張澤乾 劉 虹

（1山西農(nóng)業(yè)大學(xué)，山西太原 030031；2山西農(nóng)業(yè)大學(xué)山西功能食品研究院，山西太原 030031）

大球蓋菇Stropharia rugosoannulataFarl.ex Murrill隸屬于傘菌目Agaricales，球蓋菇科Strophariaceae，球蓋菇屬Stropharia，是一種著名的大型真菌[1]，也是聯(lián)合國糧農(nóng)組織向發(fā)展中國家推薦栽培的食用菌之一，是一種重要的食、藥用真菌。該菌味美色優(yōu)，營養(yǎng)豐富，具有增強(qiáng)人體免疫力、降低血糖等保健及藥用價(jià)值[2-6]。

我國野生球蓋菇資源比較匱乏，從已有發(fā)表的關(guān)于野生球蓋菇的報(bào)道來看，我國發(fā)現(xiàn)的野生球蓋菇主要特征為紅色、黃色或棕色，主要分布于我國臺灣、陜西、內(nèi)蒙古、甘肅、四川、云南等省區(qū)[7-10]。

研究對象為采自山西省太原市婁煩縣云頂山的一株棕黃色野生大球蓋菇，該物種個(gè)體中到大型，肉質(zhì)肥厚。為了開發(fā)利用該野生資源，筆者在形態(tài)特征鑒定的基礎(chǔ)上對其進(jìn)行分子鑒定，并對該菌株進(jìn)行生物學(xué)特性研究，以期為該野生菌株的馴化栽培、開發(fā)利用和后期規(guī)?；耘嗵峁?shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

（1）標(biāo)本：野生球蓋菇菌株（SP1），2020年9月采自山西省婁煩縣云頂山海拔1 680 m（北緯37°52'43″，東經(jīng)111°36' 06″）的櫟樹林草地，樣本新鮮且無病蟲害。組織分離法獲得純菌株，在馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA）上純化后，篩選出菌絲生長旺盛的菌株作為母種，現(xiàn)保存于山西農(nóng)業(yè)大學(xué)山西功能食品研究院，編號HSA361。

（2）母種培養(yǎng)基：馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）粉46 g，蛋白胨3 g，磷酸二氫鉀3 g，硫酸鎂1.5 g，蒸餾水1 000 mL；pH自然。

（3）平板培養(yǎng)基：葡萄糖20 g，蛋白胨3 g，瓊脂粉20 g，磷酸二氫鉀3 g，硫酸鎂1.5 g，維生素B10.03 g，硫酸鐵0.1 g，蒸餾水1 000 mL。

1.2 方法

1.2.1 形態(tài)學(xué)鑒定

以體視顯微鏡和手持放大鏡觀察子實(shí)體宏觀特征，主要包括子實(shí)體、菌蓋和菌柄的形狀、顏色、表面有無鱗片以及菌褶的特征等；光學(xué)顯微鏡下觀察子實(shí)體顯微結(jié)構(gòu)；以蒸餾水或3%KOH 制作水封片，用棉蘭和Melzer 試劑檢驗(yàn)擔(dān)孢子壁是否喜藍(lán)以及淀粉質(zhì)反應(yīng)[11-13]。

1.2.2 分子鑒定

提取目標(biāo)樣本（SP1）DNA，完成PCR 擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增在FTGRAD2D 型PCR 擴(kuò)增儀上進(jìn)行，ITS 測序工作由北京中科希林生物技術(shù)有限責(zé)任公司完成。測序后ITS 基因序列通過BLAST 程序與GenBank 數(shù)據(jù)庫中所收錄的ITS 基因序列進(jìn)行同源性比較核對，結(jié)合形態(tài)學(xué)特征對樣本進(jìn)行鑒定[13-14]。

1.2.3 碳源試驗(yàn)

以平板培養(yǎng)基為對照，分別以相當(dāng)碳量的麥芽糖、果糖、蔗糖、甘露醇代替其中的葡萄糖，培養(yǎng)基按配方制備好后于121.3 ℃，滅菌20 min 后備用。將SP1 供試菌株接種到裝有活化培養(yǎng)基（PDA）培養(yǎng)皿（直徑90 mm）中央，于25 ℃暗培養(yǎng)10～12 d，挑選長勢茁壯一致的菌落，在其邊緣用完全滅菌的打孔器（直徑6 mm）取生長一致的接種塊移至供試碳源培養(yǎng)基培養(yǎng)皿中心，置25 ℃暗培養(yǎng)10 d。按照十字交叉法每隔3 d 用游標(biāo)卡尺測量菌落直徑，計(jì)算菌絲生長速度[15]，每個(gè)處理重復(fù)5 次。同時(shí)觀察菌絲長勢及菌落形態(tài)。

1.2.4 氮源試驗(yàn)

以平板培養(yǎng)基為對照，分別以酵母膏、牛肉膏、麩皮、硫酸銨、尿素代替其中的蛋白胨。每個(gè)處理重復(fù)5次。將試驗(yàn)菌株大小一致的菌種塊接種到上述供試培養(yǎng)基中央，置25 ℃暗培養(yǎng)10 d 后，并觀察菌絲長勢，測定菌絲生長速度。操作方法同碳源試驗(yàn)。

1.2.5 碳氮比試驗(yàn)

以平板培養(yǎng)基中的葡萄糖為碳源，蛋白胨為氮源，碳氮總量23 g，按照5∶1、10∶1、15∶1、20∶1、25∶1的碳氮比設(shè)置5 個(gè)處理，每個(gè)處理重復(fù)5 次。其他操作同碳源試驗(yàn)。

1.2.6 培養(yǎng)溫度試驗(yàn)

將試驗(yàn)菌種接種在平板培養(yǎng)基中，培養(yǎng)溫度設(shè)15 ℃、18 ℃、21 ℃、25 ℃、28 ℃、30 ℃6 個(gè)處理，每個(gè)處理重復(fù)5次。其他操作同碳源試驗(yàn)。

1.2.7 培養(yǎng)基pH試驗(yàn)

在超凈工作臺上用1.0 mol/L NaOH 溶液和1.0 mol/L HCl 溶液調(diào)整PDA 平板培養(yǎng)基酸堿度[16]，共設(shè)pH5、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0 七個(gè)處理，每個(gè)處理重復(fù)5次。其他操作同碳源試驗(yàn)。

1.3 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel 2003、SPSS、LSD 法進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計(jì)分析[17]。

2 結(jié)果與分析

2.1 形態(tài)學(xué)特征

標(biāo)本擔(dān)子果中到大型（圖1）。菌蓋幼時(shí)半球形，成熟后漸平展，幼時(shí)直徑2.5～4.0 cm，成熟后5～12 cm，幼時(shí)灰褐色、褐色或黃褐色，成熟后變?yōu)闇\黃色或黃褐色，表面有褐色鱗片，邊緣有內(nèi)菌幕殘余。菌褶直生至彎生，灰紫色，漸變?yōu)楹稚?、灰褐色，較密，邊緣灰白色。菌肉白色，傷不變色，厚達(dá)2 cm。菌柄中生，長4～10 cm，粗1.2～2.0 cm，圓柱狀，或基部變粗成棒狀，白色，表面有片狀或棉絮狀鱗片，鱗片易脫落以至于成熟后近光滑，早期中實(shí)，后內(nèi)部漸松軟，基部沒有菌索。菌環(huán)常缺，如有為膜質(zhì)或絮狀，位于菌柄中上部。

圖1 喜楊球蓋菇Stropharia populicola生態(tài)照

擔(dān)孢子橢圓形，（5.5～7.5）μm×（3.5～4.5）μm，褐色，表面光滑，具有一個(gè)退化的芽孔。擔(dān)子柱棒狀，（25～30）μm×（10～12.5）μm，4 孢子型，小梗短于1.5μm。 緣 囊 體 大 量，（32.5～50）μm×（12.5～17.5）μm，棒狀至近梭形，頂部有或沒有短凸起，薄壁。子實(shí)層除擔(dān)子外有3 種成分，（1）黃囊體，棒狀或梨形，（27.5～32.5）μm×（7.5～12.5）μm，頂部有或沒有短指狀凸起，薄壁，內(nèi)含黃色無定形物質(zhì)；（2）側(cè)生薄壁囊狀體，罕見，大小為42.5μm×15.0μm，瓶形或近梭形；（3）棘狀類囊體（acanthocyte），具6～13條放射狀刺棘，長47.5μm，基部直徑5μm，厚壁。子實(shí)層菌髓組織菌絲平行排列，菌絲無色，直徑5～10μm。菌蓋皮層組織菌絲無色或淺黃色，薄壁，直徑5.0～7.5μm。菌蓋表面鱗片有成束菌絲聚集而成，菌絲直徑3.5～8.5μm，無色或淡黃色，薄壁。菌肉組織菌絲薄壁，無色，直徑5～15μm。菌柄皮層菌絲平行排列，菌絲無色，薄壁，直徑5～15μm。鎖狀聯(lián)合罕見[18]。

2.2 分子比對結(jié)果

提取的SP1 菌株ITS 和nrLSU 片段在GenBank上比對結(jié)果（表1），來自中國山西省云頂山地區(qū)的野生球蓋菇HSA361 經(jīng)樣本分子比對，結(jié)合形態(tài)學(xué)鑒定可以確定研究物種是喜楊球蓋菇Stropharia populicola[18]。

表1 球蓋菇（SP 1）樣本及其GenBank比對結(jié)果

2.3 供試碳源對球蓋菇（SP1）菌絲生長的影響

碳源是食藥用菌生長所必不可少的營養(yǎng)物質(zhì)[19]。由表2可以看出，供試碳源培養(yǎng)基對球蓋菇（SP1）菌絲的生長勢和生長速度會(huì)產(chǎn)生很大的影響。以葡萄糖為碳源的培養(yǎng)基上菌落呈圓形而完整，菌絲潔白、粗壯、濃密、生長勢強(qiáng)，平均生長速度最快，為2.81 mm/d，顯著快于其他碳源；碳源為甘露醇或麥芽糖表現(xiàn)次之，果糖表現(xiàn)最差，菌絲乳白色、稀疏，生長勢弱，平均生長速度最慢，為1.76 mm/d。

表2 供試碳源對球蓋菇（SP1）菌絲生長的影響

2.4 供試氮源對球蓋菇（SP1）菌絲生長的影響

氮源是食用菌生長的第二大營養(yǎng)[20]。不同的氮源對球蓋菇（SP1）菌絲生長勢、平均生長速度影響顯著（表3）。在以酵母膏為氮源的培養(yǎng)基上，球蓋菇（SP1）的菌絲潔白，菌落形態(tài)橢圓形、完整、濃密、生長勢最強(qiáng)，平均生長速度最快，為2.42 mm/d，對比其他氮源處理差異顯著；氮源為蛋白胨、硫酸銨表現(xiàn)次之；尿素表現(xiàn)最差，菌絲僅在接種塊周圍生長甚至不生長。

表3 供試氮源對球蓋菇（SP1）菌絲生長的影響

2.5 試驗(yàn)培養(yǎng)基碳氮比對球蓋菇（SP1）菌絲生長的影響

由表4可以看出，球蓋菇（SP1）菌絲在碳氮比為5∶1～25∶1 的培養(yǎng)基上均可生長，生長勢和平均長速呈顯著差異。在碳氮比為10∶1 的培養(yǎng)基上菌絲生長勢最強(qiáng)，平均長速最快，為2.71 mm/d，與碳氮比5∶1、15∶1、20∶1、25∶1 差異顯著；其次為碳氮比5∶1和15∶1，二者差異不顯著，但與其他碳氮比菌絲生長速度差異顯著；表現(xiàn)最差的為碳氮比25∶1，菌絲稀疏，生長勢弱，生長速度最慢。

表4 試驗(yàn)培養(yǎng)基碳氮比對球蓋菇（SP1）菌絲生長的影響

2.6 培養(yǎng)溫度對球蓋菇（SP1）菌絲生長的影響

由表5 可以看出，球蓋菇（SP1）的菌絲在15～30 ℃培養(yǎng)均可生長，生長勢和平均長速差異顯著。菌絲生長最適宜的溫度為25 ℃、21 ℃，生長勢最強(qiáng)、平均長速最快，分別為2.58 mm/d和2.55 mm/d，與其他處理差異顯著；當(dāng)培養(yǎng)溫度低于25 ℃時(shí)，菌絲平均長速隨溫度的升高呈逐漸加快的趨勢，且生長勢趨強(qiáng)；當(dāng)培養(yǎng)溫度高于25 ℃時(shí)，菌絲平均長速隨溫度的升高呈逐漸下降的趨勢，且生長勢趨弱。

表5 培養(yǎng)溫度對球蓋菇（SP1）菌絲生長的影響

2.7 培養(yǎng)基pH對球蓋菇（SP1）菌絲生長的影響

由 表6 可 以看出，培 養(yǎng)基pH 5.0～8.0 球 蓋菇（SP1）菌絲均可生長，且隨著pH 的升高，菌絲平均長速呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢，以培養(yǎng)基pH 7.0、pH7.5 菌絲生長表現(xiàn)最好：菌絲生長勢最強(qiáng)，平均長速最快，分別為2.69 mm/d、2.55 mm/d，菌落形態(tài)為橢圓形，形態(tài)完整，濃密，與其他pH 處理菌絲生長差異顯著；pH6.0 及以下或pH 8.0 時(shí)，菌絲生長勢弱，菌絲平均長速顯著下降。

表6 培養(yǎng)基pH對球蓋菇（SP1）菌絲生長的影響

3 小結(jié)

經(jīng)形態(tài)學(xué)和DNA 序列比對，確認(rèn)采自山西省云頂山地區(qū)的野生球蓋菇是喜楊球蓋菇Stropharia populicola。

菌絲培養(yǎng)特性研究結(jié)果，喜楊球蓋菇菌絲生物學(xué)因子與陳永剛等[21-22]研究大球蓋菇的結(jié)果相似，表明喜楊球蓋菇菌絲生長所需主要營養(yǎng)物質(zhì)與大球蓋菇相似。