李文綺，李自芹，賈文婷

（1. 石河子質(zhì)量與計(jì)量檢測(cè)所，新疆石河子 832000；2. 新疆農(nóng)墾科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，新疆石河子 832000）

0 引言

沙門(mén)氏菌、金黃色葡萄球菌、單核細(xì)胞增生李斯特氏菌廣泛分布于自然界中，極易污染空氣、水源、食物等，均是引起細(xì)菌性食物中毒的病原菌，也是人獸共患病原菌，可導(dǎo)致人和動(dòng)物的多種疾病，嚴(yán)重危害人體的健康[1-3]。我國(guó)GB 29921—2021《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 預(yù)包裝食品中致病菌限量》[4]和GB 31607—2021《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 散裝即食食品中致病菌限量》[5]均要求：涉及食品生產(chǎn)加工環(huán)節(jié)、經(jīng)營(yíng)銷售環(huán)節(jié)，都應(yīng)采取相應(yīng)措施降低食品中致病菌的含量。其中，GB 29921—2021 涉及的13 類食品，5 類中規(guī)定了單核細(xì)胞增生李斯特氏菌的限量、8 類中規(guī)定了金黃色葡萄球菌的限量、13 類中規(guī)定了沙門(mén)氏菌的限量[4]；GB 31607—2021 涉及的3 類散裝食品，1 類中規(guī)定了單核細(xì)胞增生李斯特氏菌的限量、3 類中均規(guī)定了沙門(mén)氏菌和金黃色葡萄球菌的限量[5]。由此可見(jiàn)，這幾類致病菌分布之廣，尤其是沙門(mén)氏菌，居所有致病菌首位，具有極大的安全隱患。

菌落總數(shù)和大腸菌群是國(guó)內(nèi)外通用的食品污染常用指示菌，是評(píng)價(jià)食品衛(wèi)生狀況的重要指標(biāo)，長(zhǎng)期食用菌落總數(shù)和大腸菌群超標(biāo)的食物會(huì)危害人體健康[6-7]，故各地監(jiān)管部門(mén)將其列為食品安全監(jiān)控的常規(guī)項(xiàng)目。

因此，對(duì)上述微生物的準(zhǔn)確檢測(cè)具有重要的意義。能力驗(yàn)證是體現(xiàn)實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)能力和實(shí)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制的有效手段，尤其是在微生物檢驗(yàn)中。因此，本機(jī)構(gòu)每年申請(qǐng)參加一定數(shù)量的微生物能力驗(yàn)證活動(dòng)，現(xiàn)將2019—2021 連續(xù)3 年的能力驗(yàn)證情況報(bào)告如下，以期給同類檢測(cè)機(jī)構(gòu)一些參考和指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 測(cè)試樣品

連續(xù)3 年能力驗(yàn)證測(cè)試樣品見(jiàn)表1。

表1 連續(xù)3 年能力驗(yàn)證測(cè)試樣品

1.2 儀器與試劑

儀器：JE3002 型電子天平（0.01 g），上海浦春計(jì)量?jī)x器有限公司產(chǎn)品；DZKW-D-6 型電熱恒溫水浴鍋，北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司產(chǎn)品；Tal boys 型旋渦混合器，美國(guó)公司產(chǎn)品；PHS-3C 型酸度計(jì)，上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司產(chǎn)品；YXQ-LS-50S Ⅱ型和YXQ-LS-70A 型立式壓力蒸汽滅菌器（2 臺(tái)）、BSC-1300 ⅡA-B3 型生物安全柜、SPX-150B-Z 型生化培養(yǎng)箱、3 臺(tái)BSP-150 型生化培養(yǎng)箱（滅菌鍋、生物安全柜和培養(yǎng)箱），上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠產(chǎn)品；OLYMPUS BX41 型生物顯微鏡，日本奧林巴斯株式會(huì)社產(chǎn)品。

試劑：0.85%的無(wú)菌生理鹽水（氯化鈉AR），天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司提供；緩沖蛋白胨水（BPW），廣東環(huán)凱微生物科技有限公司提供。

微生物能力驗(yàn)證測(cè)項(xiàng)目所需試劑見(jiàn)表2。

表2 微生物能力驗(yàn)證測(cè)項(xiàng)目所需試劑

1.3 檢驗(yàn)方法

依據(jù)GB 4789 規(guī)定的相關(guān)微生物項(xiàng)目和測(cè)試試樣附帶的參試指導(dǎo)書(shū)的要求進(jìn)行檢測(cè)。

能力驗(yàn)證測(cè)試樣品檢驗(yàn)方法見(jiàn)表3。

表3 能力驗(yàn)證測(cè)試樣品檢驗(yàn)方法

1.4 檢驗(yàn)步驟

測(cè)試樣品的前處理均嚴(yán)格按照附帶的參試指導(dǎo)書(shū)進(jìn)行，每個(gè)試驗(yàn)做3 組空白對(duì)照（無(wú)菌室和生物安全柜環(huán)境監(jiān)測(cè)、生理鹽水空白對(duì)照、培養(yǎng)基空白對(duì)照） 各2 個(gè)平皿。

1.4.1 沙門(mén)氏菌檢測(cè)

從制備的樣品原液中取25 mL，加入到225 mL BPW 中，充分渦旋混勻，于36 ℃條件下培養(yǎng)16 h后，分別取1 mL 樣品勻液接種于10 mL 的TTB 增菌液和10 mL 的SC 增菌液中，將TTB 增菌液于42 ℃、SC 于36 ℃下培養(yǎng)23 h 后，分別劃線轉(zhuǎn)種BS 平板（36 ℃培養(yǎng)47 h） 和沙門(mén)顯色平板（36 ℃培養(yǎng)23 h）后挑取典型的菌落進(jìn)行生化鑒定。

1.4.2 金黃色葡萄球菌檢測(cè)

從制備的樣品原液中取25 mL，加入到0.85%滅菌鹽水225 mL 中，旋渦混勻，制成10-1的樣品勻液，再吸取10-1的樣品勻液1 mL，加入到生理鹽水9 mL 中，重復(fù)上述操作，逐級(jí)稀釋成10 倍系列梯度的樣品勻液。每個(gè)稀釋度分別取0.3 mL，0.3 mL，0.4 mL 涂布3 塊BP 平板，于36 ℃條件下培養(yǎng)46 h，詳細(xì)記錄每個(gè)平板的菌落數(shù)。挑選典型的菌落分別做染色鏡檢和血凝試驗(yàn)；同時(shí)劃線接種血平板（于36 ℃下培養(yǎng)22 h） 后觀察菌落形態(tài)。

1.4.3 菌落總數(shù)檢測(cè)

從制備的樣品原液中取25 mL，加入到0.85%滅菌鹽水225 mL 中，旋渦混勻，依次制作10-1~10-8的樣品勻液，每個(gè)稀釋梯度（包括樣品原液） 各取1 mL樣液加入到平皿內(nèi)（不少于2 個(gè)平皿）。及時(shí)取瓊脂培養(yǎng)基18~20 mL 傾注平皿，充分混勻，待瓊脂凝固后再覆蓋一層約4 mL 培養(yǎng)基（防止菌落蔓延、造成計(jì)數(shù)不準(zhǔn)）。待完全凝固后，將培養(yǎng)皿倒置于36 ℃生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)46 h，選擇典型的菌落計(jì)數(shù)。

1.4.4 單核細(xì)胞增生李斯特氏菌檢測(cè)

取25 g 制備的樣品，加入到225 mL 的LB1 增菌液中混均勻，于30 ℃下培養(yǎng)23 h 后，吸取0.1 mL 轉(zhuǎn)種于10 mL 的LB2 增菌液中，置于30 ℃下培養(yǎng)20 h，取培養(yǎng)液畫(huà)線接種顯色平板和PALCAM 平板，36 ℃培養(yǎng)28 h，挑取可疑菌落接種木糖和鼠李糖發(fā)酵管，同時(shí)畫(huà)線接種TSA-YE 平板，均于36 ℃下培養(yǎng)20 h后，選擇木糖-、鼠李糖+的純培養(yǎng)物繼續(xù)進(jìn)行生化鑒定。

1.4.5 大腸菌群檢測(cè)

從制備的樣品原液中取25 mL，置于0.85%滅菌生理鹽225 mL 水中，旋渦混勻，依次制作10-1~10-6的樣品勻液，每個(gè)稀釋梯度（包括樣品原液） 各取1 mL 樣液加入到平皿內(nèi)（不少于2 個(gè)平皿）。及時(shí)取瓊脂VRBA 18~20 mL 傾注平皿，充分混勻，同2.4.3進(jìn)行覆蓋。待完全凝固后，將平皿倒置于36 ℃生化培養(yǎng)箱培養(yǎng)45 h，選擇典型的菌落計(jì)數(shù)。同時(shí)接種BGLB 管，于36 ℃條件下培養(yǎng)36 h，產(chǎn)氣的肉湯管對(duì)應(yīng)大腸菌群陽(yáng)性。

2 結(jié)果與分析

3 組空白對(duì)照均無(wú)菌落生長(zhǎng)。

2.1 沙門(mén)氏菌

2 個(gè)樣在BS 平板和顯色平板上均有可疑菌落生長(zhǎng)，各挑取2 個(gè)可疑菌落進(jìn)行生化鑒定。

沙門(mén)氏菌生化鑒定檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 沙門(mén)氏菌生化鑒定檢測(cè)結(jié)果

2.2 金黃色葡萄球菌

BP 平板和血平板上均有可疑菌落生長(zhǎng)，詳細(xì)記錄每個(gè)梯度的菌落數(shù)，同時(shí)從BP 平板挑取10 個(gè)可疑菌落進(jìn)行鑒定，染色鏡檢、血平板培養(yǎng)、BHI 培養(yǎng)、血漿凝固酶試驗(yàn)均為陽(yáng)性。

金黃色葡萄球菌檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表5。

表5 金黃色葡萄球菌檢測(cè)結(jié)果

2.3 菌落總數(shù)（2020 年和2021 年）

2020 年2 個(gè)樣品的結(jié)果均偏小。2021 年2 個(gè)樣品的結(jié)果均為滿意。

連續(xù)2 年的樣品菌落總數(shù)檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表6。

表6 連續(xù)2 年的樣品菌落總數(shù)檢測(cè)結(jié)果

2.4 單核細(xì)胞增生李斯特氏菌

20-P928 樣在PALCAM 平板上有小的灰綠色圓形菌落生長(zhǎng)，在李斯特菌顯色平板上有大的乳白色菌落生長(zhǎng)，挑取純培養(yǎng)的2 個(gè)可疑菌落進(jìn)行鑒定。20-E866 樣在PALCAM 平板和李斯特菌顯色平板上，均無(wú)菌落生長(zhǎng)。

單核細(xì)胞增生李斯氏菌特檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表7。

表7 單核細(xì)胞增生李斯氏菌特檢測(cè)結(jié)果

2.5 大腸菌群

選取15~150 CFU 的平板計(jì)數(shù)紫紅色的典型菌落，20-J492 樣10-3稀釋度平板上10 個(gè)菌落均產(chǎn)氣；20-L017 樣10-1稀釋度平板上10 個(gè)菌落均產(chǎn)氣，進(jìn)行大腸菌群檢測(cè)。

大腸菌群檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表8。

表8 大腸菌群檢測(cè)結(jié)果

3 結(jié)論與討論

實(shí)驗(yàn)室參加的5 項(xiàng)能力驗(yàn)證結(jié)果評(píng)價(jià)均為滿意，其中菌落總數(shù)首次結(jié)果不滿意，2020 年的2 個(gè)樣品的檢測(cè)結(jié)果均偏小，經(jīng)過(guò)分析，主要存在3 個(gè)方面的原因：一是倒平板時(shí)未進(jìn)行覆蓋，菌落生長(zhǎng)過(guò)程中出現(xiàn)蔓延，導(dǎo)致計(jì)數(shù)出現(xiàn)誤差；二是對(duì)蔓延的菌落計(jì)數(shù)不規(guī)范，造成數(shù)值偏??；三是對(duì)標(biāo)準(zhǔn)理解不透，選取了菌落數(shù)在30~300 CFU 范圍蔓延生長(zhǎng)的平板進(jìn)行計(jì)數(shù)，導(dǎo)致計(jì)算公式選用錯(cuò)誤，結(jié)果偏低。針對(duì)以上原因，立即采取了糾正措施，該項(xiàng)目通過(guò)再次參加能力驗(yàn)證取得了滿意的結(jié)果。

實(shí)驗(yàn)室通過(guò)對(duì)2019—2021 年參加的微生物能力驗(yàn)證項(xiàng)目進(jìn)行分析，總結(jié)出如下注意事項(xiàng)和質(zhì)控點(diǎn)，供相關(guān)的微生物實(shí)驗(yàn)室參考。

3.1 樣品接受、制備、稀釋環(huán)節(jié)

（1） 樣品接受。實(shí)驗(yàn)室應(yīng)隨時(shí)關(guān)注樣品寄送情況，及時(shí)接受。接到樣品后，首先應(yīng)檢查樣品性狀和包裝情況，確認(rèn)樣品無(wú)異樣后方可開(kāi)展檢驗(yàn)。若不能立即檢測(cè)，應(yīng)嚴(yán)格按照參試指導(dǎo)書(shū)要求的環(huán)境溫度先行保存，防止樣品中原有微生物的狀況發(fā)生變化[13]。

（2） 樣品制備。樣品制備應(yīng)嚴(yán)格依據(jù)隨樣參試指導(dǎo)書(shū)的要求進(jìn)行，尤其是定量檢驗(yàn)的微生物項(xiàng)目，西林瓶中的樣品是一個(gè)不可分割的整體，應(yīng)確保盡可能充分地轉(zhuǎn)移到稀釋液中。

（3） 樣品稀釋。能力驗(yàn)證的樣品復(fù)雜多樣，無(wú)法預(yù)估其污染的狀況，樣品稀釋過(guò)程盡可能多制備幾個(gè)稀釋梯度，一般不少于6 個(gè)，且每步操作均應(yīng)量取準(zhǔn)確。

3.2 菌落培養(yǎng)、分離、挑取環(huán)節(jié)

無(wú)論是定性檢驗(yàn)還是定量檢驗(yàn)，增菌、分離和純化培養(yǎng)的步驟尤其重要。選擇實(shí)驗(yàn)室常用的增菌液和特異性分離培養(yǎng)基有助于目標(biāo)菌的檢出和計(jì)數(shù)。分離培養(yǎng)時(shí)建議使用多種培養(yǎng)基雙重選擇，對(duì)菌落形態(tài)典型、顯色的選擇培養(yǎng)基優(yōu)先選用，以便有效地分離到目標(biāo)菌。平板劃線應(yīng)盡可能地分離出單個(gè)菌落，定性項(xiàng)目的生化試驗(yàn)和血清學(xué)試驗(yàn)選擇營(yíng)養(yǎng)瓊脂上純培養(yǎng)的細(xì)菌進(jìn)行，定量項(xiàng)目在計(jì)數(shù)時(shí)應(yīng)詳細(xì)記錄典型的菌落數(shù)，進(jìn)行后續(xù)鑒定時(shí)，應(yīng)盡可能多地挑取可疑菌落，以確保取到目標(biāo)菌，防止挑取的全部是雜菌而造成假陰性的結(jié)果。

3.3 結(jié)果分析、處理、報(bào)告環(huán)節(jié)

試驗(yàn)操作過(guò)程的每一步結(jié)果均應(yīng)詳細(xì)記錄下來(lái)，方便出現(xiàn)問(wèn)題時(shí)查找原因、采取糾正措施。定性檢驗(yàn)項(xiàng)目要嚴(yán)格依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的鑒定方法進(jìn)行，不能減少步驟，除了常規(guī)的生化鑒定，還應(yīng)配合對(duì)應(yīng)微生物的特征反應(yīng)進(jìn)行染色鏡檢、血清學(xué)鑒定、血漿凝固酶試驗(yàn)、溶血試驗(yàn)等，綜合多重鑒定結(jié)果，確認(rèn)無(wú)誤后報(bào)告樣品中檢出或未檢出目標(biāo)菌。定量檢驗(yàn)項(xiàng)目中典型菌落計(jì)數(shù)和確認(rèn)是關(guān)鍵所在，國(guó)標(biāo)中規(guī)定的培養(yǎng)時(shí)間一般是最長(zhǎng)生長(zhǎng)時(shí)間，試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)很多微生物菌落通常在規(guī)定的培養(yǎng)時(shí)間之前已能明顯計(jì)數(shù)，針對(duì)這種情況，應(yīng)隔一段時(shí)間觀察菌落的生長(zhǎng)情況，并做好記錄，防止過(guò)早計(jì)數(shù)，漏掉生長(zhǎng)緩慢的菌落；也要防止過(guò)晚計(jì)數(shù)，避免一些容易蔓延生長(zhǎng)的菌落過(guò)度生長(zhǎng)，相互覆蓋，影響計(jì)數(shù)結(jié)果。

綜上所述，微生物檢測(cè)中的每個(gè)環(huán)節(jié)都關(guān)系到最終的檢測(cè)結(jié)果，能力驗(yàn)證是監(jiān)控各個(gè)實(shí)驗(yàn)環(huán)節(jié)的有效手段，它能充分暴露實(shí)驗(yàn)室在檢測(cè)環(huán)節(jié)中存在的問(wèn)題，指導(dǎo)實(shí)驗(yàn)室建立相應(yīng)的預(yù)防措施和糾正措施，維持實(shí)驗(yàn)室的質(zhì)量體系有效運(yùn)行。尤其是微生物能力驗(yàn)證，因其多是陽(yáng)性樣品，整個(gè)試驗(yàn)操作不但能夠鍛煉和提升檢驗(yàn)人員的技術(shù)能力和水平，而且能夠體現(xiàn)微生物實(shí)驗(yàn)室的檢測(cè)能力，是有效實(shí)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制的重要手段。