唐吉旺 袁列江 肖 泳 王淑霞 潘 照 鄧 航

(湖南省產(chǎn)商品質(zhì)量檢驗(yàn)研究院，湖南 長沙 410007)

雙酚A(Bisphenol A，BPA)和壬基酚(Nonylphenol，NP)是一類典型的酚類環(huán)境雌激素，具有雌激素效應(yīng)和慢性毒效應(yīng)[1-2]，常見于食品包裝材料、容器內(nèi)壁涂料及阻燃劑、抗氧化劑、黏合劑等精細(xì)化工產(chǎn)品中[3]。雙酚A和壬基酚可以由食品接觸材料遷移進(jìn)入食品中，成為一種內(nèi)分泌干擾物質(zhì)對人體癌細(xì)胞生長及生殖能力產(chǎn)生嚴(yán)重影響[4]，因此被列入歐盟優(yōu)先控制污染物質(zhì)名錄。GB 9685—2016中規(guī)定：食品接觸塑料材料及制品、食品接觸用涂料和涂層、食品接觸材料及制品用黏合劑中雙酚和壬基酚的特定遷移限量(SML)分別為0.6 mg/kg和不得檢出(方法規(guī)定檢出限為0.01 mg/kg)，其中雙酚A不得用于生產(chǎn)嬰幼兒專用接觸材料及制品。

常見的壬基酚和雙酚A的檢測方法有酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)[5]、熒光檢測法[6]、膠體金免疫層析法(ICA)[7]、液相色譜法(LC)[8-10]、氣相色譜—質(zhì)譜法(GC/MS)[11-12]及高效液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜法(HPLC-MS/MS)[13-15]等。高效液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜法因具有高通量、高靈敏度及高效率的特點(diǎn)被廣泛應(yīng)用于有機(jī)物的檢測。研究擬通過優(yōu)化樣品前處理方法及固相萃取凈化條件，開發(fā)基于固相萃取的高效液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜法測定食品接觸包裝材料中的雙酚A和壬基酚的檢測方法，以期為食品接觸材料中雙酚A和壬基酚的監(jiān)測提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

正己烷、甲醇、丙酮、乙酸乙酯、四氫呋喃及二氯甲烷：色譜純，上海安譜科學(xué)儀器有限公司；

4-n-壬基酚標(biāo)準(zhǔn)品(純度99.7%)、雙酚A標(biāo)準(zhǔn)品(純度99.7%)及雙酚A-D4標(biāo)準(zhǔn)品：德國Dr.Ehrenstorfer公司；

壬基酚-13C6：A chemTek公司；

高效液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜儀：QTRAP 5500型，美國SCIEX公司；

超聲儀：YQ-1007A型，上海易凈超聲波儀器有限公司；

離心機(jī)：Allegra 64R型，美國貝克曼公司；

試管振蕩器：STD VORTEX Mixer型，美國Talboys公司；

超純水儀：Milli-Q型，美國Millipore公司；

硅膠固相萃取柱：Agela型(1 g, 6 mL)，天津博納艾杰爾科技有限公司。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

分別稱取適量的雙酚A、4-n-壬基酚、雙酚A-D4及壬基酚-13C6標(biāo)準(zhǔn)品，用甲醇溶解配制成質(zhì)量濃度均為1.0 mg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，于-18 ℃冰箱密封保存。移取適量各標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，用甲醇配制成質(zhì)量濃度均為10.0 mg/L 的混合標(biāo)準(zhǔn)中間液和混合內(nèi)標(biāo)中間溶液。移取不同體積的混合標(biāo)準(zhǔn)中間液，用甲醇配制成質(zhì)量濃度分別為1，2，5，10，20，50，100，200 μg/L的系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作液，內(nèi)標(biāo)的質(zhì)量濃度均為50 μg/L。

1.3 樣品處理

1.3.1 樣品提取 將樣品剪碎成細(xì)小片狀，稱取0.2 g(精確至0.001 g)樣品于10 mL具蓋玻璃試管中，加入10 mL二氯甲烷，渦旋振蕩1 min，超聲提取60 min。提取液轉(zhuǎn)移至另一10 mL具蓋玻璃試管中，在35 ℃以下氮吹濃縮至約1.0 mL，用正己烷定容，蓋上塞子，渦旋振蕩混勻。

1.3.2 樣品凈化 將以上提取溶液全部轉(zhuǎn)移至經(jīng)6 mL甲醇和6 mL正己烷活化過的硅膠固相萃取柱中。待樣品溶液流完后用5 mL正己烷淋洗，棄去淋洗液并將柱子抽干。用5 mL正己烷+乙酸乙酯(V正己烷∶V乙酸乙酯=7∶3)溶液洗脫，收集全部流出液，準(zhǔn)確加入50 μL混合內(nèi)標(biāo)使用液，渦旋振蕩混勻后在35 ℃下氮吹濃縮至近干，準(zhǔn)確加入1.0 mL甲醇，渦旋振蕩1 min，以充分溶解殘?jiān)?，試液?jīng)0.22 μm有機(jī)濾膜過濾后供高效液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜測定。

1.4 儀器條件

1.4.1 色譜條件 Venusil MP C18(2)色譜柱(100 mm×2.1 mm，2.6 μm)，柱溫30 ℃；流動(dòng)相A為0.1%氨水溶液，流動(dòng)相B為甲醇，流速0.3 mL/min；進(jìn)樣量10 μL；梯度洗脫程序見表1。

表1 流動(dòng)相梯度洗脫程序

1.4.2 質(zhì)譜條件 電噴霧離子源(ESI)；離子源溫度500 ℃；負(fù)離子掃描；噴霧電壓4 500 V；氣簾氣壓力0.24 MPa；噴霧氣(Gas1)流速55 μL/min；輔助加熱氣(Gas2)55 μL/min；多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)模式。

2 結(jié)果與討論

2.1 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

酚類環(huán)境雌激素具有酚羥基化學(xué)電離的性質(zhì)，容易失去H+，因此，采用負(fù)離子模式掃描，以針泵連續(xù)流動(dòng)進(jìn)樣，進(jìn)行一級質(zhì)譜掃描，得到各個(gè)化合物對應(yīng)的母離子[M-H]-，然后分別對其進(jìn)行子離子全掃描，找出兩個(gè)響應(yīng)強(qiáng)度較高的子離子并與其母離子組成兩對離子對，優(yōu)化碰撞能量(CV)及去簇電壓(DP)，得到的雙酚A、4-n-壬基酚及內(nèi)標(biāo)雙酚A-D4和壬基酚-13C6最優(yōu)質(zhì)譜參數(shù)見表2。

表2 雙酚A、4-n-壬基酚及其內(nèi)標(biāo)的多反應(yīng)質(zhì)譜參數(shù)?

2.2 色譜條件的優(yōu)化

2.2.1 色譜柱的選擇 選用Venusi?AS-T C18、Hypersil GOLD、Phenomenex Knietex?F5、Venusil MP C18(2)4款柱子進(jìn)行測試，試驗(yàn)結(jié)果表明雙酚A、4-n-壬基酚及其內(nèi)標(biāo)在Venusil MP C18(2)柱上具有較好的峰形、響應(yīng)及分離度，因此選擇Venusil MP C18(2)作為分析柱。

2.2.2 流動(dòng)相的優(yōu)化 對比了甲醇—水、乙腈—水、甲醇—0.1%氨水、乙腈—0.1%氨水、甲醇—5 mmol乙酸銨含0.1%乙酸、乙腈—5mmol乙酸銨含0.1%乙酸6種不同流動(dòng)相體系下的目標(biāo)物的色譜圖強(qiáng)度、峰形及分離效果，試驗(yàn)結(jié)果表明，雙酚A、4-n-壬基酚及其內(nèi)標(biāo)在甲醇—水流動(dòng)相體系中的響應(yīng)值要高于其在相應(yīng)的乙腈—水中的(約為2～3倍)；當(dāng)流動(dòng)相為甲醇—0.1%氨水時(shí)，雙酚A、4-n-壬基酚及其內(nèi)標(biāo)的響應(yīng)值比其在甲醇—水中的大2～3倍；而當(dāng)流動(dòng)相為甲醇—5 mmol乙酸銨含0.1%乙酸時(shí)，雙酚A、4-n-壬基酚及其內(nèi)標(biāo)的響應(yīng)值相比其在甲醇—水中的有所下降。經(jīng)分析，這是由于雙酚A、4-n-壬基酚及其內(nèi)標(biāo)中的羥基能夠電離出氫離子而呈現(xiàn)出一定的弱酸性，流動(dòng)相體系加入一定量的氨水(呈弱堿性)能夠促進(jìn)待測目標(biāo)化合物電離，提高其離子化效率；加入一定量的乙酸銨含0.1%乙酸反而抑制了待測目標(biāo)化合物電離，導(dǎo)致其離子化效率降低。因此，最終確定甲醇—0.1%氨水為流動(dòng)相。

2.3 提取方式及提取溶劑的選擇

以二氯甲烷為提取溶劑，分別采取超聲提取、振蕩提取、快速溶劑萃取及索氏提取等不同提取方式對同時(shí)含有雙酚A和4-n-壬基酚的陽性樣品進(jìn)行提取，結(jié)果見圖1。由圖1可知，超聲提取效果與快速溶劑萃取及索氏提取效果相當(dāng)且均優(yōu)于振蕩提取。采用快速溶劑萃取時(shí)，由于受快速溶劑提取儀塑料管道的影響，空白對照本底中含有少量的壬基酚，易干擾樣品的測定；索氏提取耗時(shí)長，有機(jī)溶劑消耗量大，不環(huán)保，且不利于批量處理，前處理效率較低；超聲提取操作簡單易于批量處理，且提取效果較好。因此，選擇采用超聲提取方式對樣品進(jìn)行提取。

圖1 提取方式對雙酚A和4-n-壬基酚提取量的影響

分別用甲醇、無水乙醇、丙酮、乙酸乙酯、二氯甲烷、環(huán)己烷及正己烷7種溶劑對同時(shí)含有雙酚A和4-n-壬基酚的陽性樣品進(jìn)行超聲提取。用高效液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜測定不同提取溶劑中雙酚A和4-n-壬基酚的含量，檢測結(jié)果如圖2所示。由圖2可知，以二氯甲烷作為提取溶劑時(shí)，所測定樣品中雙酚A的含量最高，4-n-壬基酚的含量與以甲醇及乙酸乙酯為提取溶劑時(shí)的相當(dāng)。因此，選擇二氯甲烷作為提取溶劑。

圖2 提取溶劑對雙酚A和4-n-壬基酚提取量的影響

2.4 凈化條件的優(yōu)化

2.4.1 固相萃取柱的選擇 考慮到待測目標(biāo)物雙酚A和4-n-壬基酚化合物中含有極性較大的官能團(tuán)，因此選擇具有極性固定相的萃取柱?？疾炝斯枘z柱、氨基柱、氟羅里硅土柱及中性氧化鋁4種極性固相萃取柱的回收率?；罨軇┚鶠楸驼和椋蠘尤芤壕鶠?00 μg/L雙酚A和4-n-壬基酚的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液[以正己烷+二氯甲烷(V正己烷∶V二氯甲烷=9∶1)為溶劑]，淋洗溶劑均為正己烷，洗脫溶劑均為正己烷+丙酮(V正己烷∶V丙酮=7∶3)，上柱體積均為5 mL。試驗(yàn)結(jié)果(如圖3所示)表明，雙酚A和4-n-壬基酚在硅膠柱上的回收率高于其在氨基柱、氟羅里硅土柱和中性氧化鋁上的，因此選擇硅膠固相萃取柱進(jìn)行凈化處理。

圖3 固相萃取柱對雙酚A和4-n-壬基酚回收率的影響

2.4.2 活化溶劑的選擇 硅膠多孔性的硅氧烷交鏈骨架表面含有很多硅醇基基團(tuán)，這些基團(tuán)能夠通過氫鍵與水分子連接導(dǎo)致其吸附性能降低。因此，活化的第一個(gè)目的是為了除去硅膠柱的水分，充分釋放硅膠表面的硅醇基，提高其吸附性能。試驗(yàn)對比了丙酮和甲醇兩種極性較強(qiáng)溶劑的活化效果。由于丙酮溶解色素的能力較強(qiáng)，采用丙酮活化時(shí)，不利于樣品中色素在硅膠柱上的保留；而采用甲醇活化時(shí)既能達(dá)到活化的目的又有利于樣品中色素在硅膠柱上的保留。因此，選用甲醇作為第一活化溶劑。經(jīng)6 mL甲醇活化后，再用6 mL正己烷進(jìn)行活化，其目的是建立一個(gè)非極性的基質(zhì)環(huán)境以增強(qiáng)吸附劑和目標(biāo)化合物之間的極性作用力。

2.4.3 樣品溶劑及淋洗溶劑的選擇 由于硅膠填料具有一定的極性，非極性的樣品溶劑中不含有與其形成氫鍵的官能團(tuán)，可以避免與填料產(chǎn)生對目標(biāo)化合物的競爭性吸附。因此，選用極性相對較小的正己烷作為樣品溶劑。以極性較大的二氯甲烷作為樣品提取溶劑，使用前需將其濃縮至近1 mL，再用正己烷定容至10 mL，相當(dāng)于樣品溶劑為正己烷+二氯甲烷(V正己烷∶V二氯甲烷=9∶1)溶液。試驗(yàn)過程中沒有將樣品提取溶劑二氯甲烷全部揮發(fā)干，主要是基于以下兩方面考慮：① 全部揮發(fā)干會(huì)導(dǎo)致目標(biāo)物的損失且增加濃縮時(shí)間；② 保留1 mL二氯甲烷更有利于后續(xù)樣品加標(biāo)處理，因?yàn)闃?biāo)準(zhǔn)物質(zhì)溶劑為甲醇，容易與二氯甲烷混溶，但不能溶于純正己烷。

為了確保目標(biāo)物全部保留在固相萃取柱中，且盡可能除去其他干擾物，淋洗溶劑的極性不能太大，試驗(yàn)證明以正己烷作為淋洗溶劑能夠確保目標(biāo)物不被洗脫，同時(shí)還能除去一些干擾物質(zhì)。因此，選擇正己烷作為淋洗溶劑。

2.4.4 洗脫溶劑的選擇 考察了四氫呋喃、二氯甲烷+四氫呋喃(V二氯甲烷∶V四氫呋喃=8∶2)、正己烷+四氫呋喃(V正己烷∶V四氫呋喃=9∶1)、二氯甲烷、二氯甲烷+乙酸乙酯(V二氯甲烷∶V乙酸乙酯=9∶1)、正己烷+甲醇(V正己烷∶V甲醇=9∶1)、正己烷+丙酮(V正己烷∶V丙酮=9∶1)、乙酸乙酯、正己烷+乙酸乙酯(V正己烷∶V乙酸乙酯=7∶3)、正己烷+乙酸乙酯(V正己烷∶V乙酸乙酯=6∶4)及正己烷+乙酸乙酯(V正己烷∶V乙酸乙酯=5∶5)11種溶劑的洗脫效果。洗脫效果主要是從兩方面進(jìn)行考察，① 洗脫目標(biāo)物的回收率；② 洗脫后樣品中的色素是否能夠盡可能保留在硅膠固相萃取柱中而與目標(biāo)物進(jìn)行分離。試驗(yàn)結(jié)果表明，除正己烷+乙酸乙酯(V正己烷∶V乙酸乙酯=7∶3)外，其余洗脫劑均能夠?qū)悠分械纳叵疵撓聛恚_(dá)不到理想的洗脫效果。以正己烷+乙酸乙酯(V正己烷∶V乙酸乙酯=7∶3)作為洗脫溶劑時(shí)，樣品中的色素基本上能夠保留在硅膠中，且雙酚A和4-n-壬基酚的洗脫回收率均在90%以上。

2.5 方法學(xué)驗(yàn)證

2.5.1 方法的線性范圍、檢出限及定量限 采用內(nèi)標(biāo)法進(jìn)行定量，以各待測目標(biāo)物和其內(nèi)標(biāo)物的峰面積比值y和質(zhì)量濃度比值x繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，考察雙酚A和4-n-壬基酚的線性關(guān)系。由表3可知，雙酚A和4-n-壬基酚在1～200 μg/L 范圍內(nèi)線性良好，相關(guān)性系數(shù)(R)>0.999。在凈化后的空白基質(zhì)樣品溶液中添加雙酚A和4-n-壬基酚標(biāo)準(zhǔn)溶液并對其進(jìn)行測定，分別以定量離子的3倍信噪比(S/N=3)和10倍信噪比(S/N=10)確定該方法的檢測限(LOD)為0.5 μg/kg和定量限(LOQ)為1.0 μg/kg。

表3 雙酚A和4-n-壬基酚的線性方程、線性范圍、相關(guān)系數(shù)、檢出限及定量限

2.5.2 方法的準(zhǔn)確度和精密度 雙酚A和4-n-壬基酚的加標(biāo)水平均為1.0，10.0，200.0 μg/kg，每個(gè)水平重復(fù)測定6次，對方法的準(zhǔn)確度和精密度進(jìn)行考察，結(jié)果見表4。結(jié)果表明，雙酚A和4-n-壬基酚平均回收率在89.2%～101.2%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為3.1%～6.2%。

表4 食品包裝材料中雙酚A和4-n-壬基酚的平均添加回收率及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差

2.6 實(shí)際樣品的測定

運(yùn)用建立的方法對市售30個(gè)食品塑料包裝材料中的雙酚A和4-n-壬基酚含量進(jìn)行測定，樣品包括蛋糕袋、牛奶袋、三明治餅干袋及麻辣熟食袋等常見的食品塑料包裝材料。結(jié)果表明，5個(gè)樣品檢出雙酚A，含量在5.25～190.25 μg/kg；10個(gè)樣品檢出4-n-壬基酚，含量在6.81～987.13 μg/kg。

3 結(jié)論

研究建立了一種基于固相萃取的高效液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜法的食品包裝材料中雙酚A和壬基酚含量檢測方法。對樣品提取和凈化方式進(jìn)行了優(yōu)化，解決了樣品提取效率低、凈化效果差的問題。該方法準(zhǔn)確、高效，可應(yīng)用于食品塑料包裝材料中雙酚A和壬基酚的檢測。