-S期。p27表達(dá)水平低和癌癥的預(yù)后不好和惡性腫瘤的程度是相互有關(guān)系。實(shí)驗(yàn)證明 Skp2蛋白在腫瘤中的表達(dá)及癌癥臨床病理學(xué)行為有密切相關(guān)。Skp2過表達(dá)與許多腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和預(yù)后密切相關(guān)。這些與腫瘤的早期診斷及治療有密切關(guān)系。本研究分析Skp2蛋白在胃癌中的表達(dá)情況，并探討Spk2蛋白與原發(fā)性胃癌預(yù)后的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1一般資料 選擇2017年6月至2018年11月于開灤總醫(yī)院林西醫(yī)院就診的原發(fā)性胃癌患者67例為觀察組，并納入63例病理組織檢查正常非癌性胃黏膜為對照組，觀察組平均年齡(65.46±6.89)歲，男36例，女31例，對照組平均(66.15±7.41)歲，男29例，女34例。收集兩組性別、年齡、病程、病理分期等一般資料。每3個(gè)月通過門診或電話形式進(jìn)行隨訪，末次隨訪時(shí)間2020年1月。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，患者及其家屬同意簽署知情同意書。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)患者確診為原發(fā)性胃癌患者；(2)病理診斷和病理分期明確。(3)患者臨床資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)患者曾接受過化療、放療等抗腫瘤治療；(2)患合并其他系統(tǒng)嚴(yán)重病變者； (3)患者不同意簽署知情同意書。

1.2觀察指標(biāo)

1.2.1試驗(yàn)操作 所有患者取病理組織，所有胃癌組織均在離體30 min內(nèi)切取，置于0.1%焦碳酸二乙酯(DEPC)水處理過的干燥試管中(試管內(nèi)加入RNA保護(hù)液)，然后放入-80℃冰箱中保存。胃癌組織芯片常規(guī)脫蠟并且梯度酒精水化，用3% H2O2覆蓋組織15 min，消化內(nèi)源性過氧化物酶，抗原修復(fù)采用枸櫞酸鹽修復(fù)液在92℃煮15 min，冷卻至室溫；滴加一抗Ezrin，濕盒內(nèi)4℃冰箱過夜，滴加免疫組化試劑PV-9000免疫復(fù)合物，溫箱內(nèi)孵育半小時(shí)，二氨基聯(lián)苯胺(DAB)室溫顯色3～10 min，流水沖洗15 min；蘇木素復(fù)染細(xì)胞核15 s；梯度酒精脫水，樹膠片封片。每一步驟間均用磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗。DAB顯色試劑盒和PV-9000試劑盒及購于北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，所有操作按照說明書嚴(yán)格進(jìn)行操作。

1.2.2結(jié)果判讀〔9〕Skp2蛋白在胃癌組織上皮細(xì)胞的細(xì)胞核呈棕黃色顆粒，隨機(jī)選擇5個(gè)高倍視野(400倍)計(jì)數(shù)陽性細(xì)胞數(shù)，取其平均值作為該例的陽性率，并判定細(xì)胞染色強(qiáng)度。陽性細(xì)胞比例評定標(biāo)準(zhǔn)：>75%為4，51%～75%為3，26%～50%為2，5%～25%為1，<5%為0。染色強(qiáng)度評分標(biāo)準(zhǔn)：棕褐色為3，棕黃色為2，淡黃色為1，無著色為0。兩項(xiàng)結(jié)果相加為標(biāo)記指數(shù)(LI)，并通過LI判斷表達(dá)強(qiáng)度和表達(dá)陽性率。<2為陰性(-)，2～3為弱陽性(+)，4～5為中度陽性()，6～7為強(qiáng)陽性()。陽性率=(弱陽性+中度陽性+強(qiáng)陽性)/總例數(shù)。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS22.0軟件，非正態(tài)分布計(jì)量資料以中位數(shù)表示，正態(tài)分布采用t檢驗(yàn)、χ2檢驗(yàn)，繪制生存曲線，用Kaplan-Meier法計(jì)算，組間比較用Log-Rank 法檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1Skp2蛋白表達(dá)水平比較 觀察組Skp2蛋白表達(dá)陽性率(55.22%，其中強(qiáng)陽性21例，中度陽性10例，弱陽性6例，陰性30例)高于對照組(15.87%，其中強(qiáng)陽性3例，中度陽性4例，弱陽性3例，陰性53例)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=6.781，P<0.05)，見圖1。

圖1 Skp2蛋白在胃癌組織中表達(dá)水平(DAB，×200)

2.2Skp2蛋白表達(dá)水平與臨床資料相關(guān)性 Skp2蛋白表達(dá)陽性患者腫瘤分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況較陰性患者差，TNM分期、腫瘤直徑明顯大于Skp2蛋白表達(dá)陰性患者(P<0.05)，而性別、年齡、病程、浸潤深度無明顯差異(P>0.05)，見表1。

2.3Skp2蛋白陽性表達(dá)的Logistic回歸分析 以Skp2蛋白陽性表達(dá)為因變量，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(有=1，無=0)、TNM分期、分化程度為自變量建立多元回歸模型，結(jié)果顯示淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(OR=1.174，P=0.004)、TNM分期(OR=1.340，P=0.005)、分化程度(OR=1.782，P=0.002)是Skp2蛋白陽性表達(dá)的危險(xiǎn)因素，見表2。

表1 Skp2蛋白表達(dá)水平與原發(fā)性胃癌患者臨床資料相關(guān)性(n)

表2 原發(fā)性胃癌患者Skp2蛋白陽性表達(dá)的Logistic回歸分析

2.4Skp2蛋白表達(dá)與預(yù)后的關(guān)系 Skp2蛋白表達(dá)陽性中位生存時(shí)間為13個(gè)月(95%CI：10.4～16.2個(gè)月)，2年生存率為32.64%；Skp2蛋白表達(dá)陰性中位生存時(shí)間為27個(gè)月(95%CI：22.5～30.8個(gè)月)，2年生存率為68.63%。Kaplan-Meier 生存曲線分析發(fā)現(xiàn)Skp2蛋白表達(dá)陰性生存率明顯高于Skp2蛋白表達(dá)陽性組(P=0.001)，見圖2。

圖2 Skp2蛋白表達(dá)與原發(fā)性胃癌患者預(yù)后的關(guān)系

3 討 論

近年來，隨著診斷和治療水平的提高，胃癌的5年生存率明顯提高，但是在我國胃癌的死亡率占惡性腫瘤的死亡率的1/5左右，是危害人民身體健康和生命安全的主要疾病之一。加強(qiáng)對胃癌發(fā)生發(fā)展的研究，尋找與胃癌相關(guān)的生物學(xué)指標(biāo)，將有助于胃癌的診療〔10,11〕。原發(fā)性胃癌的發(fā)生和發(fā)展使一個(gè)多因素、多階段、多基因共同作用的結(jié)果，細(xì)胞周期調(diào)節(jié)功能異常是細(xì)胞癌變中的一個(gè)重要過程，研究發(fā)現(xiàn)，多種細(xì)胞因子和癌性蛋白在調(diào)節(jié)細(xì)胞周期中起重要作用〔12,13〕。Skp2是由436個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成的蛋白，其基因定位于人的第5號染色體，Skp2通路編碼兩種蛋白質(zhì)，Skp2B蛋白和Skp2蛋白，在正常細(xì)胞中，Skp2蛋白與Skp2B 蛋白表達(dá)可以通過泛素依賴作用抑制p5和Rb通路，，能與S期激酶cyclinA-CDKI相互作用，在G0/G1期表達(dá)較低，在S期表達(dá)相對較高，可通過轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)-β信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路與Smad4 蛋白因子相互作用。當(dāng)基因發(fā)生突變時(shí)，Skp2通過乙?；饔煤头核鼗蕾嚨牡鞍姿馔緩脚cSmad4 蛋白因子的相互結(jié)合加強(qiáng)，通過乙酰化作用和泛素化依賴的蛋白水解途徑進(jìn)一步使導(dǎo)致細(xì)胞調(diào)節(jié)周期紊亂，組織發(fā)生癌變，與腫瘤的發(fā)生發(fā)展和預(yù)后相關(guān)，是目前研究的熱點(diǎn)之一〔14,15〕。

本研究結(jié)果表明，Skp2在胃癌組織中的表達(dá)量明顯高于正常組織。研究發(fā)現(xiàn)〔16〕，Skp2在多種組織中表達(dá)增加，且與不良預(yù)后具有一定的相關(guān)性，不僅可通過泛素化途徑抑制Rb和p53通路，而且能降解抑癌基因p27，從而發(fā)揮調(diào)解細(xì)胞周期和調(diào)控腫瘤臨床病理行為的作用。廖順鴻〔17〕研究發(fā)現(xiàn)，Skp2蛋白在前列腺癌組織中高表達(dá)，而p27蛋白表達(dá)較低，且Skp2蛋白與p27蛋白存在負(fù)相關(guān)性，推測Skp2蛋白與p27蛋白在前列腺癌的發(fā)生和進(jìn)展中發(fā)揮重要作用。劉小輝〔18〕采用組織免疫化學(xué)法發(fā)現(xiàn)Skp2蛋白在結(jié)直腸癌組織中高表達(dá)，且Skp2蛋白的靶標(biāo)是p27，進(jìn)一步證實(shí)了Skp2蛋白與p27蛋白在癌組織中的相關(guān)性。本研究結(jié)果表明，Skp2蛋白表達(dá)水平與腫瘤分化程度和TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況、腫瘤大小相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)〔19〕，癌癥組織的腫瘤分型和大小、癌癥組織、淋巴管轉(zhuǎn)移與Skp2蛋白高表達(dá)相關(guān)，其機(jī)制目前研究尚不明確，猜測可能通過對凋亡的抵抗、潛在高侵襲性和活動(dòng)性、高增殖活性等Skp2蛋白的生物學(xué)改變相關(guān)。孫雅靜〔20〕發(fā)現(xiàn)在霍奇金淋巴瘤患者中Skp2陽性率高時(shí)疾病的惡性程度越高，Skp2陽性程度與病理分級呈正比。郭云霞等〔21〕發(fā)現(xiàn)干擾Skp2表達(dá)后，肝癌細(xì)胞的增殖能力受抑制，細(xì)胞侵襲力下調(diào)，凋亡能力增強(qiáng)，進(jìn)一步證實(shí)Skp2與肝癌細(xì)胞增殖能力，癌癥細(xì)胞的侵襲力相關(guān)。Shapira等〔15〕用免疫組化學(xué)染色法研究28例正常乳腺組織和69例乳腺癌組織中,觀察并比較Skp2在其中的表達(dá)情況，隨后用RT-PCR方法隨機(jī)檢測其中3例乳腺癌組織Skp2的mRNA 表達(dá)，并與其正常的胃黏膜作對比，結(jié)果顯示,Skp2的mRNA 在胃癌組織中的表達(dá)明顯上調(diào)，與正常胃黏膜比較Skp2蛋白陽性表達(dá)率在胃癌中明顯升高,Skp2蛋白陽性表達(dá)率隨著腫瘤的分化程度降低而升高，與本研究結(jié)果一致。

本研究結(jié)果表明，Skp2蛋白表達(dá)陽性組患者中位生存時(shí)間、5年生存率明顯高于Skp2蛋白表達(dá)陰性組，Skp2蛋白對于原發(fā)性胃癌的預(yù)后有一定的價(jià)值，臨床上可通過檢測Skp2蛋白的表達(dá)水平判斷胃癌患者的預(yù)后。吳金訓(xùn)〔22〕對浸潤性宮頸癌患者的研究發(fā)現(xiàn)，Skp2蛋白可能是宮頸癌惡變的重要生物學(xué)標(biāo)記物，與p27蛋白共同參與宮頸癌的發(fā)生發(fā)展，Skp2蛋白表達(dá)陽性患者的5年生存率明顯低于Skp2蛋白表達(dá)陰性患者。

綜上，Skp2蛋白胃癌組織中的表達(dá)水平增加，與腫瘤分化程度和分期、轉(zhuǎn)移情況、腫瘤大小相關(guān)，且Skp2蛋白表達(dá)陰性患者的預(yù)后明顯優(yōu)于Skp2蛋白表達(dá)陽性患者，對判斷患者的預(yù)后有一定的價(jià)值。